Nghiên cứu chế phẩm cao đảng sâm việt nam có hoạt tính kháng oxy hóa (codonopsis javanica (blume) hook f )

Kết quả: Sau thời gian thực hiện, đề tài đã thu được các kết quả sau: Khảo sátmột số tính chất của dược liệu Đảng sâm về cảm quan, độ ẩm, độ tro toàn phần và trokhông tan trong acid, đặc

TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM CAO ĐẢNG SÂM VIỆT NAM CÓ

HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA.

(Codonopsis javanica (Blume) Hook f.)

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm và đồ uống

Mã số chuyên ngành:

LUẬN VĂN THẠC SỸ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2014

Chủtịchhộiđồng Trưởngbộmôn Trưởngkhoa

Cán bộ hướng dẫn khoa học :PGS.TS.Trần Công Luận

Cán bộ chấm nhận xétl : PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ

Cán bộ chấm nhận xé t2 : PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại hội đồng trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-TPHCM, ngày 21 tháng 07 năm 2014

Thành phần Hội đồng đánh giá luận vă nthạc sĩ gồm :

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm và đồ uống Mã số : 605402

I TÊN ĐỀ TÀI:

“ Nghiên cứu chế phẩm cao Đảng sâm Việt Nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.)

có hoạt tính kháng oxy hóa ”

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Khảo sát sơ bộ hóa thực vật của rễ Đảng sâm

- Chiết nguyên liệu với 3 nồng độ cồn: 96%, 72%, 48%

- Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu và cao: Độ ẩm, độ tro, định tính, định lượng

- Khảo sát hoạt tính sinh học của Đảng sâm: Đánh giá hoạt tính đánh bắt gốc tự do của cao Đảng sâm

- Khảo sát thị hiếu người tiêu dùng đối với chế phẩm cao Đảng sâm

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02-2014

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 07-2014

IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS TRẦN CÔNG LUẬN.

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

Con xin khắc ghi công ơn ba mẹ và những người thân đã nuôi dưỡng và giáo dục con nên người

Em xin gửi lòng biết ơn đến :

Ban giám hiệu Trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh và các thầy cô

đã tận tình dạy bảo em trong những năm học qua

Thầy Trưởng bộ môn Công nghệ chế biến thực phẩm, thày, cô Chủ nhiệm vàcác thầy cô trong bộ môn đã luôn yêu thương, giúp đỡ, chỉ bảo em ân cần, tận tìnhtrong thời gian em học tập, giúp đỡ em trong những lúc khó khăn nhất

Ban giám đốc Trưng Tâm Sâm và dược liệu Tp.Hồ Chí Minh đã hỗ trợ và tạođiều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài

Em xin chân thành biết ơn tới thầy PGS.TS Trần Công Luận, cô Ths DươngThị Mộng Ngọc, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dành nhiều thời gian và công sức đểtruyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tạo mọi điều kiện tốt cho em hoànthành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn anh Vinh,chị Thảo, Đan đã tạo điều kiện cho quá trìnhthực hiện đề tài được thuận lợi cũng như những ý kiến quý báu mà anh chị đã dànhcho em

Cảm ơn các bạn cùng lớp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận án

Xin chân thành cảm ơn các bạn làm việc tại phòng Hóa - Chế phẩm, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp Hồ Chí Minh đã luôn giúp đỡ và động viên khi tôi gặp khó khăn

Từ xưa Đảng sâm đã dược dân gian và các thầy thuốc sử dụng nhiều trongcác bài thuốc phòng và chữa bệnh Theo Dược điển Việt Nam rv, vị thuốc Đảng sâm

là rễ phơi hay sấy khô của cây Đảng sâm Codonopsỉs javanica (Blume) Hook.f họ

Hoa chuông (Campanulaceae) Hiện nay, những nghiên cứu về dược liệu này vẫn cònrất hạn chế Với mong muốn góp phần tìm hiểu rõ hơn về hoạt tính sinh học của dượcliệu Đảng sâm chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế phẩm cao Đảng sâm

(Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.) có hoạt tính chống oxy hóa.

Phương pháp nghiên cứu: Chiết xuất bằng phương pháp bằng kĩ thuật chiếtngấm kiệt với 3 nồng độ cồn 96%,72% và 48%.Tiêu chuẩn hóa dược liệu theo Dượcđiển Việt Nam và tiêu chuẩn hóa cao: Độ ẩm,độ tro, định tính, định lượng Khảo sáthoạt tính đánh bắt gốc tự do DPPH, để chứng minh rằng cao chiết từ Đảng sâm cóhoạt tính chống oxy hóa Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng đối với việc sử dụng cao

Kết quả: Sau thời gian thực hiện, đề tài đã thu được các kết quả sau: Khảo sátmột số tính chất của dược liệu Đảng sâm về cảm quan, độ ẩm, độ tro toàn phần và trokhông tan trong acid, đặc điểm vi phẫu, soi bột; chiết xuất dược liệu với kỹ thuậtchiết ngấm kiệt ở 3 độ cồn thu cao tổng và khảo sát một số tình chất của cao để làmtiêu chuẩn cơ sở Khảo sát khả năng đánh bắt gốc tự do của cao tổng để chứng minhtrong cao có hoạt tính sinh học kháng oxy hóa Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng vàthống kê được sự ưa thích của họ đối với chế phẩm và giúp tạo nên bảng hướng dẫn

sử dụng cao

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

Codonopsis javanica has been widely used in traditional oriental medicine in

many recipes for the prevention and the treatment of diseases According to the

Pharmacopoeia Vietnamica edition IV, the herb Codonopsis javanica is described as dried roost of Codonopsis javanica ( Blume.) Hook., family of Campanulaceae With the desừe to contribute to reseacch biological activity of Codonopsis javanica (Blume.) Hook., we

have conducted the subject “Researching the total alcohol crude extract with

antioxidant property from Codonopsis javanica (Blume.) Hook ” collected at Ngoe

Linh Mountain in Komtum Province”

Methods: The herb was extracted with 96%, 72%, 48% alcohol bypercolation method The herb was standardized which based on PharmacopoeiaVietnamica edition rv and the total alcohol crude extract also is standardized to make

basic standard for Codonopsis javanica ( Blume.) Hook, with items : moisture, ash,

insoluble ash in acid, qualitative and quantitative, characteristics of botanicallymorphological Researching antioxidant property of the alcohol crude extract by usingDPPH method Evaluating the feeling of consumer for this alcohol crude extract tomake label on package

Results and discussion: Within the defined time for a thesis, the subject has

obtained the following results: Examination of some property of Codonopsis

javanica, on its moisture, total ash, insoluble ash in acid, botanically morphological

characteristics, microscopic, observation of herb power The total alcohol crude extract was available in DPPH radical scavenging activity and was less antioxidant than Vitamin c (control sample) The feeling of consumer was satisfied with method

of using the total alcohol crude extract with honey during the Anova table

Key words: Codonopsis javanica, antioxidant, feeling of consumer

CHƯƠNG I: MỞ ĐẤU

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 3

II 1 Giới thiệu về Đảng Sâm 3

II 1.1 Mô tả về thực vật 3

II 1.2 Phân bố, sinh thái 4

II 1.3 Bộ phận dùng 4

II 1.4 Thành phần hóa học 4

II 1.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 4

II 1.5.1 Nghiên cứu ngoài nước 4

II 1.5.2 Nghiên cứu trong nước 9

11.2 Hoạt tính đánh bắt gốc tự do 10

CHƯƠNG III: VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

III 1 Nguyên vật liệu và thiết bị 10

III 1.1 Nguyên liệu 10

III 1.2 Thiết bị và dụng cụ 10

111.2 Phương pháp nghiên cứu 11

111.2.1 Nghiên cứu thực vật học của dược liệu 11

III 2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái thực vật 11

111.2.1.2 K hảo sát đặc điểm vi phẫu của dược liệu 11

111.2.1.3 Khảo sát bột dược liệu 12

111.2.1.4 Xác định độ ẩm 13

111.2.1.5 Xác định độ tro 13

111.2.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của Đảng Sâm 15

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

111.2.3.1 Phương pháp chiết xuất nguyên liệu 18

111.2.3.2 Qui trình thực hiện chế phẩm 19

111.2.4 Khảo sát một so tính chất nguyên liệu và cao của Đảng Sâm 19

111.2.4.1 Phương pháp định tính 19

111.2.4.2 Phương pháp định lượng 20

111.2.5 Đánh giá hoạt tính đánh bắt gốc tự do của cao Đảng Sâm 21

III 3 Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng 23

CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

IV 1 Khảo sát một số tính chất của dược liệu 25

rv 1.1 Mô tả hình thái cây đảng sâm 25

IV 1.2 Đặc điểm vi phẫu 26

rv.1.2.1 Mô tả vi phẫu lá Đảng sâm 26

rv 1.2.2 Mô tả vi phẫu thân cây Đảng sâm 26

rv 1.2.3 Mô tả vi phẫu rễ cây Đảng sâm 27

IV 1.3 Soi bột 28

rv.2 Tiêu chuẩn hóa dược liệu rễ Đảng sâm Việt Nam theo Dược điển Việt Nam 32

rV.2.1.Độẩm 32

IV 2.2 Độtro .33

rv.2.2.1 Tro toàn phần 33

IV 2.2.2 Tro không tan trong acid .33

IV 2.3 Định tính 34

rv.2.3.1 Phản ứng hóa học 34

IV 2.3.2 Định tính bằng sắc ký .lớp mỏng .35

rv.3.1 Hiệu suất chiết của dược liệu 38

rv.3.2 Độ ẩm 38

IV 3.3.Độtro 38 IV 3.3.1 Tro toàn phần 38

IV.3.3.2 Tro không tan trong acid 39

IV.3.4 Định tính 39

IV.3.3.1 Phản ứng hóa học 39

IV 3.5 Định tính bằng SKLM 40

IV.3.6 Định lượng 40

IV.4 Ket quả hoạt tính đánh bắt gốc tự do của cao chiết dựa trên giá trị IC50 42

IV.5 Ket quả đánh giá thị hiếu người tiêu dùng 45

IV.5.1 Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng trong việc sử dụng lượng nước pha cao 45

IV.5.2 Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng đối với nhiệt độ nước dùng để pha cao 47

IV.5.3 Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng trong việc sử dụng lượng mật ong pha vào hỗn hợp cao và nước 48

IV.5.4 Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng đối với cách uống cao pha với nước và bổ sung thêm mật ong vào hỗn hợp cao và nước 49

CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1

DANH MỤC HÌNH ẢNH

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

Hình 4.2 Lá và thân cây Đảng sâm Việt Nam 25

Hình 4.3 Cấu tạo chỉ tiết vi học lá Đảng sâm Việt Nam 26

Hình 4.4 Vi phẫu thân cây Đảng sâm 27

Hình 4.5 Vi phẫu rễ Đảng sâm Việt Nam 28

Hình 4.6 Bột rễ Đảng sâm Việt Nam 29

Hình 4.7 Các cấu tử trong bột rễ Đảng sâm Việt Nam 29

Hình 4.8 Kết quả thực hiện phản ứng tạo bọt 34

Hình 4.9 Định tính saponin bằng phưomg pháp Liebermann-Burchard 35 Hình 4.10 Định tính sắc ký lóp mỏng trong 2 hệ : n-butanol: acid acetic: nước và cloroíbrm : methanol: nước 36

Hình 4.11 Kết quả thực hiện phản ứng tạo bọt 40

Hình 4.12 Định tính saponin bằng phưong pháp Liebermann-Burchard 40 Hình 4.13 Nhãn lọ cao Đảng sâm Việt Nam 51

Hình 4.14 Sản phẩm lọ cao Đảng Sâm Việt Nam 52

DANH MỤC CÁC BẢNG • Bảng 4,1, Dãy nồng độ khảo sát của cao tổng thử hoạt tính DPPH 22

Bảng 4.2 Phản ứng thử nghiệm DPPH 22

Bảng 4.3 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật trong rễ cây Đảng 31

Bảng 4.4 Độ ẩm của dược liệu rễ Đảng sâm Việt Nam 32

Bảng 4.5 Độ tro toàn phần của dược liệu rễ Đảng sâm Việt Nam 33

Bảng 4.6: Độ tro không tan trong acid của dược liệu rễ Đảng sâm 33

Bảng 4.8 Tóm tắt tiêu chuẩn hóa dược liệu Đảng sâm theo DĐVN, 37

Bảng 4.10 Độ tro toàn phần của cao Đảng sâm 39

Bảng 4.11 Độ tro không tan trong acid cua cao Đảng sâm 39

Bảng 4.12 Hàm lượng saponin toàn phần (X%) của cao 41

Bảng 4.13 Tiêu chuẩn cơ sở của cao Đảng sâm Việt Nam 41

Bảng 4.14 Kết quả thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao tổng của rễ42 Bảng 4.15 Kết quả hoạt tính chống oxy hóa của vitamin c 43

Bảng 4.16 Kết quả đánh bắt gốc tự do của cao và vitamin c 44

Bảng 4.17 Giá trị IC 5 0 của cao tổng và vitamin c 45

Bảng 4.18 Điểm trung bình và sai số trong đánh giá thị hiếu người tiêu dùng với việc sử dụng nước pha cao 46

Bảng 4.19 Điểm trung bình và sai số trong đánh giá thị hiếu người tiêu dùng với việc sử dụng nhiệt độ nước trong việc pha cao 47

Bảng 4,20, Điểm trung bình và sai số trong đánh giá thị hiếu người tiêu dùng với việc sử dụng mật ong pha vào hỗn hợp cao và nước 48

Bảng 4.21 Điểm trung bình và sai số trong đánh giá thị hiếu người tiêu dùng đối với cách uống cao pha với nước và bổ sung thêm mật ong vào hỗn hợp cao và nước 49

Bảng 4.22 Bảng tóm tắt đánh giá thị hiếu người tiêu dùng đối với việc sử dụng chế phẩm cao 50

Bảng 4.23 Các chỉ tiêu chất lượng và cảm quan chế phẩm cao Đảng sâm Việt Nam 51

Biểu đồ 4.1: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao tổng của rễ 43 Biểu đồ 4.2: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên vitamin c 44 Biểu đồ 4.3 Giá trị IC50 về hoạt tính đánh bắt gốc tự do DPPH của cao

tổng với chất đối chứng vitamin c 45 Biểu đồ 4.4 : Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng trong việc sử dụng nước

pha cao 46 Biểu đồ 4.5: Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng trong việc sử dụng nhiệt độ nước

để pha cao 47 Biểu đồ 4.6: Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng trong việc sử dụng lượng

mật ong để pha vào hỗn hợp cao và nước 48 Biểu đồ 4.7: Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng đối với cách uống cao pha

với nước và bổ sung thêm mật ong vào hỗn hợp cao và nước 49

Ll Đặt vấn đề

Việt Nam là một quốc gia có đa dạng sinh học cao với 12.000 loài cây cỏ Trong đócó:

4000 loài cây thuốc dùng trong các nền y học dân gian

J 800 loài thường được dùng trong các y học cổ truyền

300 loài dùng trong công nghiệp dược

Hiện nay, việc nghiên cứu các chế phẩm chứa các hoạt chất từ cây thuốc rất đadạng và phổ biến Hom thế nữa, con người có xu hướng quay về với thiên nhiên và đangdựa vào các loại thảo dược như biện pháp khắc phục cho nhiều bệnh Trong đó tình trạngsuy kiệt sức khỏe, hệ miễn dịch và hệ tiêu hóa kém đặc biệt là quá trình lão hóa do làmviệc dưới áp lực cao cũng như là sự ô nhiễm của môi trường đang là vấn đề được quan tâmhàng đầu Nhiều bài thuốc đông y hiện nay đã và đang được nghiên cứu, phát triển nhằmcải thiện tình trạng này trong đó có loài dược liệu là Đảng sâm, được coi như là nhân sâmcủa người nghèo vì có công dụng của nhân sâm mà lại rẻ tiền như tăng cường thể lực,chống suy nhược cơ thể, kích thích các hoạt động não bộ, suy nhược tinh thần, chống oxyhóa, chống lão hóa, phòng chống các loại ung thư, tăng sức đề kháng “ Đối với Đảng sâmđang được sử dụng phổ biến ở Việt Nam hiện nay được nhập từ những vùng trồng ở ThiểmTây, Sơn Tây, Trung Quốc đã được di thực và trồng tại Lào Cai”[2] “ Ở Trung Quốc cònhàng chục loại Đảng sâm khác nhau trong chi Codonopsis, Dược điển Việt Nam IV có ghi

Đảng sâm Việt Nam là rễ phơi hay sấy khô của cây Đảng sâm Codonopsỉs javanica

(Blume) Hook.f họ hoa chuông Campanulaceae” [2] “Một câu hỏi đặt ra tại sao Đảng sâmnhập từ Trung Quốc lại chiếm vị trí áp đảo so với Đảng sâm Việt Nam trên thị trường”[2],

vì vậy nhóm tác giả dược sĩ Ly Đào Kim Long và cộng sự đã góp phần nghiên cứu tiến tớitiêu chuẩn hóa vị thuốc Đảng sâm nhằm phát triển Đảng sâm Việt Nam [2].Nối tiếp việcnghiên cứu về Đảng sâm Việt Nam, tác giả Hoàng Minh Chung cùng cộng sự đã phân lập,nhận dạng một dẫn

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

xuất glycoside SC1 trong Đảng sâm có cấu trúc khung là sigmasta-7,25 dien-3 on Chấtnày chưa được tìm thấy trong Đảng sâm Việt Nam và Trung Quốc [7] Tác giả cùng cộng

sự cũng đã nghiên cứu thành công tác dụng bổ khí của Đảng sâm Việt Nam [5] Ngoài tácdụng bổ khí, tác dụng chống oxy hóa là vấn đề được quan tâm hiện nay

Để làm sáng tỏ hon về khả năng chống oxy hóa của chế phẩm cao Đảng sâm ,

chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chế phẩm cao Đảng sâm (Codonopsỉs javanica

(Blume) Hook.f.) có hoạt tính kháng oxy hóa ”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của dược liệu

- Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu và cao của Đảng sâm Việt Nam

- Khảo sát hoạt tính sinh học của cao Đảng sâm

- Đánh giá thị hiếu người tiêu dùng đối với cao Đảng sâm Việt Nam

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát sơ bộ hóa thực vật của rễ Đảng sâm

- Chiết nguyên liệu với 3 nồng độ cồn: 96%, 72%, 48%

- Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu và cao: Độ ẩm, độ tro, định tính, định lượng

- Khảo sát hoạt tính sinh học của Đảng sâm: Đánh giá hoạt tính đánh bắt gốc tự do của cao Đảng sâm

- Khảo sát thị hiếu người tiêu dùng đối với chế phẩm cao Đảng sâm

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN

n 1 Giói thiệu về Đảng Sâm

Tên Việt Nam: Đảng sâm [13]

Tên khoa học: Codonopsis javanica (Blume) Hook f (Campanumoea javanica Blume).

Tên khác: Sâm leo, Đùi gà, Phòng Đảng sâm, Lộ đảng sâm, Sâm nam

Phân loại khoa học:

- Giới (regnum): Plantae

- Ngành (divisio): Magnoliophyta

- Lớp (class): Magnoliopsida.

- Bộ (ordo): Campanulales

- Họ (familia): Campanulaceae

Chi (genus): Codonopsỉs.

Loài (species): Javanica.

II.l.l Mô tả về thực vật

Đảng sâm là một loại cỏ sống lâu năm Rễ có hình trụ dài, đường kính có thể đạt1-1,7 cm Đầu rễ phát triển to, trên có nhiều vết sẹo của thân củ, phía dưới có khi phânnhánh, mặt ngoài màu vàng nhạt, trên có các vết nhãn dọc và ngang Thân mọc bò hay leo,phân nhánh nhiều, phía dưới hơi có lông, phía ngọn nhẵn, lá mọc đối, so le hoặc có khi gầnnhư mọc vòng Cuống lá dài 0,5 - 4 cm, phiến lá hình tim hoặc hình trứng dài 1 - 7 cm,rộng 0,8 - 5,5 cm, đầu tù hoặc nhọn, đáy lá hình tim mép nguyên hoặc hơi lượn sóng, hoặc

có răng cưa, mặt trên lá màu xanh nhạt, mặt dưới trắng Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá Có 5 ládài, tràng hoa hình chuông, màu vàng nhạt chia 5 thùy, 5 nhị, bầu có 5 ngăn Quả nang,phía trên có 1 núm nhỏ hình nón, khi chín có màu tím đỏ Mùa hoa nở: tháng 7-8 Mùa quả

tháng 9-10 [4].

11.1.2 Phân bố, sinh thái

Đảng sâm là cây của vùng cận nhiệt đới, được ghi nhận ở Trưng Quốc, Mianma,

Ấn Độ, Lào, Việt Nam và Nhật Bản Ở Việt Nam, Đảng sâm có ở 14 tỉnh miền núi, nhưngtập trưng chủ yếu ở Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang, Ở các tỉnh phía nam, Đảng sâm có ở

núi Ngọc Linh và vùng Đà Lạt [14].

Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể chịu hơi chịu bóng, thường mọc tập trung ở vùngnương rẫy cũ, ven rừng nhất là loại hình rừng núi đá vôi sau khi đã bị khai phá để lấy đấtcanh tác (Hà Giang, Lào Cai và Lai Châu) Trong tự nhiên, số cây trưởng thành có hoa quảchỉ chiếm tỉ lệ 30 - 40% Cây trồng từ hạt sau 2 năm bắt đầu có hoa Do rễ cắm sâu dưới

đất nên sau khi bị đốt nương, cây vẫn có khả năng tái sinh [14].

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

11.1.3 Bộ phận dùng

Rễ Đảng sâm thu hái vào mùa thu đông, rửa sạch đất cát, cắt bỏ đầu rễ và rễ con,phân loại rễ to nhỏ để riêng, phơi nắng nhẹ hoặc sấy ở nhiệt độ cho đến hơi khô, lãn chomềm, rồi tiếp tục phơi hoặc sấy nhẹ cho đến khi khô hẳn

Rễ hình trụ, có khi phân nhánh, đường kýnh 0,5 - 2 cm, mặt ngoài có màu vàngnâu nhạt, trên có những rạch dọc, ngang Loại to có thịt trắng ngà, vị ngọt dịu Khi dùngthái mỏng tẩm nước Gừng, sao qua Dược liệu dễ bị sâu mọt cần được bảo quản ở nơi khô

ráo [14].

11.1.4 Thành phần hóa học

Theo từ điển cây thuốc Việt Nam của Võ Vãn Chi thì Đảng sâm non chứa nước

77,5%, protid 4,2%, glucid 13,1%, xơ 3,3%, carotenoid 3,6%, vitamin c 85,5% Sơ bộ thấy

trong rễ cây có đường, chất béo, không có saponin Còn có tinh dầu, glycosid scutellarin và

alkaloid [14].

11.1.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

II 1.5.1 Nghiên cứu ngoài nước

Hiện nay các nghiên cứu ngoài nước cho thấy Đảng sâm như là một vị thuốc có thể hỗ trợcho nhiều loại bệnh

Năm 2006, HE Qing,ZHU En-yuan and et al làm sáng tỏ các thành phàn hoạt độngcho việc đánh giá chất lượng của Codonopsis pilosula Các hợp chất này được tách ra vớicác kỹ thuật sắc ký và cấu trúc của họ đã được làm sáng tỏ trên cơ sở các bằng chứng phổ

và tính hóa lý Ket quả cho thấy 10 hợp chất được phân lập từ phân đoạn n-butanol củadịch chiết ethanol của Codonopsis pilosula và cấu trúc xác định là lobetyolin (1), syringin(2), hexyl-P-D-glucopyrannoside (3), butyl-P-D- fructofumanoside (4), lobetyolinin (5),geniposide (6), tryptophan (7), uracil (8), 3 4', 5,9,9'- pentaydroxy-5-4,7 '-epoxylignan (9)

và emodin (10) Kết luận rằng hợp chất được từ 4-10 lần đầu tiên được phân lập chiCodonopsis pilosula và lobetyolin ( I ) có thể được lựa chọn để đánh giá chất lượng

Năm 2010, Ya-jun Zhang3’ đã phân tích cấu trúc của polysaccharide tan trong nướcCPPS3 phân lập từ Codonopsis pilosula, là một loài thực vật có hoa lâu năm ở Đông Bắc

Á Một polysaccharide tan trong nước, CPPS3, được chiết xuất từ rễ của nó bằng nước

nóng và kết tủa ethanol Trọng lượng phân tử được ước tính là 7.4 X 104 Da, xác địnhbằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel Thành phàn monosaccharide và cấu trúc củapolysaccharide được xác định bằng quang phổ khí, quang phổ hồng ngoại (FT-IR), quangpho NMR và quang phổ kế và phân tích một số phương pháp hóa học đã được thực hiện.Các thành phần là galactose, arabinose và rhamnose với tỷ lệ mol 1,13:1,12: 1 Chuỗichính của CPPS3 được minh họa là

(1 —> 3) -linked-0-GalpNAc, (1 —> 3) -linked-a-Rhap và (1 —> 2,3) -0-Galp [24]

Tác giả Singh B và cộng sự ở trường đại học Nam California thuộc khoa khoa học

và sức khỏe (Mỹ), thử nghiêm trên 2 loại cây Đảng sâm và Bạch quả so với giả dược Thínghiệm cho thấy sự kết hợp giữa Đảng sâm và Bạch quả cho kết quả cải thiện trí nhớ và

tình trạng sức khỏ tốt hơn lả giả dược [21]

Năm 2004, tác giả T.B.Ng3 , F.Liu, H.X.Wang nghiên cứu hiệu quả kháng oxi hóa

giữa phương pháp chiết xuất nước và dung môi hữu cơ của các loại Panax quỉnquefolỉum(sâm Mỹ), Panax notoginseng (Tam thất), Codonopsỉspỉlosula(Đảng sâm), Pseudostellaria heterophylla and Glehnia littoralis Thỉ nghiêm cho thấy rằng, các chất

chiết xuất nước của Glehnia littoralis và Codonopsis pilosula là mạnh

HVTH: TRƯONG VĨNH THÚY ANH

nhất trong việc ức chế hồng càu tan máu Các chất chiết xuất nước của Panaxqumquefolium và Panax notoginseng có khả năng thấp hơn, trong khi chiết xuất nước củaPseudostellaria heterophylla và chiết xuất với dung môi hữu cơ của Panax quinquefoliumchỉ hoạt động một cách yếu ớt Các chất được chiết xuất từ dung môi hữu cơ của Glehnialittoralis, Panax heterophylla và Panax quinquefolium là mạnh trong việc ức chế lipidperoxy trong khi chiết xuất dung môi hữu cơ của Codonopsis pilosula và Panaxnotoginseng có khả năng yếu Các chất được chiết xuất từ nước thấp hơn nhiều so với việcchiết xuất dung môi hữu cơ tương ứng Tuy nhiên, Glehnia littoralis chiết xuất với nướcthể hiện khả năng mạnh nhất Kết quả cho thấy Glehnia littoralis, Codonopsis pilosula,Panax notoginseng và Panax heterophylla là sản phẩm thay thế rẻ hơn của Panax

quinquefolium liên quan đến hoạt động chống oxy hóa [22]

Năm 2004, Cao Li và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của polysaccharide từ câyCodonopsis pilosula trên hoạt động cảm ứng IL-2 và phản ứng tăng sinh tế bào lympho ở

gà Ket quả từ hai thử nghiệm này cho thấy polysaccharide của Codonopsis pilosula làm

tăng sinh tế bào lympho và IL-2 một cách rõ ràng [15]

Tháng 6, 2009, tác giả Yong-Xu Sun nghiên cứu ảnh hưởng việc hỗ trợ miễn dịchcủa polysaccharide hòa tan trong nước (CPP) từ Codonopsis pilosula trên việc đáp ứngmiễn dịch đối với Ovalbumin của chuột Tác dụng điều hòa miễn dịch và khả năng bổ trợcủa CPP về đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể của những con chuột ICR chốngovalbumin (OVA) đã được nghiên cứu CPP được chứng minh là không thể gây chết ngườitrong cơ thể những con chuột với liều lượng từ 0,5 đến 4 mg ICR Chuột được tiêm dưới

da 0,1 mg OVA hoặc với 0,1 mg OVA hòa tan trong dung dịch muối có chứa nhômhydroxide gel (Alum) (0,2 mg), Quila (0,01 và 0,02 mg) hoặc CPP (0.5, 1 hoặc 2 mg) vàocác ngày 1 và 15 Hai tuần sau (28 ngày), concanavalin A (Cona) -, lipopolysaccharide(LPS) - và khả năng tăng sinh splenocyte được kích thích và kháng thể trong huyết thanhOVA cụ thể được xác định CPP tăng cường đáng kể các ConA-, LPS-, hoặc sự gia tăngsplenocyte kích thích OVA ở những con chuột được tiêm chủng OVA-đặc biệt là ở liều 1

mg (P <0,05 hoặc p <0,01) Các mức kháng thể IgG, IgGl, và IgG2b OVA cụ thể tronghuyết thanh cũng được tăng cường đáng kể bởi CPP so với nhóm đối chứng OVA (P <0,05

hoặc p <0,01) Kết quả cho thấy CPP có thể là một chất bổ trợ hiệu quả an toàn để sử dụng

trong vắc-xin chống lại cả hai tác nhân gây bệnh và ung thư.[25]

Năm 2012, Tao Xin và cộng sự nghiên cứu hiệu quả ức chế của một polysaccharide

từ Codonopsis pilosula trong việc tăng trưởng khối u và di căn trong ống nghiệm Trongnghiên cứu này, tác giả chuẩn bị một polysaccharide có tính axit (CPPA) từ rễ củaCodonopsis pilosula Những ảnh hưởng của CPPA tăng trưởng tế bào khối u, xâm lược, và

di căn đã được kiểm tra trong phòng thí nghiệm Các CPPA không chỉ gây ra tác dụng ứcchế mạnh về việc xâm lược và khả năng chuyển đổi của các tế bào ung thư buồng trứngbiểu mô HO-8910 của con người trong ống nghiệm (việc đánh giá dựa trên các xét nghiệmchữa lành vết thương, transwell và kết dính tế bào) mà còn tác dụng chống sự tăng trưởnghiệu quả trên tế bào ung thư Hơn nữa, biểu hiện CD44 trên tế bào HO-8910 cũng đượcsuy yếu bằng cách xử lý CPPA Vì vậy, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng CPPA có thể

là một hợp chất tiềm năng cho công tác phòng chống di căn của khối u, có lẽ bằng cách ứcchế xâm lược, di chuyển và độ bám dính của các tế bào khối u, cũng như biểu hiện CD44

trên tế bào ung thư [23]

Đông y coi Đảng sâm có thể dùng thay thế Nhân sâm trong các bệnh thiếu máu,vàng da, bệnh bạch huyết, viêm thượng thận, nước tiểu có albumin, chân phù đau Còndùng làm thuốc bổ dạ dày, chữa ho, tiêu đờm, lợi tiểu tiện Người ta còn gọi Đảng sâm là

Nhân sâm của người nghèo vì có mọi công dụng của Nhân sâm lại rẻ tiền hơn [3].

Năm 2003, Chen Jian,Hu Chang-lin nghiên cứu tác dụng chống thiếu máu cục bộ

và tái tưới máu gây ra tổn thương não ở chuột Wistar của Codonopsis pilosula Một trămcon chuột Wistar được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm: Nhóm A, sham được điều khiển(SH); Nhóm B, thiếu máu cục bộ não và tái tưới máu + NS (IR + NS); Nhóm c, thiếu máucục bộ não và tái tưới máu + Codonopsis pilosula (IR + Codo.); Nhóm D, thiếu máu cục

bộ não và tái tưới máu + CoQlO (IR + CoQÍO) Nhóm B, c, D, được ăn với NS,Codonopsis pilosula, CoQlO tương ứng Các động mạch cổ tử cung phổ biến của nhữngcon chuột đã bị chặn tạm thời song phương, kết hợp với chảy máu từ đuôi của chúng vàsau đó tái tưới máu Các thủ tục này được lặp đi lặp lại một lần nữa nhiều như trên để thiếtlập một mô hình chấn thương sọ não thiếu máu cục bộ ổn định Mức ATP, Na +, K +

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

ATPase hoạt động trong mô não được xác định sau 3,6,12h từ đầu thiếu máu cục bộ Kếtquả Mức độ ATP và Na +, K + ATPase hoạt động của Nhóm B (IR + NS) thấp hơn so vớinhững người thuộc nhóm A (SH) (P0.05) và mức độ ATP và Na +, K + ATPase hoạt độngcủa nhóm c (IR + Codo.) và nhóm D (IR + CoQlO) đều cao hơn so với nhóm B (IR + NS)(P0.05) Có sự khác biệt giữa các giá trị thuộc nhóm c và nhóm D Kết luận ràng,Codonopsis pilosula cải thiện sự trao đổi chất năng lượng của não và có tác dụng bảo vệ

não Đó là hiệu quả là cách tiếp cận của CoQlO [16]

Năm 1943, Kinh Lợi Bân và Thạch Nguyên Cao đã dùng Đảng Sâm mua ở hiệuthuốc Đồng Nhân Đường (Ở Bắc Kinh, Trung Quốc) ngâm với cồn 70% trong một tháng.Lọc lấy cồn, bã còn lại sắc nước Dùng cả hai loại cao cồn và cao nước trên chế thành dungdịch 20%, một phần sau khi hấp tiệt trùng thì được sử dụng, một phần cho lên men để loạihết các hợp chất hydratcabon như đường rồi mới sử dụng, đồng thời lại dùng Đảng sâm

chế thành thuốc cho uống Tiến hành trên thỏ và chó đi tới một số kết quả sau [4]:

+ Làm tăng đường huyết (do thành phần hydratcacbon trong Đảng sâm) nhungkhông ức chế được cao đường do nguồn gốc thần kinh

+ Làm hồng cầu tăng lên, bạch cầu giảm xuống khi tiêm dưới da dung dịch Đảngsâm 20% (4 ml/kg thể trọng) hoặc cho uống (mỗi ngày 20 g)

+ Làm hạ huyết áp khi tiêm mạch máu dung dịch Đảng sâm 20% (chiết xuất bằngnước và bằng rượu) cho thỏ và chó đánh mê do gây giãn mạch ngoại vi Đảng sâm còn cótác dụng ức chế kém, nếu lượng adrenalin tiêm thấp ức chế càng mạnh

n.1.5.2 Nghiên cứu trong nước

Năm 2002, Hoàng Minh Chung và cộng sự đã bước đầu nghiên cứu thành phầnhóa học của vị thuốc Đảng sâm Việt Nam cho thấy trong rễ Đảng sâm Việt Nam tươi vàchế biến có đường, saponin, acid amin và chất béo.Bằng sắc ký lớp mỏng, bước đầu đãđược xác định được 5 vết trong saponin của Đảng sâm Việt Nam sống và chưng cất 2 giờ.Hàm lượng saponin trong mẫu chế biến (1,47%) thấp hơn mẫu sống (2,17%).Rễ Đảng sâmViệt Nam có 17 acid amin tuy hàm lượng không cao nhưng có đầy đủ acid amin cần thiết

cho cơ thể [6]

Cũng chính hai tác giả này đã công bố kết quả bước đầu nghiên cứu thành phầnsaponin của Đảng sâm Việt Nam, kết quả cho thấy trong mẫu Đảng sâm Việt Nam cósaponin triterpenoid Nghiên cứu cho thấy chỉ số tạo bọt của Đảng sâm Việt Nam sống là8; chỉ số phá huyết là 5,7; hàm lượng saponin là 3,12 ± 0,08%.

Hoàng Minh Chung và Phạm Xuân Sinh cũng đã xác định hàm lượng đường khửcủa 11 mẫu thử Đảng sâm Việt Nam chế biến theo các cách khác nhau và nghiên cứu tácdụng tăng lực của Đảng Sâm Việt Nam bằng nghiệm pháp chuột bơi Ket quả nghiên cứucho thấy hàm lượng đường khử trong mẫu Đảng sâm là 14,6 ± 11,2% và trong mẫu chưng

cất 2 giờ là 29,5 ± 0,9% [5].

Ngoài ra theo Đào Kim Long và cộng sự [2] tiến hành nghiên cứu thì ngoài cácchất nêu trên trong rễ Đảng sâm Việt Nam có một số hoạt chất lần đầu tiên được công bố

như: Các hợp chat phytosterol như p — sitosterol với sự tồn tại 3 đồng phân

stigmast-5-en-3-/?-ol, stigmast-7-en-stigmast-5-en-3-/?-ol, stigmast-25-en-3-/?-ol và daucosterol (glycosid của sitosterol có gắn 1 phân tử glucose ở vị trí c số 3) Các hợp chất flavonoid như hesperidin

^-và kaemferol-3-ơ-/?-D-sophorosid Các hợp chất polyacetylen như diacetylenicpolyolefenic alcohol (lobetyol) Trong đó hợp chất lobetyolin được xem là chất đánh dấu

của loài Codonopsỉs.

Cho động vật thí nghiệm dùng Đảng sâm thấy có tác dụng gây phát triển nội mạc

tử cung kiểu progesteron mức độ nhẹ (trên thỏ nhỏ), gây tăng trương lực cổ tử cung, tiếtsữa ở động vật mẹ cho con bú và đồng thời có tác dụng chống viêm [3]

Việc nghiên cứu tác dụng của Đảng sâm trên các bào tương chứa IgG và cácdưỡng bào của chuột nhắt được tiêm hydrocortison cho thấy các tương bào chứa IgG tronglớp mỏng của ruột non giảm ở chuột nhắt được tiêm hydrocortison đơn thuần, nhưng tăng

ở chuột nhắt được cho hydrocortison và Đảng sâm Đảng sâm có thể đã làm tăng chứcnăng của tủy xương sản sinh ra các tế bào có hoạt tính miễn dịch và các dưỡng bào Do đó,

đã điều hòa và làm giảm hội chứng suy giảm miễn dịch ở chuột với một mức độ nhất định

Đảng sâm còn có tác dụng bổ toàn thân và kích thích miễn dịch Xuyên Đảng sâmcủa Trung Quốc có tác dụng gây tăng hồng cầu và giảm bạch cầu, gây hạ huyết áp do làm

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

giãn mạch ngoại vi và ức chế tác dụng gây tăng huyết áp của adrenalin ở động vật thí

nghiêm [3].

II.2 Hoạt tính đánh bắt gốc tự do [19]

Hiện nay ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất chống oxy hóa thứ cấp từthực vật như là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy hóa có hại tồn tạisẵn có trong cơ thể Trong đời sống các sinh vật đều thiết lập một sự cân bằng tinh tế giữaích lợi và nguy cơ trong việc sử dụng oxy để đạt năng lượng Trong quá trình hô hấp chúng

đã tạo ra các hợp chất trung gian là các gốc tự do: Anion superoxyde (O2), hydroxyl (-OH),chất oxy hóa như H2O2 có hoạt tính phản ứng rất lớn, mà từ các chất này cũng như các sảnphẩm phản ứng của chúng là nguyên nhân phá hủy các phân tử sinh học như DNA, lipid,protein,

Mặc dù bản thân của sinh vật đã tự phát triển các hệ thống enzym nhằm điều hòacác loại phân tử oxy hoạt tính cao này như superoxyd dismutase, catalase, glutathionperoxydase là các enzym điều hòa nhằm duy trì sự an toàn trong giới hạn cho phép củaanion superoxyd, H2O2, chúng được xem là các enzym khử độc chính trong cơ thể Đôi khi

hệ thống bảo vệ trên bị quá tải, không khí bị ô nhiễm, khói thuốc lá, bức xạ tử ngoại, cácloại oxy hoạt tính cao này vượt quá giới hạn cho phép sẽ là nguồn gây bệnh, thúc đẩynhanh quá trình lão hóa cho sinh vật Các chất chống oxy hóa từ thực vật đã góp phần hỗtrợ cho hệ thống bảo vệ cơ thể, ngăn chặn

oxy hóa không mong muốn như carotenoid, flavonoid,vitamin c, E và các hợp chất trao đổi chất thứ cấp từ thựcvật đã và đang quan tâm nghiên cứu.

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp được sử dụng để xác định khả năng chống oxy hóa của dược liệu dựa trên các nguyên tắc khác nhau như ORAC, TRAP, FRAP, CUPRAC, DPPH Trong đó phương pháp DPPH là phương pháp được sử dụng phổ biến vì

đơn giản, nhanh và ổn định [17].

Năm 1922 Goldschmidt và Renna đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tímđậm, hầu như không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxy đóchính là gốc tự do DPPH (2,2 - diphenyl picrylhydrazyl), có khối lượng phân tử là 394,32g/mol DPPH là một gốc tự do có màu tím giống như màu của dung dịch KMnƠ4, khôngtan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH có cực đại hấp thụ tại bướcsóng 517 nm và sản phẩm khử của nó là 2,2 - diphenyl picrylhydrazin (DPPH-H) thì cómàu vàng cam [17]

Ngày nay DPPH được dùng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do.Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biển vì đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định Do

đó, phương pháp này được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxy hóa của mẫu nghiêncứu trong thử nghiệm ban đàu

Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trưng hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen,lảm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từtím sang vàng

Nồng độ của DPPH vào cuối của một phản ứng sẽ phụ thuộc vào nồng độ và cấu trúc của

Hình 2.2 Phản ứng trung hòa gốc DPPH

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

Sự giảm màu đó sẽ được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517 nm

Ket quả được đánh giá thông qua giá trị IC50 (inhibitory concentration) là nồng độ chấtoxy hóa cần ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định

CHƯƠNG m : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

IIL1 Nguyên vật liệu và thiết bị

IIL1.1 Nguyên liệu

Rễ Đảng sâm được thu hái tự nhiên vào tháng 5 từ núi Ngọc Linh, tỉnh KomTum Mẩu xay thành bột và được lưu ở Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp HCM

III.1.2 Thiết bị và dụng cụ

> Thiết bị, dụng cụ:

Tủ sấy Sanyo mov -112 (Anh)

Đèn uv với 2 bước sóng 254 nm và 365 nm VilBer Lourinat (Pháp)

Lò nung Lenton (Anh)

Bản Silicagel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck)

Bể siêu âm Sonorex RK - 1028H (Bandelm)

Máy cô quay Buchi - 114 (Thụy Sĩ)

Các dụng cụ thông dụng của phòng thí nghiệm

> Hóa chất, thuốc thử

Các hóa chất dùng cho chiết xuất như: methanol, diethyl ether, ethyl

acetat, n - butanol, ethanol 96%, 72% và 48%.

Các dung môi dùng khai triển sắc ký: ether dầu hỏa, ethyl acetat,cloroform, methanol,

Các thuốc thử H2SO4 10% trong cồnCác hóa chất dùng thử hoạt tính : 2,2 - Diphenyl - 2 - picrylhydrazyl(DPPH) (Sigma)

Chất đối chứng: Vitamin c : độ tinh khiết 98%, công ty cổ phần dượcphẩm Inmexphram

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

111.2 Phuong pháp nghiên cứu

111.2.1 Nghiên cứu thực vật học của dược liệu

111.2.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái thực vật

Quan sát hình thái toàn cây Đảng sâm và các đặc tính của rễ Đảng sâm tươi và

mô tả bộ phận dùng của dược liệu như màu sắc, kích thước, hình dáng,

II 1.2.1.2 Khảo sát đặc điểm vi phẫu của dược liệu

Quan sát vi phẫu cắt ngang thân, lá, rễ bằng phương pháp nhuộm kép, quansát dưới kính hiển vi

Cách thực hiện:

Xứ lý mẫu: Mẩu dược liệu tươi (ngâm trong cồn 70% để bảo quản) được lấy

ra cắt bằng lưỡi lam rồi nhuộm Các lát cắt được ngâm ngay vào nước để tránh bị khô

Nhuộm vi phẫu: Dùng phương pháp nhuộm kép Carmin - lục iod Cáchnhuộm như sau:

+ Ngâm lát cắt vào dung dịch javel từ 15 - 30 phút (cho đến khi thấy lát cắttrở nên trắng), rửa bằng nước cất nhiều lần

+ Ngâm lát cắt váo dung dịch acid acetic 1-3% trong 2 phút để tẩy javel cònsót lại Rửa bằng nước cất

+ Ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch chloral hydrat 50% (nếu thấy lát cắt chưathật trắng và trong) khoảng 10-15 phút Rửa bằng nước cất

+ Ngâm tiếp vào dung dịch son phèn khoảng 15-30 phút Rửa bằng nước cấtđến khi dung dịch rửa hết màu

Vi phẫu sau khi nhuộm xong có thể ngâm vào nước cất hay dung dịchglycerin 30% Với dung dịch glycerin có thể giữ vi phẫu một tuần hay lâu hơn

Vi phẫu chuẩn bị xong quan sát dưới kính hiển vi, chụp ảnh và vẽ hình

Vi phẫu rễ Đảng sâm từ ngoài vào trong gồm có [1]:

° Lớp bần gồm 4 đến 5 hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn thànhhàng đồng tâm và dãy xuyên tâm, có nhiều chỗ bị nứt rách

° Mô mềm vỏ cấu tạo bởi tế bào nhiều cạnh, hơi dài dẹt.

° Tố bào libe nhỏ xếp xít nhau

° Mạch gỗ xếp thành hàng tạo thành hệ thống hình nan quạt tỏa ra từ tâm

° Tia ruột có tế bào thành mỏng

HL2.1.3 Khảo sát bột dược liệu

Khảo sát bột dược liệu bằng kính hiển vi nhằm mục đích tìm ra những đặcđiểm vi học đặc trưng của bột dược liệu giúp việc định danh, xác đỊnh độ tinh khiếtcủa dược liệu, phân biệt với dược liệu dễ nhầm lẫn và phát hiện có sự giả mạo nếu có[9]

Chuẩn bị bột để soi: Lấy dược liệu cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ khoảng 60 °C,nghiền nhỏ, rây qua rây số 32, phần còn lại trên rây được tán và rây tiếp cho đến khitất cả dược liệu thành bột mịn Trước khi soi kính hiển vi phải quan sát bột bằng cảmquan (nhận định màu sắc, mùi vị, độ mịn, nhám)

Lên tiêu bản soi bột: Cho một giọt nước vào giữa phiến kính, dùng que sạchtrộn đều bột, lấy một ít bột cho vào giữa chất lỏng, dùng một góc của lá kính để cácphần tử của bột tách rời ra và phân tán đều Loại bỏ phần bột và nước thừa nằm ngoài

lá kính bằng giấy thấm, lau sạch mặt trên phiến kính và lá kính trước khi soi kính hiển

vi Quan sát dưới kính hiển vi và chụp ảnh

Theo Dược điển Việt Nam rv chuyên luận Đảng sâm Việt Nam, thành phầnbột rễ cây Đảng sâm kính hiển vi gồm [1]:

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

HL2.1.4 Xác định độ ẩm

Theo Dược điển Việt Nam IV, độ ẩm không quá 15 % (phụ lục 182) [1]

♦♦♦ Nguyên tắc: Độ ẩm là lượng nước chứa trong 100 g dược liệu Dược liệu tươi

thường chứa một lượng nước rất lớn: lá chứa khoảng 60 - 80% nước, thân và cànhchứa khoảng 40 - 50% nước Không có một dược liệu nào đạt độ khô tuyệt đối (độ ẩm

0 %), nhưng đối với mỗi dược liệu đều được quy định một độ ẩm an toàn Để bảo quảntốt, dược liệu cần có độ ẩm bằng hoặc dưới độ ẩm an toàn

Xác định độ ẩm là công việc đầu tiên phải làm khi tiến hành xác định chấtlượng một dược liệu và được tiến hành định kỳ hàng năm 2 lần trong các đợt kiểm kêdược liệu theo quy định của nhà nước

Tiến hành:

Dùng chén cân có nắp mài làm bì, sấy ở 105 °C đến khối lượng không đổi rồicân bì Cân chính xác khoảng 1 g mẫu dược liệu vào chén cân Đem sấy trong tủ sấythường ở 105 °C Để nguội trong bình hút ẩm, cân xác định khối lượng, sấy đến khốilượng không đổi (chênh lệch khối lượng sau khi sấy thêm 1 giờ hoặc trong bình hút

ẩm 6 giờ so với lần sấy trước không quá 0,5 mg)

n 1.2.1.5 Xác định độ tro

Tiến hành theo dược điển Việt Nam IV Độ tro toàn phần không quá 6,0% [1]

và độ tro không tan trong acid không quá 2,0% ( Phụ lục 9.8, phụ lục 183 [1].

Nguyên tắc:

Xác định độ tro là xác định hàm lượng các chất vô cơ không bay hơi có trongdược liệu Đây cũng là thành phần các chất vô cơ của dược liệu, nhưng cũng có thể cóthêm những tạp (như đất, cát) lẫn vào dược liệu

Tro toàn phần là khối lượng cắn vô cơ còn lại sau khi nung cháy hoàn toànmột dược liệu, cắn vô cơ chủ yếu là carbonat và oxyd kim loại

Tro không tan trong acid là phần chất vô cơ không bị hòa tan trong acidhydrochloric, thường là silic oxyd Tro không tan trong acid thường nói lên mức độlẫn cát, đất của dược liệu

Tiến hành:

Tro toàn phần: Nung một chén nung bằng sứ cho đến khi khối lượng không

đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén không Cân chính xáckhoảng 2 g bột dược liệu cho vào chén cân, trải đều mẫu dưới đáy chén và đốt cẩnthận trên bếp điện cho đến khi mẫu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói Đưavào lò nung và nung ở nhiệt độ 500 °C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro khôngcòn màu đen) Làm nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân Tiếp tục làm như vậy chođến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén tro không chênh lệch quá 0,5 mg

Tro toàn phần được tính theo công thức:

Mỗi mẫu được xác định độ tro toàn phần 3 lần và lấy giá trị trung bình

Tro tan trong acid: Cho 25 ml dung dịch acid hydroclone 2M (TT) vào tro

toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc bằng giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 500 °C đến khối lượng không đổi rồi đem cân

IIL2.2 Phân tích sư bộ thành phần hóa thực vật của Đảng Sâm

Dựa vào độ hòa tan của các hợp chất trong dược liệu để tách chúng bằng [10]

các dưng môi có độ phân cực tăng dần: Kém phân cực, phân cực trung bình phân cựcmạnh, bằng cách chiết lần lượt với các dung môi: Diethyl ether, cồn và nước Sau đóxác đinh các hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng

IIL2.2.1 Chuẩn bị dịch chiết

Dịch chiết ether: Chiết 10 g nguyên liệu bằng diethyl ether Chiết cho tới khidịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ Gộpdịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch ether

Dịch chiết cồn: Bã dược liệu được chiết tiếp bằng cồn cao độ trong bình tamgiác với sinh hàn hồi lưu 20 - 30 phút trên bếp cách thủy, thực hiện 3 lần Gộp các

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

được thủy phân để định tính các aglycon sau khi thủy phân Lấy 15ml dịch chiết cồncho vào bình nón 100 ml, thêm 10 ml HC1 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30phút Đe nguội cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bang ether ethylic Dịch etherđược dụng để định tính các aglycon

Dịch chiết nước: Bã dược liệu sau khi chiết bằng cồn được đem chiết nóngvới nước trong bình tam giác trên bếp cách thủy, thực hiện 3 lần Gộp dịch chiết, đểnguội, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết nước Một phần dịch chiếtđược thủy phân để định tính các aglycon sau khi thủy phân Lấy 15 ml dịch chiết cồncho vào bình nón 100 ml, thêm 10 ml HC1 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30phút Đe nguội cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bằng ether ethylic Dịch etherđược dụng để định tính các aglycon

IIL2.2.2 Các phản ứng hóa học khảo sát

Xác định tinh dầu: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tớicạn Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ, rồi lại bốc hơi cho đếncắn Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng: Có tinh dầu

Xác định chất béo: Lấy vài giọt dịch chiết nhỏ lên cùng một chỗ trên miếnggiấy mỏng, hơ hoặc sấy nhẹ cho bay hết dung môi Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vếttrong mờ: Có chất béo

Định tính carotenoid: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tớicắn Thêm vào vài giọt H2SO4 đậm đặc Dung dich có màu xanh dương đậm hay màuxanh lục ngã sang màu xanh dương: Có carotenoid

Định tính triterpenoid: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơitới cắn Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5 mlchloroform Chuyển dung dịch vào một ống nghiệm nhỏ, khô Thêm 1 ml H2SO4 đậmđặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống từ từ Nơi tiếp xúc giữa 2lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ tím, lớp dung dịch phía trên dần chuyển sang màuxanh lục hay tím: Có triterpenoid

Định tính alkaloid: Lấy khoảng 10 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tớicắn Hòa cắn trong 4 ml dung dịch HC1 1% Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệmnhỏ Định tính alkaloid bằng các thuốc thử:

Thuốc thử Mayer: Cho tủa trắng - vàng nhatThuốc thử Bouchardat: Cho tủa đỏ nâuThuốc thử Dragendoff: Cho tủa đỏ cam

So sánh kết quả với ống chứng không có thuốc thử Nếu dung dịch đục hơn sovới ống chứng hoặc có tủa: Có alkaloid

Định tính coumarin: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho và chén sứ, bốc hơi tớicắn Hòa cắn trong 2 ml cồn 70% Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ Thêmvào ống thứ nhất 0,5 ml KOH 10% và ống thứ 2 một lượng nước cất tương đương.Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi duới đèn tử ngoại 365

nm Dung dịch trong ống 1 có huỳnh quang mạnh hom dung dịch trong ống thứ 2: Cócoumarin

Định tính anthraquinon: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm nhỏ.Thêm vào 1 ml dung dịch NaOH 10% và lắc kỹ Nếu lớp kiềm có màu hồng tới đỏ: Cóanthraquinon

Định tính flavonoid: Lấy khoảng 10 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tớicắn khô Hòa cắn với 2 ml cồn và gạn dịch cồn vào một ống nghiệm nhỏ Thêm vàomột ít bột magie kim loại và thêm tù tù 0,1 ml HC1 đậm dặc Neu sau phản ứng, dungdịch có màu tù hồng tới đỏ: Có flavonoid

Định tính anthocyanoid: Lấy 1 ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm nhỏ.Thêm 2-3 giọt dung dich HC110% Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ và chuyển sangmàu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10%: Có anthocyanoid

Định tính proanthocyanidin: Lấy 5ml dịch chiết cho vào ống nghiêm, thêm 2

ml dung dịch acid HC1 10% và đun trên bếp cách thủy 10 phút Neu dung dịch có màuhồng tới đỏ: Có proanthocyanidin

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

Định tính tannin: Lấy 2 ml dịch chiết cho vào một chén sứ, bốc hơi tới cắn.Hòa tan cắn với 4 ml nuớc trên bếp cách thủy Lọc và chia dịch chiết vào 2 ốngnghiệm:

• Ông nghiệm thứ nhất: Pha loãng 0,5 ml dịch chiết với lml nuớccất Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5% lắc đều Nếu dung dịch có màuxanh đen hay xanh rêu: Có polyphenol

• Ống nghiệm thứ hai: Thêm vào dịch lọc 5 giọt dung dịch gelatinmuối, lắc đều, so sánh với ống chứng chứa dịch chiết ban đầu Nếu cótủa bông trắng: Có tannin

Định tính saponin: Lấy 5 ml dịch chiết cồn cho vào một chén sứ, bốc hơi tớicắn Hòa cắn với 5 ml dịch cồn 25% trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm Thêm 5

ml nuớc và lắc mạnh theo chiều dọc ống Nếu có bọt bền: Có saponin

Định tính các chất khử: Lấy 5 ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn hòa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy để nguội và lọc qua giấy lọc Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 ml dung dịch Fehling B Đun cách thủy 5 phút Neu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: Có các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử)

Định tính các acid hữu cơ: Lấy 2 ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm Pha loãng với lml nước và thêm vào một ít tinh the natri carbonat Neu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: Có acid hữu cơ

Định tính hợp chất polyuronic: Nhỏ từng giọt một 2 ml dịch chiết vào một ống nghiệm có chứa 10 ml cồn 96% Nếu có nhiều tủa bông được tạo thành: Có các polyuronic (gôm, pectin, chất nhầy, )

II 1.2.3 Phương pháp chiết xuất nguyên liệu và sơ đồ thực hiện chế phẩm

IIL2.3.1 Phương pháp chiết xuất nguyên liệu

Kỹ thuật chiết ngấm kiệt [10]

Phương pháp được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp Dụng cụ: Gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng,dưới đáy bình là một van

khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứngdung dịch chiết Dung môi được đổ vào trong bình theo tỷ lệ với nguyên liệu.

Qui trình chiết: Bột được xây thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm Mau không nên to hơn vì

sẽ chiết không kiệt, mẫu xay quá mịn hoặc có tính nhầy nhựa hoặc có thể trương nở sẽ cản trở dòng chảy Cho vào đáy của bình ngấm kiệt bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột được đặt vào bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên

là những viên bi thủy tinh để dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần thiết vào bình cho đến khi dung môi phủ trên mặt bình Đe yên sau một thời gian, thường là 12-24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt để thu hồi dịch chiết với tốc độ rút dịch là 4ml trong 1 phút

HVTH: TRƯƠNG VĨNH THÚY ANH

IIL2.3.2 Qui trình thực hiện chế phẩm

Sơ đồ qui trình thực hiện chế phẩm cao Đảng sâm

Cô quay

III 2.4 Khảo sát một số tính chất nguyên liệu và cao của Đảng Sâm

IIL2.4.1 Phương pháp định tính

- Phương pháp hóa học [1 ]

Lấy 5 g bột dược liệu (qua rây số 355), thêm 20 ml ethanol 70% (TT), đun hồi

lưu trong cách thủy 15 phút Lọc lấy dịch trong để làm các phản ứng sau: •S

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng