NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO KHỐI U THỰC NGHIỆM  CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) VÀ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG (STREPTOCAULON JUVENTAS (LOUR.) MERR.)

MỞ ĐẦU Đã từ lâu, người ta biết được rằng, ung thư là một trong những căn bệnh hiểm nghèo, và sự di căn tế bào ung thư là nguyên nhân gây ra tử vong cho bệnh nhân. Thông thường, ung thư được điều trị bởi phẫu thuật, xạ trị và hóa trị, tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sau khi điều trị, các khối u vẫn tiếp tục phát triển và di căn do các tế bào ung thư không bị tiêu diệt hoàn toàn. Các tia phóng xạ và hầu hết các thuốc dùng điều trị ung thư thường có tác dụng phụ, gây tổn hại đến các tế bào lành của cơ thể; chúng cũng thường gây ra những hậu quả nghiêm trọng như rụng tóc, ức chế sự hoạt động của tủy xương, gây nôn mửa... Vì thế, các loại thuốc hỗ trợ điều trị ung thư hữu hiệu vẫn đang được tìm kiếm. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u vẫn đang được sử dụng và cho kết quả điều trị tốt, chẳng hạn như các alkaloid từ cây dừa cạn, taxol từ cây thông đỏ, các alkaloid từ cây trinh nữ hoàng cung... Năm 2011, tác giả Marie Jensen và cộng sự cho biết trong những năm gần đây, các hợp chất dẫn xuất cardenolid và các hợp chất bán tổng hợp từ các dẫn xuất cardenolid được xem như là các “ứng cử viên” xuất sắc dùng để điều trị bệnh ung thư phổi. Với mong muốn đóng góp một phần nhỏ vào việc tìm hiểu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây thuốc ở Việt Nam, luận án này giới thiệu một số kết quả nghiên cứu về khảo sát thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất cô lập được từ cây hà thủ ô trắng và cây tô mộc ; là hai cây thuốc đã được các nhà khoa học Việt Nam và Nhật Bản khảo sát sơ bộ, đã cho thấy là dịch chiết metanol của rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc đều có độc tính đối với các dòng tế bào ung thư phổi, ung thư cổ tử cung… Nội dung chính của luận án bao gồm: - Cô lập các hợp chất tinh khiết từ rễ cây hà thủ ô trắng và lõi gỗ thân cây tô mộc. - Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được. - Thử nghiệm độc tính tế bào trên các hợp chất tinh khiết cô lập được

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  BÙI XUÂN HÀO NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO KHỐI U THỰC NGHIỆM  CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) VÀ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG (STREPTOCAULON JUVENTAS (LOUR.) MERR.) Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62 44 27 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH2013 Cơng trình đƣợc thực tại: TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP HCM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN LÊ QUAN GS TS NGUYỄN MINH ĐỨC Phản biện 1: PGS TS TRẦN HÙNG Phản biện 2: PGS TS NGUYỄN NGỌC HẠNH Phản biện 3: GS TS NGUYỄN KIM PHI PHỤNG Phản biện độc lập 1: PGS TS PHẠM THÀNH QUÂN Phản biện độc lập 2: PGS TS NGUYỄN THỊ THU HƢƠNG Luận án bảo vệ hội đồng chấm luận án cấp trường trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh Vào hồi ……….giờ …….ngày ………tháng …… năm 2013 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện trường ĐH Khoa học Tự nhiên Tp.HCM DANH MỤC CƠNG TRÌNH  DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Bùi Xn Hào, Nguyễn Thị Hồng Yến, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần hóa học rễ hà thủ trắng, Tạp chí Phát triển KHCN, Vol 12, No.10, 72-77 (2009) Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần hóa học cao etyl acetat lõi gỗ tơ mộc (Caesalpinia sappan L.), Tạp chí Hóa học, T.47 (4A), 343-346 (2009) Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần hóa học cao etyl acetat lõi gỗ tô mộc (Caesalpinia sappan L.), Tạp chí Hóa học, T.48 (4B), 441-445 (2010) Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần hóa học rễ hà thủ trắng (Streptocaulon juventas Merr.), Tạp chí Hóa học, T.49 (2ABC), 267-271 (2011) Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần hóa học rễ hà thủ ô trắng Tạp chí Phát triển KHCN, Vol 14, No.T2, 28-35(2011) MỞ ĐẦU Đã từ lâu, người ta biết rằng, ung thư bệnh hiểm nghèo, di tế bào ung thư nguyên nhân gây tử vong cho bệnh nhân Thông thường, ung thư điều trị phẫu thuật, xạ trị hóa trị, nhiên, nhiều trường hợp, sau điều trị, khối u tiếp tục phát triển di tế bào ung thư khơng bị tiêu diệt hồn tồn Các tia phóng xạ hầu hết thuốc dùng điều trị ung thư thường có tác dụng phụ, gây tổn hại đến tế bào lành thể; chúng thường gây hậu nghiêm trọng rụng tóc, ức chế hoạt động tủy xương, gây nơn mửa Vì thế, loại thuốc hỗ trợ điều trị ung thư hữu hiệu tìm kiếm Ngày nay, hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế phát triển khối u sử dụng cho kết điều trị tốt, chẳng hạn alkaloid từ dừa cạn, taxol từ thông đỏ, alkaloid từ trinh nữ hoàng cung Năm 2011, tác giả Marie Jensen cộng cho biết năm gần đây, hợp chất dẫn xuất cardenolid hợp chất bán tổng hợp từ dẫn xuất cardenolid xem “ứng cử viên” xuất sắc dùng để điều trị bệnh ung thư phổi Với mong muốn đóng góp phần nhỏ vào việc tìm hiểu thành phần hóa học hoạt tính sinh học thuốc Việt Nam, luận án giới thiệu số kết nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học thử nghiệm hoạt tính sinh học chất cô lập từ hà thủ ô trắng tô mộc; hai thuốc nhà khoa học Việt Nam Nhật Bản khảo sát sơ bộ, cho thấy dịch chiết metanol rễ hà thủ ô trắng lõi gỗ thân tơ mộc có độc tính dòng tế bào ung thư phổi, ung thư cổ tử cung… Nội dung luận án bao gồm: - Cô lập hợp chất tinh khiết từ rễ hà thủ ô trắng lõi gỗ thân tô mộc Xác định cấu trúc hóa học hợp chất lập - Thử nghiệm độc tính tế bào hợp chất tinh khiết cô lập ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Trong phần lập hợp chất cardenolid tinh khiết từ cao metanol rễ hà thủ ô cao etyl acetat lõi gỗ thân tô mộc, đạt kết sau: Từ dịch chiết metanol bột rễ thô hà thủ ô trắng, cô lập 16 hợp chất dẫn xuất cardenolid tinh khiết, đó, có hợp chất kiểm tra phần mềm Scifinder vào tháng 03 năm 2012 Các hợp chất là:  14 -Hydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(16)- D-glucopyranosyl-(14)--D-2-O-acetyldigitalosid]  1,14 -Dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[ -D-glucopyranosyl- (14)- -D-digitalosid]  5,14 -Dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[ -D-glucopyranosyl(16)- -D-glucopyranosid] Bốn hợp chất lần cô lập từ dịch chiết metanol bột rễ hà thủ ô trắng là:  Digitoxigenin 3-O- -glucopyranosid  Acovenosigenin A 3-O-β-D-glucopyranosid  Periplogenin 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- -D-cymaropyranosid]  Periplogenin 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- -D-2-Oacetyldigitalopyranosid] Đã thử nghiệm sàng lọc sơ độc tính tế bào 20 hợp chất cô lập được, theo phương pháp SRB ba dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư phổi NCI–H460, ung thư cổ tử cung Hela ung thư vú MCF–7 Kết thử nghiệm sơ hoạt tính gây độc tế bào cho thấy, hầu hết hợp chất lập có độc tính tế bào ba dịng ung thư Ngồi ra, với hợp chất lập có khối lượng đủ lớn, chúng tơi thử nghiệm độc tính tế bào chất dòng tế bào ung thư phổi NCI–H460 để tìm giá trị IC50 Các giá trị IC50 hợp chất cardenolid nhỏ cho thấy hợp chất có độc tính mạnh dòng tế bào ung thư phổi NCI–H460 Các thử nghiệm hoạt tính sinh học hợp chất dẫn xuất cardenolid homoisoflavonoid lập ba dịng tế bào ung thư nói thử nghiệm mới, lần thực hợp chất BỐ CỤC LUẬN ÁN Luận án gồm 155 trang với chương, 68 tài liệu tham khảo, trang danh mục cơng trình phần phụ lục phổ Trong đó, tổng quan 24 trang, thực nghiệm 15 trang, kết thảo luận 101 trang, kết luận kiến nghị trang Ngồi ra, cịn có phần mở đầu trang NỘI DUNG LUẬN ÁN Chƣơng TỔNG QUAN Tổng hợp tài liệu nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Streptocaulon juventas (Lour.) Merr Caesalpinia sappan Linn tác giả nước Chƣơng THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu Đối tượng nghiên cứu rễ hà thủ ô trắng lõi gỗ thân tô mộc Rễ hà thủ ô trắng thu hái vào tháng 10 năm 2007; lõi gỗ thân tô mộc thu hái vào tháng 04 năm 2005 địa điểm, ấp Phú Hòa, xã An Phú, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang Mẫu nhận danh Tiến sĩ Hồng Việt, Bộ mơn Thực vật, khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM 2.1.2 Hóa chất thiết bị Trong thực nghiệm, chúng tơi sử dụng hóa chất tinh khiết thường nhà hóa thực vật dùng để chiết tách hợp chất thiên nhiên 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Điều chế loại cao Đun hoàn lưu kg bột thô rễ hà thủ ô trắng với metanol (30 lít, x lần), lọc nóng cô quay áp suất thấp, thu 857 gam cao metanol dạng sệt Phần cao thô metanol tiếp tục hịa tan nước, sau chiết lỏng-lỏng với dung môi cloroform Dịch chiết làm khan, cô quay áp suất thấp, thu hồi dung môi thu cao cloroform cao nước Đun hoàn lưu kg bột thô lõi gỗ thân tô mộc với metanol (10 lít, x lần), lọc nóng quay áp suất thấp, thu 324 gam cao metanol dạng sệt Phần cao thơ metanol tiếp tục hịa tan nước sau chiết lỏng-lỏng với dung mơi etyl acetat Dịch chiết làm khan, cô quay áp suất thấp, thu hồi dung mơi thu cao tương ứng 2.2.2 Trích ly, cô lập hợp chất cardenolid flavonoid Việc trích ly lập thực sắc ký cột cổ điển với silica gel pha thường pha đảo RP-18, kết hợp với sắc ký mỏng Trong số trường hợp, vết chất có Rf gần nhau, chất tách kỹ thuật sắc ký điều chế khai triển nhiều lần 2.2.3 Xác định cấu trúc Việc xác định cấu trúc thực phương pháp phổ nghiệm 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, COSY, ROESY, LC-MS, HRESI-MS so sánh với số liệu phổ từ tài liệu tham khảo 2.2.4 Thử nghiệm độc tính tế bào Việc xác định độc tính tế bào hợp chất nồng độ 100 g/ml với dung mơi hịa tan DMSO dòng tế bào ung thư người, Viện ung thư Hoa Kỳ sử dụng cho chương trình sàng lọc Về nguyên tắc, thử nghiệm SRB phương pháp so màu đơn giản nhạy để xác định độc tính tế bào hợp chất SRB thuốc nhuộm tích điện âm liên kết tĩnh điện với phần tích điện dương protein Lượng thuốc nhuộm liên kết phản ánh lượng protein tổng tế bào Trong thử nghiệm, tế bào cố định, rửa nhuộm với SRB Sau SRB liên kết với protein tế bào hịa tan tạo dung dịch suốt có màu hồng Mật độ quang đo dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào chất nghiên cứu CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học Từ dịch chiết metanol rễ hà thủ ô trắng, cô lập mười sáu hợp chất dẫn xuất cardenolid tinh khiết Từ dịch chiết metanol lõi gỗ thân tô mộc cô lập năm hợp chất phenol tinh khiết hỗn hợp gồm hai xuyên lập thể phân Trong phần này, chúng tơi trình bày tóm tắt điểm luận án 3.1.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất H9 Hợp chất H9 cô lập chất bột vơ định hình khơng màu, tan hoàn toàn metanol Biện luận cấu trúc Phổ LC-HRMS H9 cho mũi ion phân tử giả, với m/z 735,3569 [M+Na]+, phù hợp với công thức phân tử C36H56O14Na Phổ 1H-NMR H9 cho thấy tín hiệu cộng hưởng hai mũi đơn metyl δH 1,00 (3H, s, H-18) 1,21 (3H, s, H-19), hai proton carbinol cộng hưởng δH 4,53 (1H, brps, H-3) 3,87 (1H, brs, H-1); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng δH 5,30 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21) 5,00 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21); proton olefin metin cộng hưởng δH 6,12 (1H, brs, H-22), mũi triplet bầu proton metin cộng hưởng δH 2,77 (1H, brt, J 5,0 Hz; H-17) Trên phổ H9 cho thấy tín hiệu đặc trưng hai đơn vị đường digitalose glucose Tín hiệu đặc trưng proton anomer đơn vị đường digitalose cộng hưởng δH 4,75 (1H, d J 8,0 Hz, H-1), proton metyl đường cộng hưởng dạng mũi đôi δH 1,58 (3H, d, J 6,5 Hz, H-6) proton nhóm metoxy cộng hưởng dạng mũi đơn δH 3,64 (3H, s, 3-OCH3) Tín hiệu cộng hưởng proton anomer đơn vị đường glucose cộng hưởng δH 5,13 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1′), hai proton metylen đường cộng hưởng 4,53 (1H, m, H-6′) 4,35 (1H, m, H-6′) Phổ 13C-NMR DEPT 90 DEPT 135 cho thấy mũi cộng hưởng H9 gồm 36 carbon, có ba nhóm metyl, mười nhóm metylen, mười bảy nhóm metin, nhóm metoxy, tín hiệu carbon tứ cấp gắn oxygen δC 84,6 (C-14); vòng γ-lacton bất bão hịa, gồm có tín hiệu cộng hưởng carbon olefin δC 117,7 (C-22), carbon nhóm carbonyl lacton δC 174,5 (C-23) Ngoài ra, phổ H9 cịn cho thấy tín hiệu đặc trưng đơn vị đường digitalose với carbon anomer cộng hưởng δC 101,3 (C-1), tín hiệu nhóm metoxy cộng hưởng δC 58,9 (3-OCH3), tín hiệu nhóm metyl cộng hưởng δC 17,6 (C-6) Tín hiệu carbon anomer đơn vị đường glucose cộng hưởng δC 105,4 (C1), nhóm metylen đường cộng hưởng δC 63,1 (C-6) Phổ HMBC H9 cho thấy proton δH 1,21 (3H, s, H-19) tương quan đến tín hiệu carbon carbinol δC 72,1 (C-1), nên nhóm chức hydroxyl gắn C-1 Tương quan proton H-2 với H-1 H-3 phổ COSY cho thấy carbon metin gắn oxygen lại C-3 Tương quan HMBC proton δH 1,00 (3H, s, H-18) đến carbon tứ cấp gắn oxygen δC 86,3 chứng minh có diện nhóm OH C-14 Ngồi ra, phổ HMBC H9 cịn cho thấy tín hiệu proton anomer đường digitalose δH 4,75 (1H, d, 8,0 Hz, H-1) tương quan đến carbon δC 74,4 (C-3) nên carbon anomer đường gắn với oxygen C-3 Hằng số ghép 3JHH H-1 (J 8,0 Hz) cho thấy cấu hình β proton anomer Mặt khác, tín hiệu cộng hưởng H 4,33 (H-4) xuất dạng mũi đôi với số ghép nhỏ, J 2,5 nên H-4 vị trí xích đạo, oxygen gắn với C-4 vị trí trục Đơn vị đường cịn lại H9 xác định Dglucose dựa vào độ dịch chuyển hóa học tín hiệu proton carbon, có so sánh với tài liệu tham khảo; tín hiệu proton H 5,13 (H1) xuất dạng mũi đơi có số ghép J 8,0 Hz; tín hiệu H 4,23 (H-3) xuất dạng triplet có số ghép J 9,0 Hz, tín hiệu H 4,18 (H-4) xuất với dạng mũi triplet có số ghép J 9,0 Hz, cho thấy proton đơn vị đường thứ hai vị trí trục, phù hợp với cấu trúc D-glucopyranose Phổ HMBC cịn cho thấy tín hiệu proton anomer đơn vị đường glucose H 5,13 (H-1) tương quan đến carbon δC 76,0 (C-4), đồng thời tín hiệu H 4,33 (brd, 2,5 Hz, H-4) tương quan đến carbon δC 105,4 (C-1) cho thấy C-1 đơn vị đường gắn với oxygen C-4 đơn vị đường thứ Phổ COSY cho thấy tương quan 1H-1H chuỗi H-1/H-2/H-3/H-4/H-5/H6/H-7/H-8/H-9/H-11/H-12 H-15/H-16/H-17 khung aglycon hợp chất H9, tương quan proton kế cận hai đơn vị đường Độ chuyển dịch hóa học C C-19 H9 19,1 (đo pyridin-d5) nên vịng A B có cấu trạng cis, tín hiệu cộng hưởng proton H-17 H9 2,77 nên hydrogen gắn C-17 (17)-H Ngoài ra, phổ 1H-NMR H9 cho thấy proton H-2 cộng hưởng dạng mũi đôi đôi với số ghép J 15,0; 2,5 Hz cho thấy proton H-1 H-3 phải vị trí xích đạo, nhóm OH gắn C-1 C-3 phải vị trí trục; mũi đơn bầu δH 4,53 (1H, brps, H-3) chứng tỏ proton H-3 phải vị trí xích đạo (cấu hình α); mũi đơi bầu δH 2,34 (1H, brd, 11,5 Hz, H-5) cho thấy H-5 vị trí trục Như vậy, hóa học lập thể hợp chất H9 xác định sau: Các phân tích phổ cho thấy H9 có cấu trúc phù hợp với hợp chất 1,14 -dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- D-digitalosid], có công thức phân tử C36H56O14 Đây hợp chất kiểm tra phần mềm Scifinder vào tháng năm 2012 Hợp chất đặt tên acovenosigenin A 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(14)- -Ddigitalosid] Các số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất H9 trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR H9 Vị trí Hợp chất H9 (C5D5N) H (ppm) C J (Hz) 3,87 (brs) 72,1 2,26 (brdd, 15,0; 2,5) 32,0 1,97 (m) 4,53 (brps) 74,4 1,78 (m) 29,1 1,94 (m) 2,34 (brd, 11,5) 30,8 1,78 (m) 26,7 1,32 (m) 1,32 (m) 21,6a 1,83 (m) 42,1 HMBC ( H13C) (C-14); vòng γ-lacton bất bão hịa gồm có tín hiệu cộng hưởng carbon olefin δC 117,6 (C-22), carbon nhóm carbonyl lacton δC 174,6 (C-23) Ngồi ra, phổ H12 cịn cho thấy tín hiệu carbon anomer hai đơn vị đường glucose cộng hưởng δC 101,6 (C-1) 105,3 (C1) Phổ HMBC cho thấy proton anomer δH 4,97 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1) đơn vị đường thứ tương quan đến carbon δC 74,4 (C-3) nên C-1 gắn với oxygen C-3 Proton anomer 5,12 (1H, d, J 7,5 Hz, H-1) tương quan đến carbon δC 70,2 (C-6) proton metylen δH 4,84 (1H, d, J 11,0 Hz, H-6) tương quan đến tín hiệu δC 105,3 (C-1), cho thấy C-1 đơn vị đường thứ hai gắn với oxygen C-6 Tín hiệu cộng hưởng proton carbon hai đơn vị đường khung aglycon H12 xác định xác nhờ vào tương quan 1H-1H phổ COSY 1H-13C phổ HSQC, có so sánh với tài liệu tham khảo, cho thấy hoàn toàn phù hợp với khung periplogenin hai đơn vị đường glucose Hình 3.24 Tương quan H-H COSY HMBC quan trọng H12 Tương tác proton gần không gian cho phép xác định cấu trúc lập thể H12 Phổ ROESY H12 cho thấy tín hiệu δH 1,07 (3H, s, H-19) tương tác với tín hiệu 2,09 (1H, m, H-1); tín hiệu 1,54 (1H, m, H-9) tương tác với tín hiệu 2,02 (1H, m, H-2); tín hiệu 2,20 (1H, m, H-7) tương tác với tín hiệu 1,48 (1H, m, H-4) Các tương quan xác nhận cấu trạng cis vòng A vòng B; phổ ROESY cho thấy tín hiệu 0,97 (1H, s, H-18) tương tác với tín hiệu 1,78 (1H, m, 10 H-8); tín hiệu 1,07 (1H, s, H-19) tương tác với tín hiệu 1,78 (1H, m, H-8) Tương quan xác nhận cấu trạng trans vòng B C; đồng thời, tương tác H-8 H-18 cho thấy nhóm hydroxyl C-14 vị trí xích đạo Ngồi ra, phổ ROESY cho thấy tương tác H-12 với H-17, tương quan xác nhận hydrogen gắn C-17 (17α)-H Như vậy, cấu trúc lập thể khung aglycon H12 xác định Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR H12 Hợp chất H12 (C5D5N) Vị trí H (ppm) (*) J (Hz) 2,10 (m) 1,41 (m) 2,06 (m) 1,73 (m) 4,56 (brps) 1,90 (m) 1,55 (m) H (ppm) (**) J (Hz) 2,09 (m) 1,41 (m) 2,02 (m) 1,73 (m) 4,52 (brps) 1,87 (m) 1,48 (m) 2,06 (m) 1,87 (m) 2,22 (m) 1,33 (m) 1,82 (m) 1,58 (m) 1,96 (m) 1,82 (m) 2,20 (m) 1,22 (m) 1,78 (m) 1,54 (m) 1,24 (m) 1,39 (m) 1,39 (m) 1,36 (m) 1,20 (m) 1,31 (m) 1,33 (m) 1,48 (m) 10 11 12 HMBC ( H13C) ROESY (**) (1H1H) 26,1 19 26,6 74,4 36,2 73,2 13 14 15 C (ppm) 34,1 24,5 40,9 39,2 41,2 19 22,0 18, 19 40,0 17 50,0 84,7 2,06 (m) 1,85 (m) 2,05 (m) 1,85 (m) 11 33,2 16 16 17 18 19 2,08 (m) 1,90 (m) 2,80 (dd, 9,5; 5,0) 1,00 (s) 1,07 (s) 2,06 (m) 1,94 (m) 2,80 (dd, 8,5; 5,0) 0,97 (s) 1,00 (s) 5,03 (d, 18,0) 5,29 (d, 18,0) 6,13 (brs) 5,03 (d, 18,0) 5,28 (d, 18,0) 6,12 (brs) 4,97 (d, 8,0) 4,92 (d, 8,0) 20 21 22 23 -D-glu 1 27,3 51,3 12, 20, 21 12 16,1 13, 14, 17 1, 5, 8, 9, 10 11 17,2 1, 8, 11, 12 176,0 73,8 20 117,6 174,6 21, 23 101,58 3, 5 1 5 d 2 3,94 (m) 3,91 (m) 75,0 3 4,19 (m) 4,08 (dbr, 4,5) 78,4b 4 4,23 (m) 4,11 (m) 5 4,11 (m) 4,08 (dbr, 4,5) 6 4,84 (d, 11,0) 4,33 (m) 4,79 (d, 11,0) 4,26 (d, 5,5) 70,2 1 5,12 (d, 7,5) 5,02 (d, 7,5) 105,3 2 3,97 (m) 4,00 (t, 8,5) 75,2 d 3 4,23 (m) 4,15 (m) 78,4b 4 5 4,17 (m) 4,16 (d, 9,0) 71,7a 3,92 (m) 3,86 (m) 78,6b 4,51 (m) 4,34 (m) 4,45 (d, 10,5) 4,26 (d, 5,5) 62,8 71,7a 77,4 -D-glu 6 6 5 Ghi chú: a, b, c, d giá trị hốn vị cột (*) Phổ 1H-NMR đo Phịng Phân tích Trung tâm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM (**) Phổ 1H-NMR đo Viện Hóa học Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (**) Phổ ROESY đo Viện Hóa học Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 12 Các phân tích số liệu phổ xác định hợp chất H12 có cấu trúc phù hợp với hợp chất 5,14 -dihydroxycard-20(22)-enolid 3-O[ -D-glucopyranosyl-(16)- -D-glucopyranosid] Đây hợp chất mới, kiểm tra phần mềm Scifinder vào tháng năm 2012 Hợp chất đặt tên periplogenin 3-O-[ -D-glucopyranosyl-(16)- -Dglucopyranosid] Các số liệu phổ1H-NMR 13C-NMR hợp chất H12 trình bày bảng 3.2 Hình 3.25 Tương quan H-H ROESY quan trọng H12 3.1.3 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất H6 Hợp chất H6 lập chất bột vơ định hình khơng màu, tan hồn tồn metanol Biện luận cấu trúc Phổ LC-HRMS H6 cho mũi ion phân tử giả, với m/z 899,4238 [M-H]¯, phù hợp với công thức phân tử [C44H67O19] Phổ 1H-NMR H6 cho thấy tín hiệu cộng hưởng hai mũi đơn metyl δH 1,01 (3H, s, H-18) 0,90 (3H, s, H-19), proton carbinol cộng hưởng δH 4,25 (1H, s, H-3); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng δH 5,30 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21) 5,02 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21); proton olefin metin, gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng δH 6,14 (1H, brs, H-22), mũi triplet proton metin cộng hưởng δH 2,78 (1H, brt, J 5,5 Hz, H-17) Các tín hiệu cộng hưởng phổ 1H-NMR cho thấy H6 dẫn xuất digitoxigenin Phổ 1H-NMR H6 cịn cho thấy tín hiệu ba proton anomer, tương ứng với ba đơn vị đường Tín hiệu đặc trưng proton anomer đơn vị đường digitalose cộng hưởng δH 4,85 (1H, d J 8,0 Hz, H-1), proton 13 metyl đường cộng hưởng dạng mũi đôi δH 1,65 (3H, d, 6,0 Hz, H-6), proton nhóm metoxy cộng hưởng δH 3,44 (3H, s, 3-OCH3) Ngoài ra, phổ 1H-NMR H6 cịn cho thấy tín hiệu cộng hưởng dạng mũi đơi 4,60 (H-4), có số ghép nhỏ, J 2,5 Hz, cho thấy H-4 vị trí xích đạo nên oxygen C-4 vị trí trục Ở hai đơn vị đường glucose cịn lại, tín hiệu cộng hưởng hai proton anomer cộng hưởng δH 5,10 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1′) 5,18 (1H, d, 8,0 Hz, H-1′); tín hiệu proton metylen đơn vị đường glucose cộng hưởng δH 4,82 (1H, d, H-6) 4,30 (1H, dd, J 12,0; 7,5 Hz, H-6), đơn vị đường glucose lại cộng hưởng 4,40 (1H, dd, J 11,0; 1,0 Hz, H-6) 4,60 (1H, dd, J 11,0; 2,5 Hz, H-6) Dựa vào phân tích phổ 1H-NMR H6 trên, có so sánh với tài liệu tham khảo, cho thấy H6 glycosid, có aglycon digitoxigenin gắn với ba đơn vị đường, có đơn vị đường digitalose, hai đơn vị đường lại glucose Hằng số ghép J H-1, H1 H-1 8,0; 8,0 8,0 Hz cho thấy cho thấy proton anomer ba đơn vị đường có cấu hình  Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT 90 DEPT 135 cho thấy mũi cộng hưởng H6 gồm 44 carbon, có ba nhóm metyl, nhóm metoxy, nhóm acetyl (CH3CO-), mười nhóm metylen, hai mươi ba nhóm metin, vịng γ-lacton bất bão hịa, có tín hiệu cộng hưởng carbon olefin δC 117,7 (C-22), carbon nhóm carbonyl lacton δC 174,5 (C-23); tín hiệu carbon tứ cấp gắn oxygen δC 84,7 (C14) Ngoài ra, phổ H6 cịn cho thấy tín hiệu đặc trưng đơn vị đường digitalose với carbon anomer đường cộng hưởng δC 99,7 (C-1), tín hiệu nhóm metoxy cộng hưởng δC 58,2 (3-OCH3), tín hiệu nhóm metyl cộng hưởng δC 17,8 (C-6) Tín hiệu carbon anomer đơn vị đường glucose cộng hưởng δC 106,6 (C-1), nhóm metylen đường cộng hưởng δC 70,9 (C-6) Tín hiệu carbon anomer đơn vị đường glucose lại cộng hưởng δC 105,7 (C-1), nhóm metylen δC 62,9 (C-6) Phổ HMBC cho thấy tín hiệu proton anomer đường digitalose tương quan đến carbon δC 73,5 (C-3) nên C-1 gắn với oxygen C-3 Ngoài ra, đơn vị đường digitalose, cịn cho thấy proton metyl nhóm 14 acetyl 2,07 (3H, s, CH3CO-) tương quan đến C-2 proton metin 3,96 (1H, m, H-2) tương quan đến tín hiệu δC 169,4 (-COO-), nên nhóm acetyl gắn vào oxygen C-2 Phổ HMBC cho thấy tín hiệu proton anomer đơn vị đường glucose δH 5,10 (1H,d, J 8,0 Hz, H-1) tương quan đến carbon δC 74,5 (C-4), cho thấy carbon anomer C-1 đơn vị đường glucose thứ hai gắn với oxygen C-4 đơn vị đường digitalose Tín hiệu proton anomer đơn vị đường glucose lại 5,18 (1H, d, 8,0 Hz, H-1′) tương quan đến carbon δC 70,5 (C-6), cho thấy carbon anomer C-1 đơn vị đường glucose lại gắn với oxygen C-6 đơn vị đường glucose thứ hai Phổ HSQC cho thấy tương quan nối proton carbon, nên cho phép xác định độ chuyển dịch hóa học proton carbon tương ứng hợp chất H6, có so sánh với độ dịch chuyển hóa học proton carbon hợp chất (17)-H-periplogenin 3-O-βglucopyranosyl(14)-2-O-acetyl-3-O-metyl-β-fucopyranosid Phổ COSY hợp chất H6 cho phép xác định xác tín hiệu cộng hưởng proton đơn vị đường thứ nhất, nhờ tương quan 1H-1H COSY chuỗi H-1/ H-2/ H-3/ H-4/ H-5/ H-6 Tín hiệu cộng hưởng H 4,60 (H-4) xuất dạng mũi đôi đôi với số ghép nhỏ, J 2,5 Hz, xác nhận H-4 vị trí xích đạo nên oxygen C-4 vị trí xích trục; tín hiệu H 3,52 (H-3) xuất dạng mũi đôi đôi với số ghép J 11,5; 3,0 Hz cho thấy H-3 vị trí trục, nên oxygen gắn C-3 vị trí xích đạo Tín hiệu cộng hưởng H 4,65 (H-1) xuất dạng mũi đôi với J 8,0 Hz, cho thấy H-1 H-2 vị trí trục Tương tự đơn vị đường thứ nhất, giá trị H proton hai đơn vị đường lại xác định dựa vào tương quan 1H-1H phổ COSY Hai đơn vị đường xác định glucopyranos, dựa vào phân tích liệu phổ, có so sánh với phần đường hợp chất (17)-Hperiplogenin 3-O-β-glucopyranosyl(14)-2-O-acetyl-3-O-metyl-βfucopyranosid Các số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất H6 trình bày bảng 3.3 15 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR H6 Vị trí 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 H (ppm) (**) J (Hz) 1,48 (m) 1,61 (m) 1,96 (m) 2,10 (m) 4,25 (brps) 1,61 (m) 1,87 (m) 1,77 (m) 1,29 (m) 1,80 (m) 2,11 (m) 1,78 (m) 1,73 (m) (-) 1,41 (m) 1,87 (m) 2,14 (m) 1,86 (m) 2,78 (brt, 5,5 Hz) 1,01 (s) 0,90 (s) 5,30 (dd, 18,0; 1,5) 5,02 (dd, 18,0; 1,5) 6,14 (brs) 22 23 2-Ac--D-dig 4,65 (d, 8,0) 1 Hợp chất H6 (C5D5N) HMBC H (ppm) C ( H13C) (***) (ppm) J (Hz) 1,48 (m) 30,6 9, 10 1,54 (m) 1,98 (m) 27,4 2,16 (m) 4,07 (brps) 73,5 1,62 (m) 30,1 1,90 (m) 1,65 (m) 36,9 1,08 (m) 27,1 10 1,61 (m) 2,07 (m) 21,6 14 1,71 (m) 42,0 1,67 (m) 35,9 35,6 (-) 22,1 1,22 (m) 39,9 14 50,2 84,7 2,18 (m) 33,2 1,89 (m) 2,75 (brt, 4,5 Hz) 0,84 (s) 0,72 (s) 27,3 5,15 (d, 19,0) 5,00 (d, 19,0) 19 1 19 18, 19 17 13, 14 51,5 13, 21, 22 12 16,3 24,1 176,0 12,17, 14 1, 9, 1, 73,8 13, 17, 20, 22 6,00 (brs) 117,7 174,5 21, 23 4,60 (d, 8,0) 99,7 16 ROESY (***) (1H1H) 3, 3, 5 2 3 4 5 6 -OCH3 CH3CO O-COO-D-glu 1 2 3 4 5 6 5,78 (dd, 10,0; 8,0) 3,52 (dd, 11,5; 3,0) 4,60 (d, 2,5) 3,68 (d, 7,0) 1,65 (d,6,0) 3,44 (s) 5,70 (m) 72,3 1, 3 3,61-3,68 (*) 83,0 2, 6 4,54 (s) 3,90-3,92 (*) 1,60 (d,6,0) 3,44 (s) 74,5 70,8 17,8 58,2 1, 2, 3 1, 4 2,02 (s) 21,2 169,4 5,10 (d, 8,0) 3,96 (m) 4,16 (m) 4,22 (m)c 4,11 (m) 4,83 (d, 10,5) 4,30 (dd, 12,0; 7,5) 4,94 (d, 8,0) 3,90-3,97 (*) 3,90-4,00 (*) 4,19-4,23 (*) 4,00-4,07(*) 104,8 75,7 78,6b 71,8a 77,8 1 4,80 (d, 8,0) 70,5 1, 4, 5 5,18 (d, 8,0) 4,04 (d, 8,5) 4,16 (m) 4,00 (m) 3,94 (m) 4,40 (dd, 11,0; 1,0) 4,52 (dd, 11,5; 2,5) (-) 3,97-4,00 (*) 4,20-4,21 (*) 3,97-4,00 (*) 3,90-3,95 (*) 105,7 75,2 78,4b 71,9a 78,6b 6, 5 1 2 2,07 (s) 1 3 -COO- 4 3 4 2 4 -D-glu 1 2 3 4 5 6 5 3 62,9 (-) Ghi chú: a, b giá trị hốn vị cột c mũi đôi chập phần mũi đơn bầu H-3 (-) Không xác định proton (*) Các tín hiệu chập (**) Phổ 1H-NMR đo Phịng Phân tích Trung tâm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM (***) Phổ 1H-NMR phổ ROESY đo Viện Hóa học Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 17 ... 2.1 Nguyên li? ?u, hóa chất thiết bị 2.1.1 Nguyên li? ?u Đối tượng nghiên c? ?u rễ hà thủ ô trắng lõi gỗ thân tô mộc Rễ hà thủ ô trắng thu hái vào tháng 10 năm 2007; lõi gỗ thân tô mộc thu hái vào tháng... sát thành phần hóa học thử nghiệm hoạt tính sinh học chất cô lập từ hà thủ ô trắng tô mộc; hai thuốc nhà khoa học Việt Nam Nhật Bản khảo sát sơ bộ, cho thấy dịch chiết metanol rễ hà thủ ô trắng. .. lõi gỗ tô mộc (Caesalpinia sappan L.), Tạp chí Hóa học, T.48 (4B), 441-445 (2010) Bùi Xuân Hào, Nguyễn Minh Đức, Trần Lê Quan, Thành phần hóa học rễ hà thủ trắng (Streptocaulon juventas Merr.),