Màu xanh
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (hình 2.5 ) được đặc trưng bởi gốc tự do ổn định. Gốc tự do này bền do được an định bởi các hiệu ứng điện tử và hiệu ứng lập thể nội phân tử tạo ra, do đó các phân tử này không thể kết hợp tạo thành nhị phân tử. DPPH có màu tím đặc trưng. Đỉnh hấp thu của dung dịch DPPH trong dung môi methanol là 515 - 517 nm. Khi DPPH phản ứng với hợp chất có thể cho phân tử hydrogen, thì màu tím đ ặc trưng của DPPH giảm xuống [39]. Vì vậy, phương pháp này dùng để sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất thu nhận được trong nhiều nghiên cứu.
Vật liệu – Phương pháp
Hình 2.6. Cấu trúc DPPH mất gốc tự do (có màu vàng) 2.2.6. Định lượng hợp chất nhóm stilbene
2.2.6.1. Bán định lượng bằng phương pháp phổ tử ngoại
Nguyên tắc: Mỗi hợp chất có màu đều có phổ đồ đặc trưng ở độ dài sóng hấp thu chuyên biệt, chẳng hạn như trans – resveratrol được hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 308 nm [10,43] , trans – pterostilbene có phổđồ đặc trưng ở độ dài sóng hấp thu 308 nm [43]. Do đó, khi đo mật độ quang ở bước sóng đặc trưng cho chất chuẩn có nồng độ khác nhau sẽ có một đường chuẩn tuyến tính của mật độ quang với nồng độ chất chuẩn đó. Từ đó, với bất kỳ hổn hợp nào có chứa hợp chất này, chỉ cần xác định mật độ quang của nó ở bước sóng hấp thu đặc trưng đó, nồng độ hợp chất có trong dung dịch đem đo sẽ được xác định. Hàm lượng stilbene được suy ra dựa vào đường cong phổ hấp thu ở bước sóng 308 nm của resveratrol chuẩn. Resveratrol được xem là đại diện của nhóm stilbene trong rễcây đậu phộng [13].
Các bước tiến hành:
Xây dựng đường chuẩn:
Resveratrol được cân chính xác và được hòa tan trong dung môi methanol để đạt nồng độ 1 mg/ml, sau đó được pha loãng thành các dung dịch có nồng độ từ 0,005 mg/ml đến 0,030 mg/ml. Đo mật độ quang của các dung dịch được pha ở bước sóng 308 nm; trong đó, dung môi methanol có giá trị ABS = 0.
Vật liệu – Phương pháp
Bảng 2.3. Độ hấp thu ở 308 nm của các nồng độ resveratrol khác nhau.
Nồng độ resveratrol (mg/ml) 0,000 0,005 0,010 00015 0,020 0,025 0,030 OD 0,000 ±0,000 308 0,4757 ±0,0016 0,9957 ±0,060 1,5340 ±0,0025 2,3090 ±0,062 2,8979 ±0,073 3,2561 ±0,021
Biểu đồ 2.1. Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa resveratrol và
độ hấp thụ
Định lượng hợp chất có trong dịch được tách chiết: Pha loãng dung dịch có chứa hợp chất cần định lượng cho đến khi mật độ quang của chúng nằm trong khoảng giới hạn các mật độ quang có trong đường chuẩn. Dựa vào phương trình đường chuẩn y = 113,7x – 0,068 với y là giá trị OD và x là nồng độ resveratrol (mg/ml), suy ra nồng độ hợp chất tương ứng trong dung dịch đem đo, từ đó quy về hàm lượng hợp chất có trong hỗn hợp ban đầu.
y = 113,7x - 0,068 R² = 0,994 -.500 .000 .500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 O D 308n m Nồng độ resveratrol (mg/ml)
Vật liệu – Phương pháp
2.2.6.2. Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Trong luận vănnày, phương pháp HPLC-UV được gửi phân tích tại phòng thí nghiệm phân tích trung tâm thuộc Trường ĐH Khoa học tự nhiên, TP. HCM.
2.2.7. Phương pháp xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với số mẫu trên mỗi nghiệm thức từ 30-35 mẫu. Số liệu thu được từ kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, SPSS 16.0 phân nhóm các giá trị bằng phương pháp Duncan và so sánh các giá trị bằng phương pháp Dunnett. Kết quảđược trình bày ở dạng: trung bình ± sai số (Mean ± SE).
2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Phương pháp nghiên cứu chung gồm có khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tơ. Sau đó kiểm tra sự chuyển gen tạo rễ tơ của vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes sang bộ gen của thực vật bằng phương pháp PCR. Tiếp theo là sàng lọc loại cao chứa nhóm stilbene và có hoạt tính kháng oxi hóa. Cuối cùng, khảo sát các yếu tố góp phần tăng sinh hàm lượng các hợp chất thuộc nhóm stilbene.
2.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tơ
2.3.1.1. Khảo sát loại mô thích hợp để tạo rễ tơ
Hầu hết các mô và cơ quan thực vật gồm trục hạ diệp, lá, trục thượng diệp, cuống lá được xâm nhiễm đều có thể được chuyển gen bởi A. rhizogenes dẫn đến cảm ứng hình thành rễ tơ. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen thì phụ thuộc vào sự tương tác giữa vi khuẩn A. rhizogenes với từng loại mô, từng loại tế bào [55]. Vì vậy, thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định nguồn nguyên liệu đầu phù hợp để cảm ứng tạo rễ tơ. Lá, cuống lá, trụ thượng diệp, tử diệp, trụ hạ diệp của cây 20 ngày tuổi được cắt và tạo vết thương được sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu để khảo sát sự tạo rễtơ sau khi xâm nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
Vật liệu – Phương pháp
Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn là 15 phút và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ [28,32].
Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ và số rễ tơ tạo ra trên mỗi mẫu sau 14 - 21 ngày nuôi cấy. Mẫu đối chứng là các khúc cắt được nuôi cấy không được gây nhiễm với vi khuẩn, cũng được nuôi cấy trên trên các môi trường tương tự. Số mẫu thực hiện trên cảm ứng ở mỗi loại bộ phận là 30 – 45 mẫu.
2.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ứng tạo rễ tơ
Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gene từ
Agrobacterium vào tế bào thực vật là thời gian đồng nuôi cấy [55]. Thí nghiệm được tiến hành nhằm tìm thời gian đồng nuôi cấy cho hiệu suất chuyển gen tạo rễtơ cao nhất. Sau khi tiến hành khảo sát loại mô, ta chọn được nguồn vật liệu đầu phù hợp cho sự cảm ứng tạo rễ tơ ở đậu phộng. Mẫu sau khi được nhúng trong dịch khuẩn 15 phút, được chuyển sang giấy thấm vô trùng để giảm độ ẩm trên bề mặt mẫu và sau đó chuyển lên môi trường MS không có chất điều hòa sinh trư ởng để đồng nuôi cấy. Thời gian đồng nuôi cấy được bố trí lần lượt: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ. Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng ra rễtơ. Số mẫu trên mỗi nghiệm thức là 45 mẫu. Lặp lại 3 lần.
2.3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong dịch khuẩn đến
việc hình thành rễ tơ
Trong các nghiên cứu về cảm ứng tạo rễ tơ, mỗi tác giả sử dụng một thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn đã hoạt hóa. Vì vậy, thí nghiệm này được tiến hành nhằm tìm thời gian nhúng mẫu trong dịch khuẩn thích hợp tạo rễtơ nhiều nhất. Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn lần lượt: 5, 10, 15, 20, 25, 30 phút. Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễtơ.
Vật liệu – Phương pháp
2.3.2. Chứng minh sự chuyển gen rolB, rolC thành công và khảo sát khả năng sinh trưởng rễ tơ trong môi trường lỏng lắc năng sinh trưởng rễ tơ trong môi trường lỏng lắc
2.3.2.1. Kiểm tra sự chuyển gen
Kiểu hình rễtơ là sự biểu hiện của việc tái tổ hợp các gen từ T-DNA (chẳng hạn rol và aux) của Ri plasmid vào trong tế bào thực vật. Do đó, kiểm tra chuyển gen thành công có 2 cách: phương pháp trực tiếp phát hiện thông qua T-DNA hoặc gián tiếp phát hiện thông qua opine. Phương pháp trực tiếp thường được sử dụng hơn vì trong một số trường hợp opine tại ra không bền. Để phát hiện T-DNA, phương pháp PCR hay Northern Blot thường được sử dụng [61]. Trong đó, phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi của các gen rolA, rolB, rolC, rolD và aux1 để kiểm tra sự chuyển gen vào tế bào.[49]
Thí nghiệm được tiến hành gồm các bước: tách chiết Ri – plasmid của
Agrobacterium rhizogenes sử dụng làm chứng dương; tách chiết DNA bộ gen của rễcây đậu phộng in vitro để làm mẫu đối chứng; tách chiết DNA bộ gen của rễ tơ được cảm ứng từ mẫu lá, trụ hạ diệp, trụthượng diệp, tử diệp, cuống lá để kiểm tra; thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của gen rolB, rol C; điện di xem sản phẩm PCR.
DNA bộ gen đâu phộng được tách chiết theo phương pháp CTAB của Stewart và Via (1993) [
Tách DNA bộ gen thực vật
52] đã được thay đổi một sốđiểm nhằm kiểm tra sự chuyển gen tự nhiên từA. rhizogenes vào thực vật.
Vật liệu – Phương pháp
Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chiết DNA bộ gen thực vật
Vi khuẩn A. rhizogenes phát triển đến giữa pha tăng trưởng (OD = 0,5 - 1) được thu nhận sinh khối để tách plasmid theo quy trình của Curier và Nester (1976) [
Tách plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
19] và Shoja [49]
Cân 0,1 g mẫu
Cho vào cối nghiền với nitơ lỏng CTAB (1 ml)
Ủ 1 giờ, 65oC, lắc liên tục trong khi ủ Ly tâm 13000 rpm /5 phút
Dịch nổi
Tủa protein với phenol:chloroform (1:1) 500µl Ly tâm 13000 rpm/5 phút
Thu pha trên
1 ml EtOH 100% lạnh, ủ 0oC qua đêm Ly tâm 13000 rpm/ 20 phút 4oC Tủa DNA Ethanol 80o lạnh Ly tâm 13000 rpm/ 3 phút Bỏ dịch, phơi khô ở 37oC 20 µl TE DNA bộ gen, bảo quản ở -20oC
Vật liệu – Phương pháp
Sơ đồ 2.3. Quy trình tách chiết DNA plasmid Chứng minh sự hiện diện của gen chuyển bằng PCR:
10-15 ml dịch khuẩn A. rhizogenes
Ly tâm 6000 rpm/15 phút Thu tủa vào eppendolf 1,5 ml Sinh khối giữ trong gel lạnh
100 µl dung dịch I. Votex kĩ 100 µl TE 0,1X, để lạnh 200 µl dung dịch II, đảo nhẹ 600 µl phenol:chloroform (1:1), đảo nhẹ 100 µl dung dịch III đảo nhẹ Ly tâm 13000 rpm/5 phút, thu dịch nổi Dịch nổi 200 µl phenol:chlorofrom (1:1), đảo nhẹ Ly tâm 13000 rpm /10 phút 4oC, thu pha trên Dịch biến tính
1 ml EtOH 100% lạnh, ủ -20oC qua đêm Ly tâm 13000 rpm/20 phút -4oC
Tủa DNA
Phơi mẫu, hòa tan tủa vào 20 µl TE 0,1X Thêm 1 µl Rnase 1 mg/ml, ủ 37oC trong 1 giờ DNA plasmid
Vật liệu – Phương pháp
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần phản ứng:
Thành phần Thể tích phản ứng (µl)
dNTP 2 mM
Mồi xuôi, 10 pmol/µl Mồi ngược, 10 pmol/µl DEPC-H2 1,5 1 1 17,75 1,5 1,25 1 25 O
Dream Taq buffer
Dream Taq DNA polymerase, 1 U/µl DNA khuôn
Tổng thể tích phản ứng
Lần lượt đặt phản ứng cho các cặp mồi của gen rolB và rolC.
Bảng 2.5: Chương trình khuếch đại cặp mồi RolBF-RolBR, rolCF-rolCR
Các bước khuếch đại Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Số chu kỳ
Biến tính ban đầu 95,0 5:00 Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94,0 54,0 72,0 0:30 0:30 1:00 35 Kết thúc 72,0 4,0 5:00 ∞
Vật liệu – Phương pháp
Sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được phân tích và kiểm tra kích thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Gel sau đó sẽ được ngâm với dung dịch ethidium bromide và xem dưới đèn UV. Kích thước các đoạn được khuếch đại được xác định thông qua thang DNA.
2.3.2.2. Xây dựng đường cong tăng trưởng của rễ tơ trong điều kiện nuôi cấy
lỏng lắc
Rễ tơ được tạo ra từ mẫu lá, được cắt và chuyển sang nuôi cấy trên môi trường MS lỏng có bổ sung saccharose 30 g/l, không có chất điều hòa sinh trư ởng thực vật, lắc với vận tốc 100 – 130 vòng/phút, đ ể kiểm tra sự tăng sinh theo thời gian nuôi cấy. Đo sự tăng trưởng của rễ tơ trong 30 ngày, 3 ngày đo một lần. Chỉ tiêu theo dõi là trọng lượng tươi rễtơ. Trọng lượng tươi ban đầu khoảng 0,3 – 0,4 g.
2.3.3. Chứng minh sự hiện diện của nhóm stilbene, đánh giá hoạt tính
kháng oxi hóa của các loại cao từ rễ tơ cây đậu phộng
2.3.3.1. Chứng minh sự hiện diện của hợp chất nhóm stilbene trong các loại
cao sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng
Sắc ký bản mỏng là phương pháp định tính để xác định các chất trong cao có chứa chất hợp chất đang quan tâm [5]. Thí nghiệm này tiến hành để xác định xem cao nào chứa hợp chất nhóm stilbene.
Tiến hành: Chấm dung dịch methanol có hòa tan các loại cao (cao hexan, cao chloroform, cao ethyl acetate, cao methanol) lên bản silica gel, sấy khô. Hệ dung môi giải ly là chloroform: ethyl acetate: formic acid (5:4:1) [45] nhưng do điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi sử dụng acetic acid thay thế cho formic acid và chất chuẩn là resveratrol. Kết quả ghi nhận được khi quan sát dưới đèn UV (254 nm).
2.3.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các loại caoPhương pháp Yen và Duh: Phương pháp Yen và Duh: Phương pháp Yen và Duh:
Vật liệu – Phương pháp
Hút lần lượt 1 ml dung dịch Vitamin E 0,5 mg/ml, chất thử nghiệm (cao methanol, cao ethyl acetate, cao chloroform, cao hexane) nồng độ 0,5 mg/ml, dung môi tách chất thử nghiệm (chứng âm) vào từng ống nghiệm riêng biệt.
Hút 2,5 ml dung dịch đệm phosphate 0,2 M pH = 6,6 cho vào từng ống nghiệm trên, lắc đều.
Hút 2,5 ml dung dịch K3(Fe(CN)6) 1% cho vào từng ống nghiệm trên. Hổn hợp phản ứng được đặt trong bểổn nhiệt ở 50oC, trong 20 phút.
Sau khi làm nguội, hút 2,5 ml trichloroacetic acid 1% cho vào từng ống nghiệm trên.
Ly tâm các dung dịch trên ởđiều kiện 7000 vòng trong 2 phút, thu dịch nổi Hút 1 ml dịch nổi vào từng ống nghiệm sạch riêng biệt, thêm 2 ml nước cất, 0,5 ml dung dịch FeCl3 1%.
Lắc đều hỗn hợp trong vòng 5 phút. Ghi nhận kết quả độ hấp thu ở bước sóng 700 nm.
Phương pháp DPPH:
Phương pháp tiến hành:
Cân mỗi loại cao và resveratrol chuẩn, hòa tan trong dung môi methanol để đạt nồng độ 1 mg/ml.
Pha loãng cao và resveratrol bằng dung môi methanol tuyệt đối ở các nồng độ liên tiếp.
Hút 0,5 ml mỗi cao và resveratrol đã đư ợc pha loãng vào mỗi ống nghiệm riêng lẽ. Thêm lần lượt vào mỗi ống nghiệm 3 ml methanol tuyệt đối.
Thêm vào 0,5 ml dung dịch DPPH được pha trong methanol tuyệt đối ở nồng độ 0,6 mM.
Vật liệu – Phương pháp
Lắc đều hỗn hợp, ủ tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Sau đó, đem các dung dịch đo độ hấp thu ởbước sóng 516 nm.
Song song với tiến trình như trên, th ực hiện với một ống nghiệm khác gồm 3,5 ml methanol tuyệt đối được bổ sung 0,5 ml DPPH 0,6 mM, được sử dùng làm chứng âm.
Khả năng làm mất màu DPPH của mỗi mẫu được tính theo công thức sau[12, 27]:
% mất màu của DPPH (%DC) = [(AB – AC)/AB] x 100
Trong đó: Mức độ làm mất màu DPPH ở tại nồng độ C nhất định tương ứng với khảnăng bắt gốc tự do của chất đó tại nồng độ C (khác không). Giá trị nồng độ ức chế 50% (IC50) được tính thông quá việc nội suy thông qua phương trình đư ờng thẳng.
AB: giá trị OD của chứng âm ([chất thử nghiệm] = không) AC: giá trị OD tại một nồng độ C nhất định (khác không) Bố trí thí nghiệm
Mỗi loại cao và mỗi hợp chất có khảnăng kháng oxi hóa khác nhau. Vì vậy, tùy thuộc vào khả năng kháng oxi hóa của từng loại cao, thí nghiệm khảo sát dãy các nồng độ cao khác nhau để xác định giá trị IC50 của mỗi loại cao. Thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu so sánh hoạt tính kháng oxi hóa giữa các loại cao và resveratrol chuẩn.
Vật liệu – Phương pháp
2.3.4. Thử nghiệm tăng sinh hàm lượng stilbene trong nuôi cấy rễ tơ bằng phương pháp bổ sung tiền chất và chất cảm ứng phương pháp bổ sung tiền chất và chất cảm ứng
2.3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung phenylalanine lên sự sinh tổng
hợp stilbene trong rễ tơ cây đậu phộng