3. KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN
3.4.2.Khảo sát ảnh hưởng của natri acetate lên sự sinh tổng hợp stilbene
Theo nghiên cứu của Media-Bolivar và cộng sự (2009), khi bổ sung natri acetate 10,2 mM vào môi trường nuôi cấy của rễ tơ đậu phộng thì natri acetate đã cảm ứng sự tiết resveratrol vào môi trường nuôi cấy và hàm lượng resveratrol ngoại bào đã tăng 60 lần [38]. Do đó, thí nghiệm này được thiết lập với các nồng độ natri acetate:0, 5, 10, 20 mM; sau 2 ngày bổ sung vào môi trường nuôi cấy, hàm lượng stilbene trong sinh khối tếbào và môi trường nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của natri acetate lên sự sinh tổng hợp stilbene
Natri acetate đã tác đ ộng tăng sinh tổng hợp stilbene và tăng khả năng tiết stilbene vào môi trường. Khi bổsung natri acetate 10 mM, hàm lượng stilbene trong nội bào tăng 3,9 lần so với đối chứng và hàm lượng stilbene ngoại bào tăng 5,27 lần so với đối chứng. Bên cạnh đó, sau 2 ngày nuôi cấy có bổ sung natri acetate, ta thấy có sựthay đổi màu sắc dung dịch môi trường và rễtơ. Khi bổ sung natri acetate 10 mM thì rễtơ có màu vàng đậm hơn hẳn so với rễtơ được bổ sung natri aeate 5 mM, 20 mM. Natri acetate (mM) Hàm lượng stilbene nội bào (mg/g) Hàm lượng stilbene ngoại bào (mg/ml) 0 0,3147 ± 0,0035a 0,0009 ± 0,0001 5 a’ 0,6293 ± 0,0161b 0,0023 ± 0,0002 10 b’ 1,2261 ± 0,1322d 0,0048 ± 0,0002 20 c’ 0,9052 ± 0,0945c 0,0019 ± 0,0001b’
Kết quả - Biện luận
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh acetate như một tác nhân cảm ứng hiệu quả của sản xuất hợp chất thứ cấp trong thực vật và rễ phát triển trong điều kiện thủy canh (Pitta-Alvarez và Giulietti (1999); Poulev và cộng sự (2003)). Theo Media- Bolivar thì natri acetate rõ ràng đã kích thích, s ản xuất resveratrol và những dẫn xuất của resveratrol trong nuôi cấy rễ tơ đậu phộng [38]. Tuy nhiên, tác nhân cảm ứng phi sinh học này cũng đóng vai trò như một tiền chất quan trọng với hệ thống sinh tổng hợp, nó đóng góp nói chung vào quá trình s ản xuất hợp chất thứ cấp. Nghiên cứu của Pitta-Alvarez và Giulietti (1999) về sản xuất tropane alkaloid từ rễ đã chuyển gen của Brugmansia candida đã làm rõ vai trò tiền chầt của acetate. Bổ sung acetate đã kích thích sự tiết alkaloid vào môi trường nuôi cấy, acetate cũng được đề nghị như một tiền chất và đi vào con đường tổng hợp tropane alkaloid thông qua acetoacetyl-CoA. Trong khi đó, malonyl-CoA, tiền chất chính của quá trình sinh tổng hợp stilbene và malonyl-CoA lại sử dụng acetate như là tiền chất trong quá trình sinh tổng hợp nó. Do đó, acetate cũng có th ể đóng vai trò như là tiền chất khi bổsung vào môi trường nuôi cấy. Sựthay đổi tính thấm của màng và pH khi bổsung acetate được đề nghị đã cảm ứng sự phóng thích alkaloid vào môi trường [38]. Nghiên cứu của Cheng và cộng sự (2008) cho thấy khi rễ tơ Ajuga turkestanica được cảm ứng với natri acetate 150 mg/l thì hàm lư ợng phytoecdysteroid tăng lên gần 2 lần [14].
Kết quả - Biện luận
Hình 3.13. Màu sắc của rễtơ khi bổ sung natri acetate nồng độ khác nhau 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhôm clorua lên sự sinh tổng hợp stilbene
Sau 2 ngày bổ sung nhôm clorua ở các nồng độ khác nhau, hàm lượng stilbene trong nội bào và ngoại bào được thể hiện trong bảng và biểu đồ. Kết quả cho thấy, hàm lượng stilbene nội bào tăng từ 2,65 đến 4,63 lần so với đối chứng và hàm lượng stilbene ngoại bào tăng từ 1,34 đến 1,67 lần so với đối chứng. Trong đó, khi bổsung nhôm clorua tăng từ 0,3 mM đến 0,9 mM cho thấy hàm lượng stilbene tăng dần và đạt mức tăng mạnh nhất khi nhôm cloura 0,9 mM. Và khi bổ sung nhôm clorua 1,2 mM vào môi trường nuôi cấy dẫn đến sự giảm hàm lượng stilbene nội bào lẫn ngoại bào.
A B
C
A. Natri acetate 5 mM B. Natri acetate 10 mM C. Natri acetate 20 mM
Kết quả - Biện luận
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhôm clorua lên sự sinh tổng hợp resveratrol
Nhiều nghiên cứu gần đây cho rằng những chất cảm ứng phi sinh học như kim loại nặng, muối của kim loại nặng có thể thay đổi khả năng sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học do tác động lên cơ chế biến dưỡng thứ cấp. Một số muối của kim loại nặng thường được sử dụng như là chất cảm ứng phi sinh học trong nuôi cấy huyền phù tế bào và nuôi cấy rễtơ là đồng sulfate, bạc nitrate, nhôm clorua.
Năm 1998, Hamel và cộng sựđã đề nghị nhôm có thể hoạt động như một tác nhân cảm ứng vì nó không chỉ hoạt động thông qua tương tác với con đường tín hiệu Ca2+ mà còn kích thích tạo ra một số phân tửđể kích hoạt con đường truyền tín hiệu khác, từ đó cảm ứng tăng tổng hợp hợp chất thứ cấp. Nghiên cứu của Spollansky và công sự (2000) khi khảo sát ảnh hưởng của nhôm clorua lên sự tích lũy trophane alkaloid trong nuôi cấy rễtơ Brugmansia candida cho thấy hàm lượng scopolamine và hyoscynamine trong rễtăng lần lượt 43%, 83% và khảnăng tiết vào môi trường tăng 150% sau khi bổ sung 48 giờ. Nhóm nghiên cứu của Adrian (2000) đã chứng minh nhôm clorua như là tác nhân cảm ứng tăng sự tổng hợp và tích lũy resveratrol trong cây Vitis rupestris và Vitis vinifera [8]
Nhôm clorua (mM) . Hàm lượng stilbene nội bào (mg/g) Hàm lượng stilbene ngoại bào (mg/ml) 0 0,3147 ± 0,0035a 0,0009 ± 0,00006 0,3 a’ 1,2085 ± 0,0081c 0,0013 ± 0,00001 0,6 b’ 1,3604 ± 0,0231d 0,0014 ± 0,00001 0,9 c’ 1,4578 ± 0,0316e 0,0015 ± 0,00002 1,2 c’ 0,8326 ± 0,0033b 0,0012 ± 0,00001b’
Kết quả - Biện luận
3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự sinh tổng hợp stilbene
Sau 2 ngày bổ sung vi khuẩn với mật độ tế bào khác nhau, hàm lượng stilbene trong nội bào và ngoại bào được trình bày trong bảng và biểu đồ. Vi khuẩn kích thích sự sinh tổng hợp stilbene và sự tiết stilbene vào môi trường nuôi cấy. Về mặt thống kê cho thấy không có sự khác biệt khi thay đổi mật độ tế bào vi khuẩn bổ sung. Từ đó có thể kết luận mật độ vi khuẩn không ảnh hưởng nhiều đến lượng stilbene được tổng hợp.
Thực vật tổng hợp hợp chất thứ cấp; hợp chất này đóng vai trò quan tr ọng trong sự tồn tại và bảo vệ thực vật trước tác động của môi trường, điều kiện sống tự nhiên. Hợp chất thứ cấp đóng vai trò quan trọng trong tương tác vi sinh – thực vật, cụ thể trong tính kháng thực vật chống lại sự tấn công của tác nhân gây bệnh. Khi sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong thực vật là đáp ứng của tính kháng thực vật với tác nhân bệnh, những đoạn vách tế bào của nấm mốc và vi khuẩn có thểđược dung như tác nhân cảm ứng để cảm ứng và kích thích sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy mô thực vật (Rao và Ravishankar, 2002; Zhao và cộng sự, 2005) [58]. Chẳng hạn như, Udomsuk và cộng sự (2010) khi khảo sát cao nấm men, chitosan, methyl jasmonate, salicylic acid, dịch chiết vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes lên sự sinh tổng hợp isoflavonoid thì cho thấy cao nấm men và dịch chiết vi khuẩn là tác nhân cảm ứng tốt kích thích sự sinh tổng hợp isoflavonoid trong rễ tơ cây
Peuraria candollei [54]. Các nghiên cứu trên thế giới về việc sử dụng các tác nhân cảm ứng sinh học có nguồn gốc vi sinh vât, các tác giảđa phần sử dụng vi sinh vật ở dạng chết. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của Wu và cộng sự (2007) cho thấy rằng dịch chiết vi khuẩn và dịch nổi môi trường nuôi cấy đã vô trùng kích thích sản xuất tanshinone thấp hơn sử dụng vi khuẩn sống. Từ những kết quả này, Wu đề nghị rằng sựđồng nuôi cấy vi khuẩn và rễ có thể trở thành một chiến lược hiệu quả cho việc tăng tổng hợp hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy mô. [58]
Kết quả - Biện luận
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn lên sự sinh tổng hợp stilbene