Kiểu hình rễtơ là sự biểu hiện của việc tái tổ hợp các gen từ T-DNA (chẳng hạn rol và aux) của Ri plasmid vào trong tế bào thực vật. Do đó, kiểm tra chuyển gen thành công có 2 cách: phương pháp trực tiếp phát hiện thông qua T-DNA hoặc gián tiếp phát hiện thông qua opine. Phương pháp trực tiếp thường được sử dụng hơn vì trong một số trường hợp opine tại ra không bền. Để phát hiện T-DNA, phương pháp PCR hay Northern Blot thường được sử dụng [61]. Trong đó, phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi của các gen rolA, rolB, rolC, rolD và aux1 để kiểm tra sự chuyển gen vào tế bào.[49]
Thí nghiệm được tiến hành gồm các bước: tách chiết Ri – plasmid của
Agrobacterium rhizogenes sử dụng làm chứng dương; tách chiết DNA bộ gen của rễcây đậu phộng in vitro để làm mẫu đối chứng; tách chiết DNA bộ gen của rễ tơ được cảm ứng từ mẫu lá, trụ hạ diệp, trụthượng diệp, tử diệp, cuống lá để kiểm tra; thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của gen rolB, rol C; điện di xem sản phẩm PCR.
DNA bộ gen đâu phộng được tách chiết theo phương pháp CTAB của Stewart và Via (1993) [
Tách DNA bộ gen thực vật
52] đã được thay đổi một sốđiểm nhằm kiểm tra sự chuyển gen tự nhiên từA. rhizogenes vào thực vật.
Vật liệu – Phương pháp
Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chiết DNA bộ gen thực vật
Vi khuẩn A. rhizogenes phát triển đến giữa pha tăng trưởng (OD = 0,5 - 1) được thu nhận sinh khối để tách plasmid theo quy trình của Curier và Nester (1976) [
Tách plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
19] và Shoja [49]
Cân 0,1 g mẫu
Cho vào cối nghiền với nitơ lỏng CTAB (1 ml)
Ủ 1 giờ, 65oC, lắc liên tục trong khi ủ Ly tâm 13000 rpm /5 phút
Dịch nổi
Tủa protein với phenol:chloroform (1:1) 500µl Ly tâm 13000 rpm/5 phút
Thu pha trên
1 ml EtOH 100% lạnh, ủ 0oC qua đêm Ly tâm 13000 rpm/ 20 phút 4oC Tủa DNA Ethanol 80o lạnh Ly tâm 13000 rpm/ 3 phút Bỏ dịch, phơi khô ở 37oC 20 µl TE DNA bộ gen, bảo quản ở -20oC
Vật liệu – Phương pháp
Sơ đồ 2.3. Quy trình tách chiết DNA plasmid Chứng minh sự hiện diện của gen chuyển bằng PCR:
10-15 ml dịch khuẩn A. rhizogenes
Ly tâm 6000 rpm/15 phút Thu tủa vào eppendolf 1,5 ml Sinh khối giữ trong gel lạnh
100 µl dung dịch I. Votex kĩ 100 µl TE 0,1X, để lạnh 200 µl dung dịch II, đảo nhẹ 600 µl phenol:chloroform (1:1), đảo nhẹ 100 µl dung dịch III đảo nhẹ Ly tâm 13000 rpm/5 phút, thu dịch nổi Dịch nổi 200 µl phenol:chlorofrom (1:1), đảo nhẹ Ly tâm 13000 rpm /10 phút 4oC, thu pha trên Dịch biến tính
1 ml EtOH 100% lạnh, ủ -20oC qua đêm Ly tâm 13000 rpm/20 phút -4oC
Tủa DNA
Phơi mẫu, hòa tan tủa vào 20 µl TE 0,1X Thêm 1 µl Rnase 1 mg/ml, ủ 37oC trong 1 giờ DNA plasmid
Vật liệu – Phương pháp
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần phản ứng:
Thành phần Thể tích phản ứng (µl)
dNTP 2 mM (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mồi xuôi, 10 pmol/µl Mồi ngược, 10 pmol/µl DEPC-H2 1,5 1 1 17,75 1,5 1,25 1 25 O
Dream Taq buffer
Dream Taq DNA polymerase, 1 U/µl DNA khuôn
Tổng thể tích phản ứng
Lần lượt đặt phản ứng cho các cặp mồi của gen rolB và rolC.
Bảng 2.5: Chương trình khuếch đại cặp mồi RolBF-RolBR, rolCF-rolCR
Các bước khuếch đại Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Số chu kỳ
Biến tính ban đầu 95,0 5:00 Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94,0 54,0 72,0 0:30 0:30 1:00 35 Kết thúc 72,0 4,0 5:00 ∞
Vật liệu – Phương pháp
Sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được phân tích và kiểm tra kích thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Gel sau đó sẽ được ngâm với dung dịch ethidium bromide và xem dưới đèn UV. Kích thước các đoạn được khuếch đại được xác định thông qua thang DNA.