Bố trí thí nghiệm khảo sát mức độ, chiều hướng ảnh hưởng và sự tương tác của các yếu tố nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp gelatinase của chủng tuyển chọn .... Kết quả khảo sát ảnh hưởn
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và
kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bố trong bất kỳ công
trình nào
Tác giả luận văn
Trần Quốc Đảm
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Luận văn, trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm cùng toàn thể Thầy Cô Trường Đại học Nha Trang sự kính trọng, lòng biết ơn và niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường trong những năm qua
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được dành cho thầy: Nguyễn Minh Trí, thầy Nguyễn Anh Tuấn, cô Nguyễn Thị Thanh Hải - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn
Xin chân thành cảm ơn Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, toàn thể Thầy Cô, anh chị quản lý phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện nghiên cứu tại đây Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Vũ Phương, Thầy Nguyễn Đình Khương, cô Đỗ Thị Ánh Hòa, chị Nguyễn Minh Nhật, chị Nguyễn thị Đoan Trang và anh Đỗ Xuân Lộc đã giúp đở tôi trong suốt quá trình làm Luận văn
Xin cảm ơn cha mẹ và các anh chị của tôi đã luôn ủng hộ tôi học tập và nghiên cứu nhiều năm qua Cảm ơn toàn thể bạn bè đã luôn ở bên cạnh giúp đỡ tôi trong quá trình làm Luận văn
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Tác giả luận văn
Trần Quốc Đảm
Trang 6MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii
MỤC LỤC iv
DANH MỤC BẢNG viii
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN 4
1.1 Gelatin 4
1.1.1 Khái quát về gelatin 4
1.1.2 Tính chất công nghệ của gelatin 7
1.2 Gelatin thủy phân 7
1.2.1 Khái quát về gelatin thủy phân 7
1.2.2 Ứng dụng của gelatin thủy phân 9
1.2.3 Một số nghiên cứu về gelatin thủy phân 11
1.2 Tổng quan về enzyme và tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 12
1.2.1 Tổng quan về enzyme 12
1.2.2 Tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 19
1.3 Enzyme protease và enzyme gelatinase 21
1.3.1 Enzyme protease 21
1.3.2 Enzyme gelatinase 23
1.4 Tổng quan về sự phân bố của vi sinh vật và các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật 28
1.4.1 Sự phân bố vi sinh vật trong tự nhiên 28
1.4.2 Dinh dưỡng của vi sinh vật 29
1.4.3 Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự sinh trường và phát triển của vi sinh vật 30
1.5 Vi khuẩn Bacillus subtilis 31
1.6 Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme từ vi sinh vật 32
Trang 71.6.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên 33
1.6.2 Bảo quản giống 33
1.6.3 Nuôi cấy vi sinh vật để sinh enzyme 34
1.6.4 Thu hồi chế phẩm enzyme 36
Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.1 Nguyên vật liệu 38
2.1.1 Mẫu phân lập vi khuẩn 38
2.1.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 38
2.1.3 Hóa chất 39
2.2 Phương pháp nghiên cứu 39
2.3 Bố trí thí nghiệm 40
2.3.1 Bố trí thí nghiệm phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase cao 41
2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định một số tính chất của enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn 43
2.3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn 47
2.3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát mức độ, chiều hướng ảnh hưởng và sự tương tác của các yếu tố nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp gelatinase của chủng tuyển chọn 54
2.3.5 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi sinh gelatinase từ chủng tuyển chọn 54
2.3.6 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện kết tủa thích hợp để thu nhận chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn 55
2.3.7 Bố trí thì nghiệm áp dụng thủy phân gelatin bằng chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn 57
2.4 Phương pháp phân tích 59
2.4.1 Xác định hoạt độ gelatinase 59
2.4.2 Định lượng nitơ amin, nitơ amoniac và nitơ tổng số 59
2.5 Phương pháp xử lý số liêu 60
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 61
Trang 83.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase cao 61 3.1.1 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase 61 3.1.2 Kết quả kiểm khả năng sinh gelatinase của các chủng vi khuẩn phân lập được 62 3.1.3 Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase cao nhất
từ các chủng phân lập và tuyển chọn được 62 3.1.4 Kết quả định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn 63
3.2 Kết quả xác định một số tính chất của enzyme gelatinase từ chủng Bacillus sp… 66
3.2.1 Kết quả xác định cơ chất đặc hiệu của chế phẩm gelatinase từ chủng
3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả
năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 69
3.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh enzyme đến khả
năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 70
3.3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng gelatin trong môi
trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp. 72 3.3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi sinh
enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 73
3.3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi sinh enzyme đến khả năng
sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 74
3.4 Kết quả khảo sát mức độ và chiều hướng ảnh hưởng của các yếu tố đến khả
năng sinh tổng hợp gelatinase của chủng Bacillus sp C7 75 3.5 Kết quả tối ưu hóa điều kiên nuôi sinh gelatinase từ chủng Bacillus sp C7 77
3.6 Kết quả xác định ảnh hưởng của điều kiện kết tủa đến hoạt tính của chế phẩm
gelatinae từ chủng Bacillus sp C7 84
Trang 93.6.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của tác nhân và nồng độ kết tủa đến hoạt
tính của chế phẩm gelatinae từ chủng Bacillus sp C7 84
3.6.2 Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt tính của chế
gelatinase từ chủng Bacillus sp C7 87 3.8 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm gelatinase kỹ thuật từ chủng Bacillus sp
C7 tuyển chọn phân lập được 88 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91
Trang 10
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần hóa học của gelatin 5
Bảng 1.2 Thành phần acid amin của gelatin và collagen trên 1000g nguyên liệu .5
Bảng 1.3 Thành phần acid amin của gelatin trên 1000g nguyên liệu 6
Bảng 1.4 Một số tính chất của gelatin 7
Bảng 1.5 Ứng dụng chủ yếu của gelatin thủy phân 10
Bảng 1.6 Khả năng sinh gelatinase của một số chủng vi khuẩn Bacillus sp C7 24
Bảng 1.7 Ảnh hưởng của muối canxi và magie đến số lượng vi sinh vật, pH và khả năng sinh gelatinase từ Proteus trong môi trường lactate 27
Bảng 1.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự phát triển và sự thủy phân gelatin của các chủng vi khuẩn của các loài F meningosepticum, P aeruginosa, P diminuta, P fluorescens trong môi trường gelatin-agar 28
Bảng 1.9 Nhu cầu khoáng đối với một số vi sinh vật 36
Bảng 3.1 Số chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu 61
Bảng 3.2 Mô tả hình thái khuẩn lạc các chủng phân lập được 61
Bảng 3.3 Kết quả đo đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn trên thạch gelatin-agar sau 72 giờ nuôi cấy 95
Bảng 3.4 Bảng phân tích BLAST đoạn gen giải trình tự của chủng C7 65
Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm xác định cơ chất đặc trưng của CPE gelatinase từ chủng Bacillus sp C7 96
Bảng 3.6 Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ gelatinase của chủng Bacillus sp C7 96
Bảng 3.7 Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase của chủng Bacillus sp C7 96
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 98
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 97
Trang 11Bảng 3.10 Kết quả hảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng gelatin trong môi
trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus
sp C7 97
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi sinh
enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 97
Bảng 3.12 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi sinh enzyme đến khả năng
sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 98
Bảng 3.13 Miền nghiên cứu thí nghiệm khảo mức độ và chiều hướng ảnh hưởng
của các yếu tố 75
Bảng 3.14 Kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng
sinh gelatinase từ chủng Bacillus sp C7 98
Bảng 3.15 Mức độ và chiều hướng ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình nuôi
sinh gelatinase từ chủng Bacillus sp C7 76
Bảng 3.16 Miền nghiên cứu tối ưu hóa các yếu tố nuôi sinh gelatinase 77
Bảng 3.17 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng
sinh gelatinase từ chủng Bacillus sp C7 99
Bảng 3.18 Phân tích chọn mô hình tối ưu hóa 77
Bảng 3.19 Bảng phân tích tính phù hợp của mô hình tối ưu đã chọn 78
Bảng 3.20 Kết quả phân tích các chỉ số thống kê tương ứng với mô hình tối ưu 79
Bảng 3.21 Kiểm định sự chính xác của phương trình hồi quy 80
Bảng 3.22 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa và nồng độ của các
tác nhân kết tủa đến hoạt độ của CPE gelatinase từ chủng Bacillus sp C7
Bảng 3.25 Sự thay đổi hàm lượng đạm acid amin theo thời gian và hiệu quả thủy
phân gelatin 1% bằng chế phẩm gelatinase 102
Trang 12DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử gelatin 4
Hình 1.2 Bột gelatin thủy phân 8
Hình 1.3 Sự phân bố khối lượng gelatin thủy phân so với gelatin trước thủy phân 8
Hình 1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ phản ứng enzyme 14
Hình 1.5 Ảnh hưởng của pH tới tốc độ phản ứng 15
Hình 1.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới tốc độ phản ứng 15
Hình 1.7 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới tốc độ phản ứng 16
Hình 1.8 Đồ thị biểu diễn phương trình Linewear và Burk 17
Hình 1.9 Cấu trúc không gian phân tử gelatinase 24
Hình 1.10 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh gelatinase của Proteus 26
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nghiên cứu thu nhận gelatinase từ vi khuẩn tự nhiên 40
Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase 41
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập chủng có khả năng sinh gelatinase 42
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh gelatinase cao nhất từ các chủng vi khuẩn phân lập 43
Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nghiên cứu một số tính chất của enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn 44
Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định cơ chất đặc hiệu của enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn 44
Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn 45
Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ gelatinase từ chủng tuyển chọn 46
Hình 2.9 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi sinh enzyme đển khả năng sinh gelatinase từ chủng tuyển chọn 47
Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn 49
Trang 13Hình 2.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh
enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng tuyển chọn 50
Hình 2.12 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng trong môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn 51
Hình 2.13 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn 52
Hình 2.14 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn 53
Hình 2.15 Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của các tác nhân và nồng độ kết tủa đến hoạt độ của chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn 55
Hình 2.16 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ của chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn 57
Hình 2.17 Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ giữa chế phẩm gelatinase với cơ chất gelatin 1% (E/S) đến tốc độ phản ứng 58
Hình 2.18 Sơ đồ xác định thời gian và mức độ thủy phân gelatin 1% của chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn 59
Hình 3.1 Vòng phân giải gelatin của các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường thạch gelatin-agar sau 48 giờ nuôi cấy 62
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng sinh gelatinase của các chủng vi khuẩn phân lập 63
Hình 3.3 Vòng phân giải của nhóm chủng vi khuẩn sinh gelatinase cao trên môi trường thạch gelatin-agar sau 72 giờ nuôi cấy 63
Hình 3.4 Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường TSA và BA 64
Hình 3.5 Hình thái nhuộm Gram tế bào chủng vi khuẩn tuyển chọn 64
Hình 3.6 Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn tuyển chọn 65
Hình 3.7 Độ thị biểu diễn ảnh hưởng của cơ chất khác nhau đến hoạt độ của gelatinase từ chủng Bacillus sp C7 66
Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính của gelatinase từ chủng Bacillus sp C7 67
Trang 14Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH phản ứng đến hoạt tính gelatinase từ chủng Bacillus
sp C7 Error! Bookmark not defined
Hình 3.10 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh gelatinase đến khả
năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 70
Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 71
Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn đường công sinh trường của chủng Bacillus sp C7 nuôi cấy trong môi trường MT3 71
Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ gelatin trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 72
Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH ban đầu trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 73
Hình 3.15 Đồ thì biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 74
Hình 3.16 Ảnh hưởng và tương tác của các yếu tố nghiên cứu đến khả năng sinh gelatinase của chủng Bacillus sp C7 76
Hình 3.17 Biểu đồ mô tả tương tác của nhiệt độ và thời gian 81
Hình 3.18 Biểu đồ mô tả tương tác của pH và thời gian 82
Hình 3.19 Biểu đồ mô tả tương tác của nhiệt độ và pH 83
Hình 3.20 Ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa và nồng độ của các tác nhân kết tủa đến hoạt độ của CPE gelatinase thu được 84
Hình 3.21 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ gelatinase trong quá trình kết tủa gelatinase 86
Hình 3.22 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân gelatin 1% 86
Hình 3.23 Sự thay đổi hàm lượng đạm acid amin theo thời gian thủy phân gelatin 1% bằng chế phẩm gelatinase 87
Trang 15MỞ ĐẦU
- Tính cấp thiết
Gelatin là một polymer sinh học có nguồn gốc từ collagen, là thành phần chủ yếu của da, xương và mô liên kết động vật Gelatin được sản xuất bởi sự thủy phân một phần phân tử collagen [25]
Các báo cáo gần đây cho thấy sản lượng gelatin trên thế giới hàng năm khoảng 326 000 tấn, với gelatin có nguồn gốc từ da lợn chiếm 46% cao nhất, tiếp theo là da trâu, bò 29,4%, xương 23,1%, và các nguồn khác 1,5% [25] Gelatin được cung cấp từ một số công ty hàng đầu trên thế giới như Công ty Nitta Gelatin Inc Nhật Bản với hệ thống phân phối toàn cầu, Kyunggi Gelatin Ltd công ty hàng đầu Hàn Quốc, Xinwulong Gelatin Trung Quốc … Ở Việt Nam hiện gelatin được sản xuất tại Công ty CP Nam Việt từ da cá tra với công suất hơn 10 000 tấn/năm Ngoài
ra, còn có dự án xây dựng nhà máy sản xuất collagen từ da cá tra của Công ty cổ phần Vĩnh Hoàn với công suất dự kiến 1 000 tấn thành phẩm/năm và dự kiến đi vào hoạt động năm 2013 (Vasep, 09/8/2012) Đây là nguồn gelatin dồi dào đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nước cũng như xuất khẩu của Việt Nam trong thời gian tới
Một sản phẩm đặc biệt của gelatin là gelatin thủy phân đã được nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Khả năng hòa tan, khả năng tạo nhủ, tạo bọt hay hoạt tính chống oxy hóa … là những tính chất quan trọng của dịch thủy phân gelatin được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm [29, 32] Dịch thủy phân gelatin có chứa một lượng lớn các acid amin như glycine, proline, hydroxyproline, lysine, hydroxylysine … và chúng dễ dàng được hấp thụ vào cơ thể Đây là các thành phần chức năng quan trọng, nó được ứng dụng trong công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm để sản xuất các sản phẩm hỗ trợ cấu trúc collagen trong da và sụn [29]
Ngoài ra, gelatin thủy phân cũng có thể ứng dụng trong nông nghiệp mà chủ yếu là trong trồng trọt Gelatin thủy phân chứa nhiều acid amin cần thiết cho thực vật Theo nhiều nghiên cứu thì các acid amin có vai trò quan trọng trong điều hoà quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật [12] Ví dụ như glycine, proline là hai acid amin giữ vai trò quan trọng làm tăng khả năng chống chịu của cây trồng
với môi trường bất lợi [17] Thực vật có thể hấp thụ trực tiếp các đoạn peptide ngắn
và các acid amin qua lá với hiệu suất cao [12]
Trang 16Quá trình thủy phân gelatin có thể được thực hiện bằng phương pháp hóa học hoặc bằng phương enzyme Chúng ta đã biết, enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn rất nhiều so với các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác, đồng thời nó có thể thực hiện hoạt động xúc tác ở điều kiện áp suất và nhiệt độ thường [1, 10] Từ những đặc điểm trên cho thấy phương pháp enzyme góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm
và giảm thiểu tác động gây ô nhiễm môi trường từ quá trình sản xuất so với phương pháp hóa học Việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme có nghĩa to lớn về mặt lý thuyết cũng như về thực tế áp dụng [1]
Gelatinase là một proteolytic enzyme, có thể thủy phân gelatin thành các peptide và các acid amin Chúng ta có thể thu nhận gelatinase từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó thu nhận gelatinase từ vi sinh vật thì được chú ý hơn Trong tự nhiên
có nhiều vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gelatin [2, 22, 28] Việc tuyển chọn chủng an toàn (GRAS) thường được quan tâm trong ứng dụng các chủng vi sinh vật vào sản xuất ngành công nghệ thực phẩm [25, 31]
Như vậy, đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme gelatinase từ vi khuẩn” là
cần thiết, bước đầu có thể ứng dụng enzyme này để thủy phân gelatin ứng dụng trong đời sống sản xuất
- Mục tiêu nghiên cứu:
+ Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gelatinase cao từ tự nhiên
+ Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme gelatinase từ vi khuẩn tuyển chọn phân lập được
- Nội dung nghiên cứu:
+ Phân lập và tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp gelatinase cao tử vi khuẩn trong tự nhiên
+ Nghiên cứu một số đặc tính của enzyme gelatinase từ vi khuẩn tuyển chọn phân lập được
+ Nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi sinh gelatinase từ vi khuẩn tuyển chọn phân lập được
+ Nghiên cứu thu nhận chế phẩm gelatinase kỹ thuật từ vi khuẩn tuyển chọn phân lập được
Trang 17- Ý nghĩa khoa học:
+ Sự thành công của đề tài sẽ cung cấp thêm nguồn tài liệu khoa học về lĩnh vực nghiên cứu thu nhận enzyme từ vi khuẩn nói chung và enzyme gelatinase từ vi
khuẩn nói riêng, phục vụ trong giảng dạy và nghiên cứu
+ Làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về tinh chế enzyme gelatinase và các nghiên cứu ứng dụng enzyme này vào đời sống sản xuất
Trang 18Chương 1: TỔNG QUAN
1.1 Gelatin
1.1.1 Khái quát về gelatin
Gelatin là một polymer sinh học có nguồn gốc từ collagen, là thành phần chủ yếu của da, xương và mô liên kết động vật Gelatin được sản xuất bởi sự thủy phân một phần phân tử collagen [25]
Nguồn gelatin được sản xuất phổ biến trước đây là từ heo, bò, trâu, gia xúc
và cá Gelatin được sử dụng ngày càng phổ biến và nguồn gốc gelatin sử dụng là một vấn đề tồn động trong người tiêu dùng Đặc biệt là các gelatin có nguồn gốc từ động vật có vú ảnh hưởng đến phong tục, tín ngưỡng và khả năng lây truyền bệnh
Do đó, gelatin cá được xem là một thay thế tốt cho các gelatin động vật có vú [25]
Giống như cấu trúc của colagen, gelatin có cấu trúc dạng chuỗi Chuỗi gelatin gồm những phân tử có kích thước nhỏ liên kết lại với nhau bằng liên kết hydro tạo thành mạng lưới gelatin [20, 33]
Công thức tiêu biểu của gelatin là: Alanin-Glycin-Prolin–Arginin-Glycin–Glutamic-4Hydroxyproline-Glycin-Prolin [18]
Cấu trúc phân tử gelatin được thể hiện qua Hình 1.1
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử gelatin
- Thành phần hóa học của gelatin gồm protein, khoáng và nước được trình
bày trong Bảng 1.1
Gelatin có trọng lượng phân tử khoảng 100000 g/mol Thành phần acid amin của gelatin rất giống với collagen tạo ra nó, có chứa tất cả 20 loại acid amin và được
Trang 19đặc trưng bởi một chuỗi lặp đi lặp lại của 3 acid amin là glycine-X-Y, trong đó X chủ yếu là proline và Y chủ yếu là hydroxyproline [23] Glycine chiếm khoảng 33% thành phần acid amin, proline và hydroxyproline chiếm khoảng 22%
Bảng 1.1 Thành phần hóa học của gelatin [32]
STT Thành phần Tỉ lệ (%)
Bảng 1.2 Thành phần acid amin của gelatin và collagen trên 1000g nguyên liệu [32]
Amino acid Gelatin A Gelatin B Colagen (Gia súc)
10
24
27 3.6
14
132
35
18 – 2,6
72
0
335 4.2
93 4.3
11 24.3
28 3.9
14
124
33
18 – 1,2
48
25
332 4.4
104 5.4
11
24
28 5.7
13
115
35
17 – 4,4
22
Trang 20Nguồn gốc collagen và phương pháp sản xuất gelatin khác nhau dẫn đến hàm lượng acid amin trong sản phẩm gelatin thủy phân thu được là khác nhau Điều này được trình bày trong Bảng 1.2 và 1.3 thành phần acid amin của gelatin gia súc dưới đây [32]
Bảng 1.3 Thành phần acid amin của gelatin trên 1000g nguyên liệu [14]
Acid amin Mực ống
(Squid)
Cá ngừ (Tuna)
Cá chim (Halibut)
Hydroxyproline Asparagine Threonine Serine Glutamine Proline Glycine Alanine Cysteine Valine Methionine Isoleucine Leucine Tyrosine Phenylalanine Histidine Lysine Arginine Hyldroxylicine Imino acid
và B tương ứng với xử lý acid và xử lý kiềm
Trang 211.1.2 Tính chất công nghệ của gelatin [32]
- Đặc tính lý hóa của gelatin thì được quyết định chủ yếu bởi các chuỗi acid amin trong phân tử của nó, do cấu trúc không gian, sự phân bố khối lượng phân tử, cũng như điều kiện môi trường như pH, độ ion và phản ứng với các thành phần
khác Một số tính chất của gelatin được trình bày trong Bảng 1.4
- Gelatin không tan trong nước dưới 20oC mà chỉ hút nước và trương nở Khi nhiệt độ tăng lên, nó tan ra và tạo thành dung dịch thể keo Dung dịch này đem làm lạnh, dù nồng độ rất thấp (0,25%) cũng có thể đông đặc
- Ngược lại khi gelatin bị thủy phân thành các phân tử nhỏ hòa tan được
trong nước lạnh và dung dịch của nó không tạo gel với bất cứ nồng độ nào
1.2 Gelatin thủy phân [14, 32]
1.2.1 Khái quát về gelatin thủy phân
Gelatin thủy phân là một dạng đặc biệt của gelatin (Hình 1.2), trong đó có nhiều loại có thể hòa tan được trong nước lạnh Gelatin thủy phân mất đi khả năng tạo gel và được gọi là Zero-Bloom, hoặc về mặt quy định thực phẩm Châu Âu gọi là gelatin thực phẩm không tạo gel (Non-gelling edible gelatin) Tuy nhiên, chúng vẫn
có tính chất hoạt động bề mặt rất tốt
Khối lượng trung bình của các phân tử gelatin thủy phân là từ 500÷25000 g/mol (Hình 1.3) với phân tử khác nhau từ các acid amin tự do đến peptide và
Trang 22gelatin Bằng cách kiểm soát sự thủy phân của enzyme thì có thể thu được sản phẩm
có trọng lượng phân tử trong một phạm vi nào đó
Thông thường, gelatin được thủy phân bởi sự kết hợp của các enzyme thủy phân và chất hóa học hay tác nhân vật lý Đầu tiên thủy phân bằng hóa học hay vật
lý để sản xuất gelatin từ collagen Sau đó thủy phân gelatin bằng enzyme cho đến khi đạt được trọng lượng phân tử mong muốn
Hình 1.2 Bột gelatin thủy phân
Gelatin có thể được thủy phân với nhiều enzyme khác nhau như pepsin, neutrase, alkalase, bromelain, hoặc papain [14, 25, 34, 27] Việc lựa chọn các enzyme và điều kiện thủy phân cơ bản xác định các tính chất của sản phẩm
Hình 1.3 Sự phân bố khối lượng gelatin thủy phân so với gelatin trước thủy phân
Gelatin thủy phân có một số tính chất công nghệ đặc biệt trái ngược với gelatin thông thường Ví dụ, chúng có thể hoà tan trong nước lạnh và không tạo gel ngay cả trong dung dịch có nồng độ cao ở nhiệt độ thường được sử dụng trong chế biến
Trang 23Các tính chất công nghệ chủ yếu của gelatin thủy phân là do cấu trúc phân tử của
nó Điều này góp phần làm đa dạng các ứng dụng của gelatin thủy phân Các phân tử thủy phân phụ thuộc vào nguyên liệu và đặc biệt là quá trình sản xuất ứng dụng
Tất cả các loại bột gelatin thủy phân có thể được lưu trữ rất lâu với điều kiện môi trường khô ráo Độ khô là đặc biệt quan trọng vì hàm lượng nước của bột gelatin thủy phân thấp 5÷8% nên có xu hướng hấp thụ nước từ không khí nhanh
hơn so với gelatin thông thường, trong đó có một lượng nước trong 10÷12%
1.2.2 Ứng dụng của gelatin thủy phân [32]
Sản phẩm gelatin thủy phân ngày càng trở nên được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm Sản phẩm này được sử dụng với mục đích công nghệ hơn
là mục đích dinh dưỡng của nó Khả năng hòa tan tốt, khả năng tạo nhũ, tạo bọt …
là những tính chất quan trọng của gelatin thủy phân được sử dụng để phát triển sản phẩm trong ngành công nghiệp thực phẩm được trình bày trong Bảng 1.5
Khả năng hòa tan tốt của gelatin thủy phân có thể ứng dụng như một chất hoạt động bề mặt Nó giảm sức căng bề mặt, cho phép bọt được hình thành Đồng thời
nó còn giúp ổn định bọt bởi ngăn cản các bong bóng khí nhỏ kết hợp lại với nhau thành những cái lớn hơn và phá vỡ hệ bọt Nồng độ gelatin thủy phân hòa tan trong nước có thể lên đến 60% Trong một số ứng dụng, bột gelatin thủy phân có thể được cho khuấy trực tiếp vào sản phẩm
Gelatin thủy phân thường tương thích với đường, các chất thay thế đường, hydrocolloids và protein Nó có thể sử dụng ở nồng độ cao trong các sản phẩm phức hợp như là thực phẩm giảm béo và giảm calo Trong thực tế, gelatin thủy phân thậm chí còn tăng cường cảm giác ngon miệng khi dùng sản phẩm
Một tính chất công nghệ của gelatin thủy phân được sử dụng phổ biến là khả năng tạo nhũ tương của nó Khả năng này thì phụ thuộc vào trọng lượng phân tử của gelatin thủy phân, lượng dầu có thể được nhũ tương hóa với protein ở các điều kiện tiêu chuẩn Nồng độ gelatin thủy phân cần thiết cho ứng dụng này là 3÷5% Chúng cũng có khả năng bảo vệ các hệ keo, ngăn ngừa các hạt liên kết với nhau làm phá hủy các nhũ tương Tính chất đặc trưng này thì được các nhà sản xuất sử dụng để sản xuất các nước uống hòa tan vitamin E, A và các chất màu như các carotenoid Trong ứng dụng này, gelatin thủy phân được sử dụng như một chất nhũ hóa và ổn định cho các vitamin trong dầu Ngoài ra, khả năng liên kết nước của dung dịch cũng được cải thiện khi có mặt gelatin thủy phân
Trang 24Bảng 1.5 Ứng dụng chủ yếu của gelatin thủy phân [32]
- Tăng độ hòa tan và phân
tán
- Nhũ tương hóa và ổn định
- Cải thiện kết cấu
- Liên kết với nước
- Pho mai, đồ uống, kẹo …
- Thực phẩm ăn liền, thịt tươi …
- Ngũ cốc đóng bánh, protein đóng bánh
- Trà hòa tan, các chất có hoạt tính dược, gia vị …
- Làm trong đồ uống như bia, rượu và nước trái cây
- Tăng cường protein, phòng ngừa viêm xương khớp, thay thế các carbohydrate và chất béo, thực phẩm ít muối, dinh dưỡng thể thao, sản phẩm làm đẹp
Gelatin thủy phân cũng có tính kết dính tốt nên nó được sử dụng để sản xuất các loại thực phẩm dạng đóng bánh Nó được dùng ở nồng độ khoảng 7% là tác nhân giúp liên kết các thành phần chất khô lại với nhau Trong khi đó, việc sử dụng đường cho mục đích này thì đòi hỏi nồng độ rất cao Do đó, gelatin thủy phân có thể
sử dụng để sản xuất các sản phẩm đường thấp và ít năng lượng
Các sản phẩm chứa gelatin thủy phân cũng có thể được phát triển với vị cay, mặn, hay hương vị thảo dược Tính chất này của gelatin thủy phân được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm gia vị Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giảm các nồng độ muối, gia vị, và các phụ gia khác trong chế biến thịt, thực phẩm ăn liền,
và đặc biệt là các thực phẩm ăn kiêng Nghiên cứu gần đây cũng cho thấy gelatin thủy phân trong các loại nước ép hoa quả làm tăng vị ngọt và mùi của chúng
Gelatin thủy phân được sử dụng trong sản xuất đồ uống thực phẩm Nó có tác dụng làm tăng độ trong cho các sản phẩm như bia, rượu, và nước trái cây vào phản ứng giữa các phân tử gelatin thủy phân với các pectin mang điện tích âm
Một ứng dụng khác của gelatin thủy phân là bổ sung vào các sản phẩm kem như là một chất phụ gia để hạn chế sự lớn lên của các tinh thể đá trong quá trình làm đông sản phẩm, nâng cao chất lượng kem [34]
Trang 25Trong công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm, gelatin thủy phân là những thành phần chức năng quan trong hỗ trợ cấu trúc collagen trong da cũng như trong sụn Tính
dễ hấp thụ của các sản phẩm gelatin thủy phân được ứng dụng để sản xuất các sản phẩm mỹ phẩm bảo vệ da và làm đẹp da Trong dược phẩm, ứng dụng dựa vào thành phần acid amin của gelatin thủy phân Nó có chứa một lượng lớn hai acid amin glycine
và proline có vai trò quan trọng trong cấu trúc collagen trong sụn [32]
Gelatin thủy phân còn có chứa các peptide có hoạt tính sinh học với đặc tính chống oxy hóa cũng được nghiên cứu ứng dụng trong các lĩnh vực như dược phẩm,
y học và thực phẩm [14, 24, 27]
1.2.3 Một số nghiên cứu về gelatin thủy phân
- Nghiên cứu của Alemán và cộng sự (2011) về thủy phân gelatin từ mực để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học Tác giả đã tiến hành thủy phân gelatin da mực với bảy enzyme protease thương mại (protamex, trypsin, neutrase, savinase, NS37005, esperase và alcalase) Trong các enzyme thủy phân sử dụng thì alcalase
và esperase thủy phân mạnh nhất và tạo ra hầu hết các peptidevới trọng lượng phân
tử từ 500÷1400 Da [15]
- Nghiên cứu của Alemán và cộng sự (2011) về thủy phân gelatin từ cá ngừ, cá bơn và mực để sản xuất chất chóng oxy hóa Tiến hành hòa tan gelatin 2,5% trong dung dịch đệm photphate (0,01M; pH 8) Sau đó bổ sung alcalase vào với tỷ lệ E/S : 1/20 và thủy phân ở 50oC trong 3 giờ Gelatin mực và cá ngừ cũng được thủy phân bằng enzyme trypsin và pepsin Điều kiện thủy phân của các enzyme này như sau: trypsin (37oC; pH 7,5) và pepsin (37oC; pH 4) pH môi trường được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1N hoặc HCl 1N tương ứng với pH kiềm hoặc acid Sau khi thủy phân các enzyme bị bất hoạt bằng cách gia nhiệt ở 90oC trong 10 phút [14]
- Nghiên cứu của Zhao và cộng sự (2007) về thủy phân gelatin của sâm biển với hai enzyme là bromelin và alcalase Tác giả đã tiến hành thủy phân ở ba phân đoạn để tạo ra ba loại sản phẩm khác nhau Dựa vào trọng lượng phân tử sản phẩm thủy phân thu được ba loại sản phẩm gồm: GH-I <10 kDa; GH-II <5 kDa; GH-III
<1 kDa [35]
- Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2009) về thủy phân gelatin bò bằng papain ứng dụng sản xuất kem thực phẩm Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân
Trang 26này là pH 7, tỷ lệ E/S : 1/10, nhiệt độ 37oC và trong 30 phút Các peptide thu được
có khối lượng phân tử trung bình từ 700÷1400 Da có tác dụng hạn chế tốt sự phát
triển tinh thể trong kem [34]
- Nghiên cứu của Ketnawa và cộng sự (2010) về thủy phân gelatin da bò và catfish bằng bromelin với nồng độ (0÷0,3 đơn vị) Các bromelain này được xác định
là hoạt động tương đối cao ở pH 7,0 và 55oC Gelatin catfish thì bị thủy phân thành các peptide nhỏ khi xử lý với 0,02 đơn vị bromelin Đối với gelatin bò thì xử lý
bromelin cao hơn lên đến 0,18 đơn vị [27]
1.2 Tổng quan về enzyme và tổng hợp enzyme từ vi sinh vật [1, 3, 10, 11]
1.2.1 Tổng quan về enzyme
Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác Người ta đã khám phá ra rằng các enzyme đã xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối, theo nhưng chiều hướng xác định Như vậy, enzyme đã đảm bảo cho sự trao đổi thường xuyên giữa cơ thể sống và môi trường bên ngoài, nghĩa là đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống
Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật bằng một quá trình tổng hợp hết sức phức tạp Chúng tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi được tách khỏi tế bào sống
Enzyme có hiệu suất xúc tác cực lớn Nó có thể gấp hàng trăm, hàng nghìn, hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác Điều quan trọng nữa là enzyme
có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể, pH môi trường gần pH sinh lý
Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Sự tác dụng có tính lựa chọn cao này gọi
là tính đặc hiệu của enzyme
Enzyme có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng, trong các dung môi hữu cơ có cực, nhưng enzyme không tan trong dung môi không phân cực Ngược lại, enzyme trong dung dịch dễ dàng bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và hóa học vốn làm kết tủa protein
Ví dụ: muối amonium sulfat, aceton, ethanol…
Trang 27Giống như protein, enzyme không bền và bị giảm hoạt tính đối với các tác nhân gây biến tính protein như nhiệt độ, môi trường aicd, kiềm mạnh hay muối kim loại nặng Mức độ giảm hoạt tính của enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein enzyme
Enzyme có hai loại đó là enzyme một thành phần và enzyme hai thành phần
- Enzyme một thành phần thì chỉ có phần protein, những enzyme này thường xúc tác cho phản ứng thủy phân
- Enzyme hai thành phần gồm có: phần protein và phần phi protein Phần protein gọi là apoenzyme, phần phi protein gọi là coenzyme hay nhóm ngoại
Đến nay người ta đã xác định được rằng phần lớn enzyme trong tế bào đều
có cấu trúc bậc bốn bao gồm nhiều tiểu đơn vị, các tiểu đơn vị này có thể liên kết với nhau bằng liên kết hydro, liên kết cộng hóa trị hoặc một số liên kết khác Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần nhỏ của phân tử enzyme tham gia kết hợp đặc hiệu với cơ chất, phần đó được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme và
nó quyết định hoạt tính xúc tác của enzyme Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau của acid amin, các nhóm chức của coenzyme, phân tử nước liên kết và trong nhiều trường hợp có cả ion kim loại
a Cơ chế tác dụng của enzyme
Theo quan quan điểm hiện nay trong phản ứng có xúc tác enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme-cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa, bởi lẽ khi cơ chất kết hợp vào enzyme do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của electron và
sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn đến thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia vào phản ứng dễ dàng hơn
Qua nhiều dẫn liệu thực nghiệm cho thấy rằng quá trình tạo thành phức enzyme cơ chất (ES) và biến đổi phức này thành sản phẩm (P), giải phóng enzyme
tự do (E) thường trải qua ba giai đoạn như ở sơ đồ sau:
E + S ES P + E
- Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đổi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp
Trang 28- Giai đoạn thứ hai: Xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng
- Giai đoạn thứ ba: Tạo thành sản phẩm và giải phóng enzyme dưới dạng tự do
b Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng của enzyme
- Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhất định Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu
Ở nhiệt độ mà tại đó enzyme thể hiện hoạt tính xúc tác cao nhất (vận tốc của phản ứng enzyme cao nhất) được gọi là nhiệt độ thích hợp Mỗi enzyme có một nhiệt độ hoặc một khoảng nhiệt độ thích hợp, càng xa nhiệt độ thích hợp vận tốc phản ứng của enzyme càng giảm Đường biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng của nhiều enzyme có dạng như Hình 1.4
V
Vmax
topt to
Hình 1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ phản ứng enzyme
Trong công nghệ sản xuất và bảo quản các sản phẩm thực phẩm, yếu tố nhiệt
độ thường được sử dụng để điều hòa các phản ứng enzyme theo chiều mong muốn
Trang 29V
Vmax
pHopt pH
Hình 1.5 Ảnh hưởng của pH tới tốc độ phản ứng
Ở pH mà tại đó trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất thực hiện một cách tốt nhất được gọi là pH thích hợp Một enzyme có thể có một độ pH thích hợp hoặc một khoảng pH thích hợp Đường biểu diễn ảnh hưởng của pH đến vận tốc phản ứng của nhiều enzyme như ở Hình 1.5
Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến lương thực thực phẩm, trong tuyển chọn giống vi sinh vật
Hình 1.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới tốc độ phản ứng
Thời gian đầu khi tăng nồng độ enzyme thì vận tốc phản ứng tăng nhưng đến một giai đoạn nào đó nếu ta tiếp tục tăng nồng độ enzyme thì cũng không làm tăng vận tốc phản ứng vì trong môi trường lúc này không còn cơ chất để tác dụng
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc phản ứng enzyme
như Hình 1.6
Trang 30- Nồng độ cơ chất
Năm 1913, hai nhà khoa học Leonom và Michaelis và Maud Menten đưa ra
mô hình động học để giải thích tính chất động học của phản ứng enzyme và đã lập được phương trình biễu diễn mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất của enzyme (Hình 1.7)
Hai nhà khoa học trên đã đưa ra mô hình chuyển hóa trong phản ứng enzyme với một cơ chất duy nhất như sau:
Gọi [Eo] là nồng độ enzyme ban đầu
[ES] là nồng độ enzyme đi vào phản ứng tạo phực hợp không gian ES
Trang 31Để thuận lợi hơn trong việc xác định Km và Vmax năm 1934 Linewear và Burk
đã đưa ra phương trình bằng cách nghịch đảo cả hai vế phương trình Menten Phương trình như sau:
Michaelis-Phương trình này là phương trình tuyến tính có dạng y = ax + b, đường biểu diễn nó là một đường thẳng sẽ cắt trục tung tại 1/Vmax và cắt trục hoành ở -1/Km
và độ nghiêng bằng Km/Vmax như Hình 1.8
Hình 1.8 Đồ thị biểu diễn phương trình Linewear và Burk
Các chất hoạt hóa thường làm nhiệm vụ chuyển các nhóm hydrogen hoặc những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất có tác dụng phục hồi các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzyme
- Các chất kìm hãm
Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô vô cơ, các chất hữu cơ
và cả protein thường được ký hiệu là I
Trang 32Các chất gây biến tính protein là những chất kìm hãm không đặc hiệu của enzyme Nhiều chất khác không làm biến tính protein enzyme nhưng vẫn làm giảm hoạt độ xúc tác của nó theo cơ chế khác Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch
Tùy thuộc vào bản chất tạo phức EI, bản chất của chất kìm hãm, người ta chia
ra những chất kìm hãm như sau:
- Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu tạo gần giống như cơ chất,
nó sẽ chiếm chỗ của cơ chất trên trung tâm hoạt động của enzyme vì vậy làm vận tốc phản ứng giảm Nếu nồng độ cơ chất nhỏ hơn nhiều so với nồng độ chất ức chế cạnh tranh thì vận tốc phản ứng enzyme ngừng
- Chất kìm hãm không cạnh tranh: là những chất có cấu tạo khác hẳn với cơ chất, nó chiếm vị trí khác với vị trí của cơ chất trên trung tâm hoạt động của enzyme vì vậy làm cấu trúc không gian của enzyme thay đổi, kết quả là làm phản ứng enzyme ngừng
- Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng: các sản phẩm của phản ứng có thể đóng vai trò như chất kìm hãm không cạnh tranh
- Kìm hãm do thừa cơ chất: khi phức ES được tạo thành rất có thể có một cơ chất gắn với phức này, làm chúng không thể chuyển hóa tiếp tục được
c Ứng dụng của enzyme
- Trong hóa phân tích: để định tính và định lượng các chất
- Trong y học: có thể sử dụng enzyme để chữa bệnh, để sản xuất các sinh tố
và các chất kháng sinh
- Trong công nghiệp:
+ Trong công nghiệp xà phòng, enzyme dùng làm chất tẩy rửa dầu mỡ công nghiệp + Trong công nghiệp dệt: dùng enzyme amylase để khử hồ trên vải
- Trong công nghệ thực phẩm:
+ Sử dụng amylase trong chế tạo men bia, bánh mì, sử dụng enzyme amylase
để sản xuất glucose từ tinh bột, thay cho phương pháp dùng acid HCl (hiệu suất 96÷97%)
+ Sử dụng protease làm mềm thịt, thủy phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá, trong công nghiệp sản xuất nước mắm, tinh chế guanin
Trang 33+ Ứng dụng cellulase thủy phân bào mòn màng cellulose để trích ly chất keo trong rong biển
+ Sử dụng pectinase để tăng hiệu suất ép nước quả và làm trong dịch quả, chống hiện tượng kết tủa trắng của nước quả trong quá trình bảo quản
d Nguồn sản xuất enzyme
Enzyme có trong mọi tế bào của động vật, thực vật và vi sinh vật Do vậy người ta có thể thu nhận enzyme từ các nguồn này để sử dụng trong công nghiệp Một số nguyên liệu dùng làm nguồn nguyên liệu để tách chiết enzyme là:
- Từ thực vật: nhựa đu đủ tách papain, hạt đậu tương tách urease, thân và quả dứa tách bromelin
- Từ động vật: từ một số mô và cơ quan động vật người ta có thể thu nhận nhiều enzyme khác nhau như từ dạ dày có thể thu được pepsin, từ tụy tạng thu được trypsin, chymotrypsin
- Từ vi sinh vật: đây là đối tượng thích hợp nhất để sản xuất enzyme Sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme có những ưu điểm sau:
Đến nay, người ta đã biết các enzyme cũng như phần lớn protein trong tế
b à o được tổng hợp theo cơ chế khá phức tạp Trong quá trình này, ngoài các acid amin là nguyên liệu để tổng hợp enzyme còn có các acid nucleic, các hợp chất giàu năng lượng, các protein khác tham gia
Quá trình tổng hợp enzyme bao gồm nhiều phản ứng khác nhau Mỗi phản
Trang 34ứng do một enzyme tương ứng xúc tác Nhưng lại làm thế nào để đảm bảo sự truyền đạt thông tin di truyền của gen, vì sinh tổng hợp enzyme là một quá trình rất đặc thù Như đã biết ADN nằm trong nhiễm sắc thể và trong nhân tế bào Quá trình sinh tổng hợp protein lại diễn ra ở tế bào chất Nếu thông tin được mã hóa trong ADN dùng để chỉ huy tổng hợp protein ở ribosom thì thông tin đó phải được chuẩn bị từ nhân đến ribosom nhờ một chất chuyển trung gian Thực nghiệm cho thấy: hàm lượng ARN tăng cao khi trong tế bào đang diễn ra quá trình sinh tổng hợp protein Ngày nay người ta đã biết rằng thông tin di truyền chứa trong ADN được sao lại trong mARN Chính mARN là chất chuyển trung gian đã chỉ huy gắn các chất acid amin theo một trật tự nhất định, cho phép tổng hợp protein đặc thù Quá trình này được gọi là sự dịch mã Như vậy từ ADN đến protein có hai quá trình nối tiếp là sao mã và dịch mã
ADN mARN Protein
- Quá trình sinh tổng hợp enzyme có thể chia thành các giai đoạn chính như sau:
+ Giai đoạn hoạt hóa acid amin và truyền thông tin di truyền từ ADN đến mARN
+ Giai đoạn khởi đầu tổng hợp chuỗi polypeptide
+ Giai đoạn kéo dài chuổi polypeptide
+ Giai đoạn kết thúc chuổi
- Hiện tượng cảm ứng trong quá trình sinh tổng hợp enzyme
Nhiều vi sinh vật được kích thích sinh tổng hợp nhiều enzyme khi có chất cảm ứng trong môi trường
Trong điều kiện bình thường, có một số enzyme có thể chỉ được tổng hợp với số lượng rất ít, nhưng khi thêm vào môi trường một số chất nhất định vào môi trường thì các enzyme này có thể tăng lên rất nhiều lần Các chất gây nên hiệu quả này gọi là chất cảm ứng Các chất này được xem xét như là một chất nền để sinh tổng hợp enzyme
Sự cảm ứng thường có tính chất dây chuyền Trong hệ thống bao gồm nhiều phản ứng, cơ chất đầu tiên của hệ thống có thể cảm ứng quá trình tổng hợp
Dịch mã Sao mã
Trang 35tất cả các enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa nó Điều này được thực hiện theo cơ chế sau: trước hết chất cảm ứng làm tăng quá trình tổng hợp enzyme tương ứng, sau đó sản phẩm của phản ứng này lại cảm ứng tổng hợp enzyme thứ hai để phân hủy nó, tiếp theo sản phẩm thứ hai lại cảm ứng tổng hợp enzyme thứ ba
- Quá trình điều hòa sinh tổng hợp enzyme
Nhiều dẫn liệu thực nghiệm cho thấy các gen bảo đảm sinh tổng hợp một số enzyme cảm ứng xúc tác cho quá trình phân giải không chỉ chịu sự kiểm tra theo cơ chế cảm ứng mà còn chịu sự kiểm tra theo cơ chế khác nhờ tác dụng của AMP vòng, gọi là “ức chế phân giải” AMP có tác dụng kích thích quá trình sao chép mã của các operon phân giải Theo nhiều tác giả, tác dụng kích thích của AMP được thực hiện nhờ một protein đặc biệt làm trung gian gọi là protein nhân AMP, hay còn gọi là protein hoạt hóa gen phân giải (ký hiệu X) Khi AMP kết hợp với X tạo thành phức hợp có tác dụng hoạt hóa gen promotor làm cho ARN-polymerase dễ dàng kết hợp với nó để bắt đầu quá trình sao chép mã, như vậy AMP có tác dụng làm tăng cường quá trình sao chép mã Cũng có ý kiến cho rằng phức hợp AMP-X-ARN-polymerase cho phép bắt đầu quá trình sao chép mã
Glucose và một số đường khác khi thêm vào môi trường nuôi cấy thường làm giảm lượng AMP trong tế bào, do đó làm giảm quá trình sinh tổng hợp nhiều enzyme ngay cả khi có chất cảm ứng trong môi trường Hiện tượng này gọi là hiệu ứng glucose Tuy nhiên hiện nay vẫn chưa biết rõ cơ chế làm giảm AMP do glucose và các đường khác
1.3 Enzyme protease và enzyme gelatinase
1.3.1 Enzyme protease [6]
a Nguồn thu nhận enzyme protease
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào) Cho đến nay protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn nhiều so với protease nội bào Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, y học
Trang 36Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis,
Bacillus cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số
loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger…
b Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp, … các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau:
Protease trung tính: protease trung tính là metalloenzyme, chúng có pH hoạt
động 6 ÷7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus
và amidase đối với dẫn xuất của amino acid
Các protease – serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20000÷27000 dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease –serin vào khoảng 33800÷48400 dalton Protease – tiol và nhiều protease – acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30000÷40000 dalton
Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác Ví dụ histidin thường tham
Trang 37gia trong trung tâm hoạt động của các protease – serin, protease – tiol còn tyrosin là trung tâm hoạt động của các protease kim loại
c Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông thoáng, thành phần môi trường
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp
Ảnh hưởng của pH môi trường: Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật
Ngược lại, trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảng hưởng rất lớn đến sự tích luỹ protease trong môi trường
Độ thông khí: Độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo giống vi sinh vật
Ảnh hưởng thành phần môi trường: Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp
1.3.2 Enzyme gelatinase
a Khái quát về enzyme gelatinase
Gelatinase là enzyme thủy phân protein cho phép vi khuẩn thủy phân gelatin thành các hợp chất như polypeptide, peptide và acid amin, các sản phẩm thủy phân này có thể hấp thu qua màng tế bào để sử dụng
Trang 38Hình 1.9 Cấu trúc không gian phân tử gelatinase [20]
b Một số nghiên cứu về enzyme gelatinase từ vi khuẩn
Enzyme gelatinase đã được Liborius (1886), Brunton and Maefadyen (1889), Fermi (1892), Abbott và Gildersleeve (1903) nghiên cứu về những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh gelatinase từ vi khuẩn
- Evans và Wardlaw (1953) đã nghiên cứu khả năng sinh gelatinase của các
chủng vi khuẩn Bacillus [22] Số liệu được trình bày trên Bảng 1.6
Bảng 1.6 Khả năng sinh gelatinase của một số chủng vi khuẩn Bacillus [30]
Hoạt tính gelatinase (m.g.d/ml) Loài Chủng 2 ngày 5 ngày
B subtilis
NCTC 3610 NCTC 6276 NCTC 6346 NCTC 7241
Trang 39NCTC 1027 NCTC 1097
M 36 Sterne NPA
NCTC =National Collection of Type Cultures, Colindale, London, N.W 9
CN = Wellcome Research Laboratories, Beckenham, Kent
- Smith và Goodner (1958) đã nghiên cứu khả năng sinh gelatinase của một số
vi khuẩn bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch gelatin Tiến hành nuôi cấy một
số chủng vi khuẩn bảo gồm Aerobacter, Bacillus, Bacterium, Chromobacteritinn,
Micrococcuts, Mycobacteriaim, Aneisseria, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sarcina, Serratia, Shigella, và Vibrio … trên môi trường chứa 0,4%
Trang 40neopeptone, 0,1% cao men, 1,5% agar, 1,2÷4% gelatin ở pH 7,2 và nhiệt độ 20÷22oC Kết quả xác định được tất cả chủng vi khuẩn nghiên cứu điều có khả năng sinh gelatinase [30]
- Nghiên cứu của Alice và cộng sự (1927) về ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến
khả năng sinh gelatinase từ vi khuẩn Proteus Tác giả đã tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Proteus trên môi trường chứa 2% pepton, 0,5% Na2HPO4.2H20, 0,5%
KH2PO4, 0,1% NH4Cl ở 30oC Giá trị pH ban đầu thay đổi từ 5,5÷8,0 và được điều chỉnh bằng dung dịch acid hoặc bazơ tương ứng
Hình 1.10 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh gelatinase của Proteus
Kết quả cho thấy giá trị pH tối ưu cho khả năng sinh gelatinase từ Proteus
trong những thí nghiệm trong khoảng pH 7÷8 (Hình 1.10) Tùy vào điều kiện cụ thể được sử dụng mà chọn giá trị pH (ví dụ như trong môi trường glucose pH 7 là phù hợp nhất) [16]
- Alice và cộng sự (1927) cũng nghiên cứu về ảnh hưởng của hai muối canxi
và muối magie đến tổng số vi khuẩn, pH và sự sinh gelatinase của Proteus trong
môi trường lactate Tiến hành nuôi cấy chủng trong môi trường chứa 0,5% acid lactid, 0,5% amoni chlorid trong bốn ngày Lượng muối canxi và magie thêm vào như Bảng 1.7
Kết quả cho thấy môi trường thứ nhất và thứ hai vi khuẩn Proteus tăng trưởng tốt và sinh gelatinase cao Ở môi trường thứ ba không có muối canxi thì Proteus
vẫn phát triển tốt nhưng khả năng sinh gelatinase rất thấp Cuối cùng là môi trường