NGHIÊN cứu THU NHẬN ENZYME α AMYLASE từ TRỰC KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… iiLỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ và góp ý nhiệt

Trang 1

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BAN ðÀO TẠO SAU ðẠI HỌC

-  -

TRƯƠNG THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME α - AMYLASE TỪ TRỰC

KHUẨN Bacillus subtilis

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : 1 PGS.TS LƯƠNG ðỨC PHẨM

2 TS NGUYỄN VĂN GIANG

HÀ NỘI - 2013

Trang 2

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Trương Thị Nguyệt

Ket-noi.com kho tai lieu mien phi

Trang 3

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô cùng toàn thể cán bộ bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ vi sinh – khoa Công nghệ Sinh học – Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô trường Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến thầy giáo PGS.TS Lương ðức Phẩm

và TS Nguyễn Văn Giang ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn tới cùng các thầy cô trong bộ môn, các bạn sinh viên, gia ñình và bạn

bè ñã tạo rất nhiều ñiều kiện ñể tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Mặc dù tôi ñã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận ñược những ñóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn

Hà Nội, Ngày 24 tháng 06 năm 2013

Học viên

Trương Thị Nguyệt

Trang 4

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… iii

2.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sinh tổng hợp α - amylase của vi

Trang 5

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… iv

3.2.2 Môi trường cảm ứng sinh tổng hợp amylase của Bacillus 22

3.3.1 Phương pháp phân lập các chủng Bacillus từ ñất vườn qua

3.3.4 Một số phương pháp nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học của Bacillus 23

3.3.9 Phương pháp nghiên cứu khả năng phân hủy tinh bột 30

3.3.10 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase theo Heinkel, 1956 31

3.3.11 Phương pháp nghiên cứu xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy tối ưu 33

3.3.13 Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy 35

3.3.14 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme amylase từ dịch chiết

3.3.15 Xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase của chế phẩm enzyme thu ñược

3.3.16 Xác ñịnh ñộ bền α - amylase thủy phân nguyên liệu nếp trắng 37

3.3.17 Xác ñịnh ñường khử theo phương pháp acid initrosalicylic(DNS) 39

Trang 6

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… v

4.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng trực khuẩn có hoạt tính

4.2 Xác ñịnh sự sinh trưởng và hoạt ñộ α - amylase của 3 chủng

4.4 Khảo sát các ñặc ñiểm sinh hóa của vi khuẩn LB3 50

4.5 Nghiên cứu các ñiều kiện ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng

4.5 Nghiên cứu ñộng học của quá trình lên men trong bình tam

4.6 Tách enzyme từ dịch nuôi cấy, xác ñịnh hoạt ñộ và ñộ bền của

4.6.1 Tách enzyme từ dịch nuôi cấy với các tác nhân tủa khác nhau 59

4.6.2 Hoạt ñộ α – amylase của CPE amylase thu ñược bởi các tác

Trang 7

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… vi

4.7 Thử nghiệm khả năng thủy phân enzyme α – amylase trên nguyên liệu gạo nếp trắng 62

Trang 8

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… vii

Trang 9

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… viii

DANH MỤC BẢNG

2.2 ðộ bền nhiệt của - amylase từ các nguồn khác nhau 12

3.1 ðặc ñiểm hình thái khuẩn lạc các chủng phân lập 41

3.2 ðặc ñiểm tế bào của khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường 44

3.3 ðường kính vòng phân giải tinh bột của 3 chủng LB 45

3.5 Sự sinh trưởng của chủng LB3 trên các loại cơ chất 51

3.6 Nồng ñộ tinh bột tan ảnh hưởng ñến hoạt ñộ α - amylase 53

3.7 Ảnh hưởng của nồng ñộ muối NaCl ñến hoạt ñộ α - amylase 56

3.8 Ảnh hưởng của nồng ñộ muối CaCl2 ñến hoạt ñộ α - amylase 58

3.9 Hiệu suất thu nhận CPE α - amylase từ các tác nhân tủa 59

3.10 Hoạt ñộ α – amylase thu ñược bởi các tác nhân kết tủa 60

Trang 10

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ix

DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Tế bào Bacillus subtilis 5

2.2 Cấu trúc không gian của α - amylase 11

2.3 Vị trí cắt của α - amylase trên phân tử tinh bột 14

4.1 Vòng phân giải tinh bột của 3 chủng LB3, LB4, LB8 47

4.2 Hình thái tế bào chủng LB3 48

4.3 Bào tử của chủng LB3 48

4.4 Hình ảnh thử catalase của chủng LB3 49

4.5 Một số phản ứng sinh hóa của chủng LB3 51

Trang 11

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… x

DANH MỤC BIỂU ðỒ STT Tên biểu ñồ Trang 3.1 Sự sinh trưởng của 3 chủng LB phân lập 46

3.2 Ảnh hưởng loại cơ chất ñến hoạt ñộ α – amylase 52

3.3 Nhiệt ñộ ảnh hưởng ñến hoạt ñộ α - amylase 54

3.4 Ảnh hưởng pH ban ñầu ñến hoạt ñộ α - amylase 55

3.5 Nồng ñộ NaCl cao nhất ức chế sinh trưởng 57

3.6 ðộng học quá trình nuôi cấy B subtilis LB3 sinh

α - amylase 59

Trang 12

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 1

1 MỞ đẦU

1.1 đặt vấn ựề

Vi sinh vật trong tự nhiên rất ựa dạng và phong phú Ngày nay vi sinh vật mang lại cho con người nguồn lợi to lớn trong các lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, công nghệ sinh họcẦ Các chủng vi sinh vật nói chung và vi

khuẩn Bacillus nói riêng ựang ựược ứng dụng rộng rãi trong các ngành sản

xuất là nhờ khả năng sinh các loại enzyme thủy phân của chúng

Enzyme là những chất xúc tác sinh học có hiệu suất xúc tác cao, ựang ngày càng ựược áp dụng rộng rãi trong thực tế với quy mô ngày càng lớn Ngày nay α - amylase là nhóm enzyme ựược sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp như sản xuất rượu, bia, ựường glucose, lên men bánh mỳ, làm thức ăn gia súc ẦVới khả năng ứng dụng rộng rãi như vậy nên nhu cầu chế phẩm enzyme này hiện nay rất lớn (đồng Thị Thanh Thu, 2004)

Amylase có thể ựược thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi khuẩn, nấm mốc, thực vật và ựộng vật Tuy nhiên, các chế phẩm α - amylase thương mại ựược ứng dụng nhiều trong công nghiệp chủ yếu ựược sản xuất từ

Bacillus sp đã có nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu thu nhận chế phẩm α - amylase từ Bacillus sp Dharani Aiyer (2004) ựã công bố việc sản xuất α - amylase bởi B licheniform B subtilis là loài có tiềm năng

lớn về các enzyme ngoại bào Nhiều trong số các enzyme ngoại bào này là những enzyme thủy phân các phân tử hữu cơ lớn như amylase, protease Nguồn enzyme α - amylase sử dụng trong nước ta hiện nay chủ yếu nhập khẩu của hãng NOVO đan Mạch Vấn ựề thu nhận và tinh sạch

enzyme α - amylase từ các loài B subtilis chưa ựược quan tâm ựúng mức

Có thể ứng dụng enzyme α - amylase sinh tổng hợp bởi loài này sẽ làm giảm ựáng kể chi phắ sản xuất

Xuất phát từ thực tế ựó chúng tôi ựã tiến hành nghiên cứu ựề tài "Nghiên

Trang 13

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 2

cứu thu nhận enzyme α - amylase từ Bacillus subtilis”

1.2 Nội dung ñề tài

1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus từ ñất có hoạt

tính amylase mạnh

2 Xác ñịnh sinh trưởng, sinh tổng hợp enzyme α - amylase của các chủng tuyển chọn

3 Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học của chủng tuyển chọn

4 Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh hóa của chủng tuyển chọn

5 Khảo sát các ñiều kiện nuôi cấy tối ưu ñể thu ñược dịch enzyme

α - amylase có hoạt ñộ cao

5 Tách chiết enzyme α – amylase từ dịch lên men, nghiên cứu ñộ nhiệt

ñộ và pH tối thích của enzyme α – amylase

6 Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột của enzyme α – amylase thu nhận trên nguyên liệu gạo nếp trắng

Trang 14

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.1 ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus

Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong ñất, nước, không khí do

chúng có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí tùy tiện Phần lớn các chủng thuộc các loài của giống này ñều có khả năng sinh ra nhiều amylase và protease kiềm, có một số chủng sinh ra cenlulase

Bacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que có kích thước khác nhau (0,5-2,5) x (l,2-10) µm Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng

di ñộng Chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện Bacillus là vi khuẩn dị

dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lượng nhờ oxi hóa các hợp chất hữu cơ, chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện

Bacillus có khả năng sinh bào tử Thông thường bào tử ñược tạo ra khi tế

bào ñã trải qua giai ñoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một bào tử Khi bào tử trưởng thành tế bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử ñược giải phóng ra khỏi tế bào mẹ Các tế bào

Bacillus ñặc trưng là sinh bào tử mà vẫn giữ hình dáng trực khuẩn khi mang bào

tử, trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn chỉ phình to một ít khi chứa bào tử Tùy loài mà bào tử có thể nằm chính tâm, lệch tâm hay gần ñầu tế bào

Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều ñộc

tố, vì chúng có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm Bào tử của vi khuẩn không phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là một hình thức thích nghi ñể giúp vi khuẩn vượt qua những ñiều kiện sống bất lợi của môi trường Bào tử ở dạng tự do không có quá trình trao ñổi chất, khi gặp ñiều kện thuận lợi mỗi bào tử cho ra một tế bào sinh dưỡng

(www.answers.com/ topic/bacillus-1)

ða số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số Bacillus phù hợp với

pH = 9 - 10 như B alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như

B acidocaldrius

Trang 15

Nhiều chủng Bacillus ưa nhiệt ñộ cao (45°C - 75°C), hay ưa lạnh (5°C - 25°C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt ñộ 34°C - 37°C

Hầu hết Bacillus không gây bệnh cho người và ñộng vật Một số loại gây

bệnh cho côn trùng như B.thuringiensis, B.polliae, B lentimorrbus, B cereus,

B antharacis…ña số trong tự nhiên là có ích

(http://www.ami-tech.co.kr/customer/img/img_08.jpg)

Vi khuẩn thuộc chủng Bacillus có tiềm năng lớn về các enzyme ngoại

bào Nhiều trong số các enzyme ngoại bào này là những enzyme thủy phân

các phân tử hữu cơ lớn như amylase, protease Vi khuẩn thuộc chi Bacillus

ñã, ñang và ngày càng trở thành những vi sinh vật hàng ñầu về mặt ứng dụng

Các ứng dụng của chúng bao gồm hàng loạt lĩnh vực từ sản xuất thực phẩm

thủ công truyền thống ñến công nghệ lên men hiện ñại ñến sinh học phân tử, y

– dược học, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc từ các phế liệu

2.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.1.1 Lịch sử phát triển

B subtilis ñược phát hiện lần ñầu tiên trong phân ngựa bởi Tổ chức y

học Nazi của ðức (1941) Lúc ñầu, chủ yếu ñược sử dụng ñể phòng bệnh lị

cho các bệnh nhân ðức chiến ñấu ở Bắc Phi

Việc sử dụng ñể ñiều trị bệnh ñược áp dụng những năm 1949 - 1957

khi Henry, Albot và các cộng sự tách ñược các chủng thuần khiết của

B subtilis Từ ñó, “subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra ñời trị các

chứng viêm ruột, viêm ñại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá

Ngày nay, vi khuẩn B subtilis ñược sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi, y học,

thực phẩm….(www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html)

2.1.1.2 ðặc ñiểm phân loại

Theo khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn B subtilis thuộc

Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae

Giống: Bacillus

Trang 16

Loài: B subtilis

2.1.1.3 ðặc ñiểm phân bố

Vi khuẩn B subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở ñường ruột, chúng

ñược phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, ñất nước…

Phần lớn chúng tồn tại ở trong ñất, thông thường ñất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g ðất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, ñất hoang thì B subtilis rất hiếm Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển

có sự tồn tại của bào tử và tế bào sinh dưỡng B subtilis

(.www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages) 2.1.1.4 ðặc ñiểm hình thái

B subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí

hay hiếu khí tùy tiện, thường ñược tìm thấy trong ñất, cỏ khô Có khả năng di ñộng, sinh nội bào tử Tế bào sinh dưỡng có dạng hình que, kích thước chiều rộng từ 0,7 – 0,8 µm, chiều dài từ 2,0 – 3,0 µm, không kết thành chuỗi, bắt phẩm nhuộm ñồng ñều, không tạo bao nang

Hình 2.1 Tế bào Bacillus subtilis

(URL: http://www.ami-tech.co.kr/customer/img/img_08.jpg)

Một trong những ñặc ñiểm quan trọng của B subtilis là khả năng tạo bào

tử trong những ñiều kiện nhất ñịnh B subtilis có khả năng hình thành bào tử

trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp ñiều kiện bất lợi như dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ, nhiệt ñộ quá cao…(Tô Minh Châu,

2000) Bào tử B subilis có dạng ellip ñến hình cầu, kích thước chiều rộng

0,6 - 0,9 µm, chiều dài 1,0 – 1,5 µm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm ñến

Trang 17

gần cuối tế bào, phần lớn ñược tạo thành sau 48 giờ Mỗi cá thể chỉ tạo một bào

tử, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch ñĩa khuẩn lạc tròn, không ñều hay phân tán ðường kính khuẩn lạc từ 3 – 5 mm, màu trắng ñục hoặc vàng xám, rìa có hình răng cưa Sau1 – 4 ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn, màu hơi nâu

2.1.1.5 ðặc ñiểm sinh hoá

Trong môi trường lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ Do

bào tử chịu nhiệt cao nên B subtilis có thể gây hư hỏng một số thực phẩm hộp tạo mùi vị khó chịu B subtilis sinh acid từ xylose, arabinose, glucose,

sucrose và mannitol nhưng không tạo khí (sử dụng nguồn nitơ là muối amonium) Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate Trong ñiều kiện kỵ khí, không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrate

Bảng 2.1 Một số phản ứng sinh hoá của B subtilis

Phản ứng sinh hóa Kết quả

Trang 18

này như một phương pháp ñơn giản ñể thoát khỏi những trường hợp ñiều

kiện sống giới hạn B subtilis có khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại

kháng sinh khác nhau như: subtilin, subtilosin A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillanene, difficidin…

B subtilis phân bố trong ñất, các chất hữu cơ bị phân hủy và là một

ñối tượng dùng trong nghiên cứu khả năng lây bệnh trong phòng thí

nghiệm B subtilis không ñược xem là mầm bệnh gây bệnh cho người

Chúng thường có trong thực phẩm nhưng hiếm khi gây ngộ ñộc thực phẩm

(www.foodnews.ch/ Begriffsglossar_B.html )

2.1.1.6 Ứng dụng của B subtilis

Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, B subtilis là

một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lượng khá lớn (15-20%) từ tinh bột

Trong y dược, B subtilis ñược ñóng thành ống thuốc Subtilis 10 ml

trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh dường ruột

do lị trực tràng, ñắp các vết thương lở loét ngoài da

B subtilis ñược dùng sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong

phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp,

Pylicularia oryzae, Người ta thấy rằng sự phát triển của B subtilis trong

cây làm tăng khả năng tổng hợp các peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ

(Rhizobacterium) Khả năng này ñược ứng dụng trong kiểm soát sinh học

B.subtilis ñược ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic)

bổ sung trong thức ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng; giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi

Hệ enzyme của B subtilis ñược sử dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy

rửa Chúng có thể biến ñổi các dạng chất thải ñộc hại thành những dạng hợp chất vô hại của nitrogen, carbon dioxide, và nước

Một chủng B subtilis ñược biết trước ñây là B natto ñược dùng trong

Trang 19

sản xuất thực phẩm thương mại của Nhật tương tự như thực phẩm

cheonggukjang của Hàn Quốc

B subtilis tái tổ hợp ñược sử dụng trong sản xuất

polyhydroxyalkanoates (PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải như là

nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí sản xuất PHA giảm

2.1.3 Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên

2.1.3.1 Bacillus mesentericus

B mesentericus còn ñược gọi là trực khuẩn khoai tây do chúng có mặt

chủ yếu trên khoai tây Chúng gần giống B subtilis, khuẩn lạc ăn sâu và bám

chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn, khô, không mọc lan ra môi trường,

màu xám nhạt – trắng, hoặc hơi vàng nâu, hoặc hồng như B rubber hoặc ñen

như B niger

B mesentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt ñộ 36 - 45

oC, tối ña 50 – 55 oC, pH = 4,5 - 5 thì ngừng phát triển B mesentericus có

hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn B subtilis nhưng lên men ñường

lại kém hơn

B mesentericus và B subtilis rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây

nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các loại thực phẩm chứa nitơ và các

sản phẩm giàu ñường (bánh kẹo, hoa quả…) Ngoài ra chúng còn sinh một

loại hợp chất có tính kháng một số vi khuẩn khác gọi là bacterioxin, ở B

subtilis gọi là subtilin

2.1.3.2 Bacillus cereus

Vi khuẩn này có mối quan hệ gần gũi với vi khuẩn B anthracis,

B mycodes, B.thurigiensis Bào tử của chúng có hình bầu dục, kích thước

khoảng 0.9 * (1.2 – 1.5) µm, nằm lệch tâm, phát tán khắp nơi, trong ñất, trong

không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể

sinh ñộc tố làm cho thực phẩm hư hỏng và gây ngộ ñộc thực phẩm

Tế bào của B cereus dầy, kích thước (1 – 1,5 * 3 – 5) µm có khi dài hơn,

ñứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi Khuẩn lạc của B cereus phẳng, hơi lõm, nề

Trang 20

mặt hơi xù xì (dạng bột, hoặc hạt nhỏ) trắng ñục, mép lồi lõm

2.1.3.3 Bacillus megaterium

Tế bào B megaterium khá lớn, kích thước (1,2 – 1,5) * (3 – 12) µm

Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dự trữ (hạt mỡ, glycogen) Bào tử lớn, hình oval hay bầu dục, kích thước 1,5 * (0,7 – 1) µm, chúng nằm lệch tâm hướng theo chiều ngang hoặc chiều xiên của tế bào

Khuẩn lạc tròn ñều, lồi nhẵn nhưng thường có vòng viền quanh khuẩn lạc hoặc các vòng ñồng tâm trên bề mặt, không thùy, không nếp, mép tròn ñều hay lượn sóng, màu trắng sữa hay ñục, có khi có màu nâu nhạt

B megaterium sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng ñơn giản không

cần thêm bất cứ yếu tố dinh dưỡng nào khác

2.1.3.4 Bacillus pumilus

Bào tử phát tán rộng, có mặt trong ñất nhiều hơn B bacillus Khuẩn

lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới Tế bào của nó gần giống tế

bào B subtilis

2.1.3.5 .Bacillus polymyxa

Kích thước tế bào khoảng (0,6 - 1) * (2 - 7) µm, ñứng riêng rẽ hoặc xếp thành ñôi, chuỗi ngắn Khi hình thành bào tử tế bào sẽ phồng lên hình quả chanh Bào tử hình bầu dục kéo dài khoảng (1,7 – 2,6) µm, trên bề mặt cắt ngang như hình sao, nằm giữa tế bào, chúng phát tán rộng

Khuẩn lạc của B polymyxa không màu, phẳng hoặc lồi, trơn, lan dần

ra xung quanh, mép ñôi khi có thùy Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật ñang bị hỏng Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm chúng là nguồn ñể sản xuất kháng sinh polymyxin

2.1.3.6 Bacillus simplex

Tế bào B simplex nhỏ bé, kích thước (2 - 5) * 0,6 µm, thường ñứng

riêng rẽ, không xếp thành chuỗi Bào tử hình bầu dục có kích thước 0.6 * 0.9

µm, nằm lệch tâm Khuẩn lạc B simplex giống khuẩn lạc B cereus, chỉ khác

là khuẩn lạc B simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi

Trang 21

trường

2.1.3.7.Bacillus brevis

B brevis là trực khuẩn có kích thước (0,7 - 1) * ( 3 - 5) µm, ñứng riêng

rẽ, ñôi khi xếp thành chuỗi Bào tử hình bầu dục nằm cuối tế bào, làm cho tế

bào một ñầu phình hơi to Khuẩn lạc B brevis có màu trắng, ñôi khi có màu vàng, lồi hoặc phẳng, lấp lánh, mép răng cưa

2.1.3.8 Bacillus aslersporus

B aslersporus có tế bào dày (1,0 – 1,2) * (3 - 7)µm, ñứng riêng rẽ

hoặc xếp thành ñôi Bào tử hình trụ hay hình kéo dài, kích thước 1,0 * (1,5 - 2) µm, nằm giữa tế bào Khi hình thành bào tử tế bào phồng lên một chút

trông giống Clostrdium Khuẩn lạc của B aslersporus nhỏ, màu trắng hay

màu lục nhạt, phẳng, mềm, nhày, ñồng nhất

2.2 Enzyme α - amylase

2.2.1 Cấu tạo α - amylase

Enzyme α - amylase là enzyme thủy phân tinh bột ñược ứng dụng khá rộng rãi trong công nghiệp, y học và các lĩnh vực khác ñồng thời nó cũng là một trong những enzyme ñầu tiên ñược nghiên cứu Mở ñầu là công trình nghiên cứu của Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg (1814) chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành ñường

ở nhiệt ñộ 40oC – 60oC

Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu ñược kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành ñường, ñặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, ñó là amylase Tiếp theo, Leuchs (1851) ñã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành ñường Enzyme α – amylase là endoenzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết - 1,4 - glucoside

Tên hệ thống : 1,4 - D – glucanohydrolase

Tên thường gọi : α - amylase

Mã số enzyme : EC 3.2.1.1

Trang 22

Hình 2.2 Cấu trúc không gian của α - amylase

(URL: plaza.snu.ac.kr/~sewonsuh/home/structures.html)

2.2.2 Tính chất

• α - amylase của vi sinh vật có những ñặc tính rất ñặc trưng về cơ chế tác dụng, khả năng chuyển hóa tinh bột và khả năng chịu nhiệt

• Thể hiện hoạt tính trong vùng acid yếu: α - amylase của nấm mốc có

pH tối thích 4,5 – 4,9; α - amylase của vi khuẩn pH tối thích 5,9 – 6,1 Ở

pH < 3 enzyme bị vô hoạt hoàn toàn trừ α - amylase của Aspergillus niger có

thể chịu ñược pH 2,5 – 2,8 (trong môi trường sinh tổng hợp acid citric bằng phương pháp lên men bề mặt)

• α - amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối, dung dịch ñệm và rượu loãng

• α - amylase hoạt ñộng không cần chất hoạt hóa và cần ion Ca2+ với vai trò là một ñồng yếu tố ñể xúc tác sự thủy phân tinh bột Ion Ca2+ có tác dụng

ổn ñịnh tốt α - amylase trong quá trình thủy phân bằng nhiệt hay kiềm, tăng

ñộ bền của α - amylase trước các tác nhân gây biến tính và tác dụng phân hủy của protease (Lương ðức Phẩm, 2010)

• α - amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần các amino acid khác nhau, mỗi loại α - amylase ñược cấu tạo từ một tổ hợp amino acid ñặc hiệu riêng Tuy nhiên, hàm lượng tryptophan, tyrosine thường chiếm ưu thế Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lượng amino acid

Trang 23

cấu thành phân tử enzyme

• α - amylase của nấm mốc có khả năng dextrin hóa (dịch hóa) cao lại

vừa tạo ra một lượng lớn glucose và maltose Amylase của vi khuẩn lại có hai

loại amylase dịch hóa và amylase ñường hóa

• Nhiệt ñộ hoạt ñộng của α - amylase từ các nguồn khác nhau là khác

nhau α - amylase của vi khuẩn thường bền nhiệt hơn α - amylase từ các loài

vi sinh vật khác và cây trồng, chúng vẫn có thể hoạt ñộng ở nhiệt ñộ mà

α - amylase của nấm mốc và ngũ cốc bị bất hoạt Nhiệt ñộ tối ưu của

α - amylase trong khoảng 54 – 63oC (Hopek, 2006) ðối với α - amylase của

B subtilis nhiệt ñộ tối ưu có thể ñạt ñến 70 – 80 oC α - amylase của vi khuẩn

có thể chịu ñược nhiệt ñộ cao, có thể giữ ñược hoạt lực ngay cả khi ñun sôi

trong nước một thời gian ngắn Tính bền nhiệt này là một ưu ñiểm lớn ñược

sử dụng ñể xử lý nguyên liệu ở các công ñoạn phải dùng nhiệt ñộ cao, hoặc

môi trường nhiệt ñới như ở nước ta ða số các chế phẩm enzyme thương mại

thuộc nhóm α - amylase ñều có tính chịu nhiệt cao

Bảng 1: ðộ bền nhiệt của α - amylase từ các nguồn khác nhau

tối thích

Khoảng nhiệt

ñộ tối thích

1 α - amylase vi khuẩn Bacillus subtilis (6,5 - 7,5) 4,5 – 9 70 - 85

2 khuẩn chịu nhiệt α - amylase vi Bac licheniformic 5,8 – 8 (7,0) 90 – 105

3 α - amylase nấm sợi Aspergillus orizae

Aspergillus niger

4,0 – 7,0 (5,0 – 6,0) 80

4 α - amylase malt Dich malt

Bột Malt

3,5 – 6,5 4,5 – 7

70

85

(Nguyễn ðức Lượng, 2002)

2.2.3 Cơ chế xúc tác

α - amylase (1,4 – α – glucan - glucanhydrolase) từ các nguồn khác

nhau có nhiều ñiềm rất giống nhau, có khả năng phân cắt các liên kết

α - 1,4 - glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc

glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α - amylase

Trang 24

không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc ñột rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α - amylase là quá trình ña giai ñoạn

• Ở giai ñoạn ñầu (giai ñoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất

bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α - dextrin), ñộ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin ñều bị dịch hóa nhanh)

• Sang giai ñoạn 2 ( giai ñoạn ñường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iod Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α - amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α - amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng

α - amylase luôn phân cắt amylose thành từng ñoạn 6-7 gốc glucopiranose 1) Sau ñó, các poliglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm ñến maltotetrose và maltotriose và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α - amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt ñược liên kết

α -1,6 - glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các ñường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

(Nguyễn ðức Lượng, 2004)

Tóm lại, dưới tác dụng của α - amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α - amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iod và một ít maltose Khả năng dextrin hóa cao của

α - amylase là tính chất ñặc trưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa Có thể xác ñịnh hoạt tính enzyme bằng cách ño ñộ nhớt của dung dịch hồ tinh bột hoặc xác

Trang 25

ñịnh lượng tinh bột ñã bị phân giải dựa vào phản ứng màu với iod hoặc bằng

cách xác ñịnh ñường khử tạo thành (Nguyễn ðức Lượng, 2002, Lương ðức Phẩm, 2009

α - amylase

Tinh bột Dextrin (chủ yếu) + Maltose + Glucose H2O

Hình 2.3 Vị trí cắt của α - amylase trên phân tử tinh bột

Theo những nghiên cứu mới trước ñây, do tinh bột có cấu trúc vững chắc nên muốn ñể cho enzyme thủy phân tinh bột (ezyme công nghiệp, vi sinh vật ) hoạt ñộng hiệu quả thì nguyên liệu chứa tinh bột ban ñầu ít nhiều cần phải ñược biến tính Các hình thức biến tính tinh bột có thể kể ñến như các tác ñộng nhiệt (ép ñùn, sấy trống), tác ñộng cơ học (ñồng hóa cao áp), tác ñộng hóa chất (acid hóa , este hóa, phosphat hóa)…

• Sự biến ñổi của tinh bột gây ra bởi xử lý thủy nhiệt (hồ hóa)

Tinh bột ñược biến tính bằng phương pháp nghiền khô ở nhiệt ñộ cao 120 –

150 O C có sản phẩm tạo thành gồm dextrin và pirodextrin Khi hòa tan tinh bột ñã biến tính này vào nước do kích thước phân tử của tinh bột lớn nên ñầu tiên các phân tử sẽ xâm nhập vào giữa các phân tử tinh bột Tại ñây chúng sẽ tương tác với nhóm hoạt ñộng của tinh bột, quay cực, các phổ hồng ngoại và hàm lượng glucose, tạo ra lớp vỏ nước làm cho lực liên kết ở mắt xích nào ñó

Trang 26

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 15

của phân tử tinh bột bị yếu ựi, do ựó phân tử tinh bột bị yếu ựi, phân tử tinh bột bị xê dịch rồi bị ỘrãoỢ ra và trương lên Nếu sự xâm nhập của các phân

tử vào tinh bột dẫn ựến quá trình trương nở không hạn chế nghĩa là làm bung ựược các phân tử tinh bột thì hệ thống chuyển thành dung dịch Quá trình trương nở này luôn ựến trước trước quá trình hòa tan

Cấu trúc của hạt tinh bột gồm có phần cấu trúc tinh thể và vô ựịnh hình Do

có cấu trúc hóa học rất ưa nước nên những hoạt ựộng thủy nhiệt liên quan mật thiết ựến hàm lượng nước tác ựộng Ở nhiệt ựộ thường, hạt tinh bột không hòa tan trong nước đó là do cấu trúc tinh thể của hạt tinh bột quyết ựịnh Sau khi ựược phân tán ựều hạt tinh bột trương nở rất nhẹ nhờ sự hấp thu nước của các phần vô ựịnh hình

Ở nhiệt ựộ cao hơn (khoảng 55 Ờ 60 O C) với lượng ựủ nước, nước xâm nhập vào những vùng có cấu trúc vô ựịnh hình rồi ựến vùng tinh thể của hạt

Vì hoạt ựộng hút nước của các nhóm hydroxyl, hạt tinh bột sẽ trương nở

Dưới tác dụng của nhiệt ựộ (nước nóng), tinh bột mất dần cấu trúc tinh thể, pha này ựược gọi là pha hồ hóa của tinh bột Nhiệt ựộ ựể phá vỡ hạt chuyển tinh bột từ trạng thái ựầu có mức ựộ hydrat hóa khác nhau thành dung dịch keo gọi là nhiệt ựộ hồ hóa Khi nhiệt ựộ ựạt ựến 100 O C, sự phồng nở diễn ra một cách cân ựối và lượng glucid hòa tan tiếp tục tăng Hạt tinh bột tự ựộng phân tán, amylose và amylopectin chuyển thành dạng keo Trong tất cả các trường hợp, sự phân tán hoàn toàn hạt tinh bột chỉ xảy ra khi hấp ở nhiệt ựô

120 Ờ 130 O C trong nhiều giờ

2.2.4 Nguồn thu nhận enzyme α - amylase

Người ta ựã biết nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp

α - amylase, trong ựó ựược sử dụng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và

vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ắt hơn (Lương đức Phẩm; 2010)

Ớ Các giống nấm sợi thường ựược dung ựể thu α - amylase là

aspergillus, rhizopus

Ớ Nhiều chủng vi khuẩn cũng có khả năng tạo lượng lớn α - amylase

Trang 27

như: B polymyxa, Phytoonas destructans, Clostridium acetobutylicum,…

trong ñó các chủng vi khuẩn ưa nhiệt tạo nhiều α - amylase ñáng chú ý là

B diastaticus, B stearothermophilus, B coagulans, B circulans; vi khuẩn ưa

ẩm tạo α - amylase mạnh ñược nhiên cứu nhiều hơn cả và sử dụng rộng rãi

nhất là B subtilis

Những chủng vi sinh vật tạo nhiều α - amylase thường ñược phân lập

từ các nguồn tự nhiên Trong công nghiệp, các biến chủng tạo ra bằng cách gây ñột biến, nhờ tác nhân lý học hoặc hóa học hoặc phối hợp cả hai loại tác nhân trên, là những chủng hoạt ñộng rất mạnh và có khả năng sinh tổng hợp nhiều α - amylase

2.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sinh tổng hợp α - amylase của vi sinh vật

• Giống vi sinh vật

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến sự hình thành α - amylase và lượng

α - amylase của vi sinh vật như: chủng vi sinh vật , môi trường dinh dưỡng,

ñiều kiện nuôi cấy… trong các yếu tố trên thì chủng giống vi sinh vật là ñiều kiện ñầu tiên và cơ bản nhất

• Nguồn dinh dưỡng

Trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật cần phải ñảm bảo ñầy ñủ, thích hợp các thành phần và tỉ lệ các chất dinh dưỡng cho từng vi sinh vật cụ thể

• Ảnh hưởng nguồn cacbon

Thành phần và hàm lượng cacbon có ảnh hưởng lớn ñến sinh tổng hợp

enzyme α - amylase Theo số liệu của Grigorev về ảnh hưởng của nguồn cacbon tới cường ñộ sinh tổng hợp α - amylase có thể xếp theo thứ tự sau:

tinh bột > dextrin > maltose > lactose > glucose > sacarose > galactose >

manose > arabinose (Lương ðức Phẩm; 2010)

• Ảnh hưởng nguồn nitơ

Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin ñể cấu tạo nên các protein

cấu trúc cho các phân tử của enzyme α - amylase Các hợp chất hữu cơ là

những nguyên liệu giàu ñạm như cao ngô, bột ñậu tương, khô lạc, khô ñậu,… ngoài ra còn có một số axit amin, bazơ purin, pyrimidin cũng thường ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Ngoài hai nhân tố cơ bản trên, trong môi trường dinh dưỡng của vi

Trang 28

sinh vật sinh enzyme nói chung cần phải có mặt nhiều nguyên tố khoáng ở dạng muối Mg, P, K,… và các nguyên tố vi lượng Ví dụ ion Mg2+ có tác

dụng làm ổn ñịnh α - amylase ở nhiệt ñộ cao, Ca2+ có trong thành phần protein của α - amylase

• ðiều kiện nuôi cấy

Trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật các yếu tố như nhiệt ñộ, ñộ ẩm,

ñộ pH, thời gian nuôi cấy,… cũng ảnh hưởng lớn ñến sự tạo thành enzyme α - amylase của vi sinh vật

- Ảnh hưởng của nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ tối thích cho sinh tổng hợp enzyme α - amylase của các vi

sinh vật là khác nhau Ví dụ ở ña số nấm mốc trên môi trường rắn là

28 - 320C, của vi khuẩn là 30 - 350C

- Ảnh hưởng của pH môi trường

pH ban ñầu của môi trường ảnh hưởng không nhỏ ñến sự phát triển và

tạo thành enzyme ða số nấm mốc phát triển và tạo α - amylase ở môi trường

axit yếu, trong khi ñó vi khuẩn lại thích hợp trong môi trường trung tính pH môi trường không chỉ ảnh hưởng ñến lượng enzyme tổng hợp mà còn ảnh hưởng ñến chủng loại enzyme ñược tổng hợp

- Ảnh hưởng ñộ ẩm của môi trường nuôi cấy

Trong quá trình sản xuất cần phải duy trì ñộ ẩm của môi trường, vì ñộ

ẩm cao sẽ làm giảm ñộ thoáng khí của môi trường, còn ñộ ẩm thấp lại kì hãm

sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật ðộ ẩm của môi trường xốp thích hợp nuôi vi khuẩn là 50 –70%

- Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn ñến sự hình thành enzyme ðối với

ña số nấm mốc khi nuôi ở môi trường xốp, sự tạo thành α - amylase thường kết thúc khi nấm mốc bắt ñầu sinh bào tử, thời gian kết thúc sự tạo thành

α - amylase thường từ 30 - 42 giờ Còn ñối với vi khuẩn, sự tạo thành

α - amylase tốt nhất từ khoảng 40 - 50 giờ Còn nuôi cấy chìm sinh trưởng

Trang 29

của chủng giống ñạt cực ñại tới pha ổn ñịnh trước, khoảng từ 5 ñến 8 giờ sau thì hoạt ñộ enzyme α - amylase ñạt cực ñại

2.2.6 Tách và làm sạch enzyme

Phần lớn các enzyme thủy phân dễ hòa tan trong nước nên có thể tách chiết enzyme từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn bằng cách lọc hay ly tâm ðể tinh sạch enzyme người ta thường dùng phương pháp kết tủa phân ñoạn bằng dung môi hữu cơ hay các dung dịch muối trung tính (K.Clarkson, 2000) Phương pháp tinh sạch enzyme ñược sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phương pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol

và aceton) Tỷ lệ dung môi và dịch enzyme là một chỉ tiêu quan trọng, nếu thiếu dung môi sẽ không thu hồi hết enzyme trong dung dịch (Ngô Xuân Mạnh và cộng sự, 2005) Thông thường người ta thêm 3 – 4 thể tích dung môi vào 1 thể tích nước chiết enzyme ðể tránh mất hoạt tính của enzyme, dung môi và enzyme phải ñược làm lạnh xuống 3 – 5 oC Phương pháp này cho hiệu suất cao, ít ảnh hưởng ñến hoạt tính enzyme, dễ tách dung môi khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ Có thể thu hồi dung môi bằng chưng cất

Phương pháp phổ biến thứ hai ñể tách enzyme là dùng muối trung tính ñể kết tủa Muối trung tính thường dùng là (NH4)2SO4 với tỷ lệ 50 – 60 %

so với dịch chiết enzyme (Lương ðức Phẩm, 2010)

2.2.7 Ứng dụng enzyme α - amylase

Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme α - amylase các loại ñã và ñang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp Dưới ñây là một vài ứng dụng thực tế của enzyme α - amylase

2.2.7 1 Ứng dụng trong tiêu hóa:

Enzyme α - amylase ứng dụng sản xuất sản phẩm chữa men tiêu hóa dành cho trẻ sơ sinh và trẻ em, kích thích tiêu hóa, chống suy dinh dưỡng và

cá sản phẩm cùng loại: Minigadine, Trymo, Calcinol_RB, Calcinol 1000… 2.2.7.2 Ứng dụng trong y dược:

Trong y dược α - amylase ñược sử dụng:

Trang 30

+ Phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP, carboxylase ñể chế thuốc ñiều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh

+ Phối hợp với enzyme thủy phân chữa bệnh thiếu enzyme ñường tiêu hóa Trong cơ thể, enzyme α - amylase là hormon tuyến tụy ngoại tiết có tác dụng chống phù nề sau chấn thương hoặc sau mổ ðiều trị triệu chứng phản ứng viêm kèm nhiễm khuẩn ñường hô hấp trên hoặc dưới Các sản phẩm chứa enzyme α - amylase có tác dụng kiểm soát lượng calo của cơ thể

2.2.7.3 Ứng dụng trong sản xuất thức ăn gia súc và nuôi trồng thủy sản

ðể giúp cho gia súc có thể tăng khả năng tiêu hóa thực phẩm, người ta thường bổ sung vào trong thức ăn một lượng emzyme α - amylase hoặc ủ lên men thức ăn gia súc Lượng emzyme này sẽ giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột diễn ra tốt hơn, tăng khả năng hấp tiêu hóa thức ăn, phòng ngừa bệnh tiêu chảy do thức ăn khó tiêu.Enzyme α - amylase thường ñược bổ sung trong thành phần các hợp chất hóa học nhằm cải tạo ao hồ, kích thích tăng trưởng

và phát triển mạnh của ñộng vật thủy sản ở các giai ñoạn mong muốn (Võ Thị Hạnh, 2003)

2.2.7.4 Ứng dụng trong công nghiệp dệt:

Sau khi vải ñược hồ hóa ñể làm mịn, người ta phải tiến hành quá trình

rũ hồ vải Phương pháp làm sạch hồ tinh bột ñược sử dụng là dung enzyme α – amylase phá hủy nhanh lượng tinh bột thừa Người ta ñưa nhiệt ñộ ñến nhiệt ñộ sôi sau ñó làm giảm xuống 50°C hay 60°C và cho enzyme α - amylase vào 2.2.7.5 Ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa:

Enzyme α - amylase của vi khuẩn là một trong những enzyme thường ñược ứng dụng trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, do enzyme này có khả năng chịu nhiệt cao (khoảng 90°C), pH cao (pH = 8) Enzyme α - amylase làm tăng khả năng phân giải các vết bẩn do carbonhydrat trong quần áo

α - amylase bẻ gãy các mạch tinh bột trên mặt giấy, làm lỏng các phân

tử mang màu bám trên ñó, tạo thuận lợi cho quá trình tuyển nổi khử mực 2.2.7.6 Ứng dụng trong sản xuất bia

Trang 31

ðể làm giảm chi phí nguyên liệu, trong quá trình lên men tạo bia nhà sản xuất không sử dụng hoàn toàn 100% nguyên liệu là malt ñại mạch mà có

sự pha trộn theo một công thức nào ñó ñể thay thế malt và bổ sung nguồn tinh bột cho quá trình lên men Chính vì ñiều này, các nhà sản xuất bia quan tâm ñến việc sử dụng chế phẩm enzyme α - amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột (Lê Văn Nhương, 1978)

Trang 32

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

3.1.1 ðối tượng

Là các chủng trực khuẩn ñược phân lập từ ñất vườn qua trung gian cỏ khô Các mẫu ñất làm thí nghiệm ñược lấy từ vườn thí nghiệm của Viện Sinh học, trường ñại học Nông Nghiệp Hà Nội

- Máy ly tâm - Ống ñong

- Máy ño mật ñộ quang…

3.2.1 Môi trường phân lập và nuôi bacillus (MPA)

Pepton 10g Cao thịt 5g NaCl 5g Agar 10g

Trang 33

ðể thử hoạt tính amylase sử dụng dung dịch Lugol, ño vòng thủy phân tinh bột

3.3 Các phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập các chủng Bacillus từ ñất vườn qua trung gian cỏ khô

Lấy 10g ñất vườn ở ñộ sâu 0 - 5 cm nghiền nhỏ cho vào bình tam giác, thêm 90ml nước cất vô trùng lắc ñều ñể tạo huyền phù, gia nhiệt tới 850C trong 20 – 25 phút Cắt nhỏ một ít cỏ khô, rắc xung quanh cỏ 2g bột CaCO3

rồi cho vào bình tam giác trên sao cho nước vừa ngập cỏ, ñể từ 1 - 2 ngày ở nhiệt ñộ phòng ðổ 10ml môi trường phân lập vào ñĩa petri vô trùng, ñể nguội

và cấy một lần que cấy vòng từ màng vi sinh vật mọc trên mặt lớp cỏ khô lên

bề mặt môi trường ñặc, dùng que gạt ñều, sau ñó gói ñĩa petri và cho vào tủ

ấm 25 – 350C Sau 2 – 3 ngày thấy xuất hiện các khuẩn lạc riêng biệt trên mặt

môi trường thạch (Nguyễn ðức Lượng, 2003)

3.3.2 Phương pháp giữ giống cấy chuyền

ðổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, ñể nghiêng ống nghiệm Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng lấy dịch vi khuẩn phân lập ñã ñược pha loãng bằng nước cất vô trùng và cấy zic zắc trên bề mặt thạch nghiêng Nút

Trang 34

ống nghiệm lại, ñặt vào tủ ấm ở 370C, sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển vào tủ lạnh ở 40C ñể giữ giống (Nguyễn Lân Dũng, 1983)

Giống ñược cấy chuyền hàng tháng và hoạt hóa trước khi nhân giống

3.3.3 Phương pháp nuôi cấy bề sâu

ðặc ñiểm

Phương pháp nuôi cấy bề sâu là phương pháp ở ñó vi sinh vật phát triển hẳn trong môi trường, môi trường nuôi cấy là môi trường lỏng Môi trường nuôi cấy này phải chứa nhiều chất dinh dưỡng, có khả năng hòa tan cao và phải ñầy ñủ những thành phần dinh dưỡng cơ bản và dinh dưỡng ñặc hiệu ðặc ñiểm của phương pháp này là nếu enzyme ngoại bào do vi sinh vật tiết vào môi trường trong suốt quá trình nuôi cấy thì chế phẩm có thể thu ñược

từ nước lọc sau khi tách bỏ vi sinh vật (Phạm văn Ty, 2007; Trần Linh Thước, 2001)

Tiến hành

Vi khuẩn trong các ống thạch nghiêng giữ giống sẽ ñược pha loãng với 10ml nước cất vô trùng Lắc ñều bằng vontex, xác ñịnh mật ñộ tế bào, pha loãng với nước cất vô trùng ñưa về mật ñộ tế bào 109 CFU/ml Chuẩn bị 90ml môi trường nuôi sinh tổng hợp enzyme amylase trong các bình tam giác 250ml, ñem hấp khử trùng ở 121atm trong 30 phút Lấy 10ml chứa dịch vi khuẩn có mật ñộ tế bào 109 CFU/ml ñổ vào 90ml môi trường trên Ta ñược

100 ml dịch vi khuẩn có mật ñộ tế bào tế bào 107CFU/ml Tất cả các thao tác ñều ñược thực hiện trong buồng cấy vô trùng ðặt bình tam giác lên máy lắc

và tiến hành khảo sát

3.3.4 Một số phương pháp nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học của Bacillus

• Phương pháp nhuộm Gram

Với mục ñích chọn các chủng có khả năng nhuộm màu Gram (+) ðây

là phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu ñược sử dụng phổ biến ñể quan sát ñặc ñiểm hình thái, ñếm số lượng vi khuẩn Những tiêu bản này có thể giữ ñược lâu

Trang 35

- Nguyên tắc: khả năng bắt màu của vi sinh vật có liên quan ñến muối

magie của axid ribocleic Khi nhuộm muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại tryphenylmetan (gelatin violet, oryatan violet, metyl violet) và không bị mất màu dưới tác dụng của cồn Những vi khuẩn như thế gọi là vi khuẩn gram dương (Gr +), ngược lại những vi khuẩn không giữ ñược màu khi nhuộm gọi

là vi khuẩn gram âm (Gr -)

- Cách tiến hành: cho một giọt nước cất lên phiến kính, dùng que cấy

vô trùng lấy một ít tế bào vi khuẩn mọc trên môi trường ñặc hòa vào giọt nước Hơ phiến kính lên ngọn lửa ñèn cồn 2-3 lần, chú ý không ñể phiến kính nóng quá vì như thế tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng Khi giọt nước bay hơi dần vi khuẩn sẽ gắn chặt vào phiến kính

Nhuộm màu nhờ tím gentian bằng cách nhỏ thuốc nhuộm này lên vết bôi, giữ 1 - 2 phút rồi rửa bằng nước cất Tiếp theo nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản ñể trong 1 phút rồi ñổ thuốc ñi và tráng bằng nước cất Sau ñó rửa bằng cồn 960 trong thời gian khoảng 30 - 40 giây Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi ñể khô vết bôi Sau ñó nhuộm bổ sung bằng Fucshin loãng khoảng 1 –

2 phút Rửa lại bằng nước cất cho ñến khi hết màu rồi ñợi khô Quan sát dưới kính hiển vi quang học, nếu vi khuẩn nhuộm màu tím là vi khuẩn Gram

dương Ngược lại, vi khuẩn nhuộm màu hồng là vi khuẩn Gram âm (Phạm văn Ty, 2007; Trần Linh Thước, 2001)

• Phương pháp nhuộm bào tử

Bào tử vi khuẩn không phải là cơ quan sinh sản và thường có hai dạng: hình cầu và hình bầu dục Khi tế bào sống trong môi trường không thích hợp cho sự sinh trưởng hoặc khi tế bào ñã trải qua giai ñoạn phát triển mạnh nhất thì bào tử ñược hình thành

- Nguyên tắc: Khi tế bào ñược xử lý bằng nhiệt hay / và acid thì tế bào

chất của bào tử rất dễ bắt màu Nhuộm cả tế bào chất của bào tử và tế bào với thuốc nhuộm có hoạt tính nhuộm mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất của tế bào

và nhuộm nó với thuốc nhuộm phân biệt khác Khi ñó tế bào chất mang một

Trang 36

màu và bào tử sẽ mang màu khác

- Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trên môi trường MPA ñặc trong tủ ấm

370C sau 5 ngày làm vết bôi trên một phiến kính sạch và ñể khô tự nhiên

Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa ñèn cồn cho bốc hơi trong 2 phút rồi rửa với nước Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Funshin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng cho ñến bốc hơi trong vòng 5 phút Rửa vết bôi bằng nước Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút Rửa vết bôi bằng nước Nhuộm vết bôi bằng xanh methylene trong 5-15 phút Rửa lại với nước và ñể khô tự nhiên Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (100X) Bào tử sẽ mang màu ñỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh

• Phương pháp phát hiện hoạt tính catalase

Phương pháp này dùng ñể xác ñịnh vi khuẩn hiếu khí Trước khi thử hoạt tính catalase cần phải tiến hành cấy dàn vi khuẩn trên ñĩa petri có môi trường MPA ñặc, nuôi trong tủ ấm 370C Sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì nhỏ một giọt dung dịch H2O2 10% lên khuẩn lạc Nếu thấy có bọt khí xuất hiện thì chứng tỏ có catalase trong tế bào, và kết luận là chủng vi khuẩn hiếu khí

(Nguyễn Lân Dũng, 2003)

• Quan sát ñặc ñiểm khuẩn lạc

Quan sát một số chỉ tiêu của chủng nghiên cứu trên môi trường nuôi

Bacillus: Khả năng phát triển của khuẩn lạc, bề mặt khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc (Nguyễn Lân Dũng, 2003)

• Làm tiêu bản tế bào sống

Loại tiêu bản này dùng ñể xem hình dạng, kích thước và sự sắp xếp các tế bào, khả năng hình thành bào tử

- Cách tiến hành: lấy một phiến kính khô và sạch ñặt lên giá ñỡ, nhỏ

một giọt nước lên giữa phiến kính Dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật mọc trên môi trường ñặc MPA hòa nhẹ vào giọt nước trên phiến kính ñể tạo huyền

Trang 37

phù ðậy nhẹ lá kính ñể tránh tạo bọt thành khí Dùng giấy thấm hút lượng nước thừa ở quanh lá kính Mọi thao tác phải ở cạnh ngọn lửa ñèn cồn, và mọi dụng cụ phải ñược làm sạch, vô trùng Sau ñó ñặt tiêu bản lên bàn kính và

quan sát với vật kính 100X (Nguyễn Lân Dũng, 2003; Phạm văn Ty, 2007; Trần Linh Thước, 2001)

3.3.5 Thử các phản ứng sinh hoá (ðồng thị thanh Thu, 2002; Phạm Thị Ánh Hồng, 2004)

3.3.5.1 Kiểm tra khả năng lên men ñường

• Nguyên tắc: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men ñường thì ñường sẽ

bị lên men rượu, rượu hoá acid làm pH môi trường giảm làm chuyển màu môi trường

• Chuẩn bị:

- Môi trường ñường: glucose, maltose, saccharose, lactose

- Vi khuẩn LB3

• Tiến hành

Cho vào mỗi ống nghiệm một ống durham, ñem hấp khử trùng ở

121oC trong 15 phút Sau ñó cấy vi khuẩn vào môi trường, ñem ủ ở

37oC/24 giờ Quan sát sự ñổi màu, sinh hơi

• Kết quả

- Phản ứng (-): môi trường có màu hồng ñỏ

- Phản ứng (+): môi trường có màu vàng

3.3.5.2 Kiểm tra khả năng sinh Indol

• Nguyên tắc: phát hiện các vi sinh vật có enzyme trytophanase chuyển hóa tryptophan tạo thành Indol

Trang 38

24 giờ Sau ñó nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacc vào môi truờng và ñọc kết quả

- Phản ứng VP (-): Môi trường có màu vàng

- Phản ứng VP (+): Môi trường có màu ñỏ

3.3.5.4 Phản ứng Methyl-Red

• Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid bền Vi khuẩn có phản ứng MR dương tính, pH môi trường sẽ ngày càng giảm Vi khuẩn có phản ứng MR âm tính pH môi trường tăng dần (các sản phẩm có tính acid tạo thành lại chuyển hóa tạo thành các sản phẩm trung tính)

Trang 39

• Tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn vào môi trường Clark Lubs, nuôi ở 37 oC trong 24 giờ Sau ñó nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Methyl-Red vào canh khuẩn, và ñọc kết quả

• Kết quả

- Phản ứng (-): Môi trường có màu vàng

- Phản ứng (+): Môi trường có màu ñỏ

- Môi trường Nitrate

- Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B

- Phản ứng (-): Môi trường có màu vàng

- Phản ứng (+): Môi trường có màu ñỏ

3.3.5.6 Khả năng sử dụng Citrate

• Chuẩn bị:

- Vi khuẩn LB3

- Môi trường Citrate

• Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường citrate, nuôi ở 37oC trong 24 giờ

• Kết quả

- Phản ứng (-): Môi trường có màu xanh lá mạ non

- Phản ứng (+): Môi trường có nàu xanh dương

Trang 40

3.3.6 Phương pháp ñếm khuẩn lạc

Khác với phương pháp ñếm trực tiếp dưới kính hiển vi, phương pháp ñếm khuẩn lạc cho phép xác ñịnh số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Ưu ñiểm của phương pháp này là ñộ nhạy cao, cho phép ñịnh lượng vi sinh vật ở mật ñộ thấp trong mẫu

• Cách thực hiện:

- Pha loãng mẫu theo dãy thập phân: Mẫu ñược pha loãng tuần tự thành dãy các nồng ñộ thập phân: hút 1 ml mẫu (hoặc dung dịch có ñộ pha loãng trước ñó) vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất ñã khử trùng, lắc ñều

- Sau khi ñã pha loãng thành các nồng ñộ 10-3, 10-4, 10-5,10-6,… hút

1 ml dịchpha loãng ở mỗi nồng ñộ cho vào ñĩa petri ðổ khoảng 15 - 20

ml môi trường ñãkhử trùng và ñể nguội ñến 45 – 500C vào ñĩa petri có mẫu Xoay nhẹ ñĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim ñồng hồ vài lần ñể dung dịch giống ñược trộn ñều trong môi trường cấy ðậy nắp ñĩa petri, ñể ñông tự nhiên, lật ngược ñĩa Sau 24 giờ tiến hành ñếm số lượng khuẩn lạc

mọc trên ñĩa (Lê Duy Linh, 2001)

• Tính kết quả

Mật ñộ tế bào vi khuẩn trong mẫu ban ñầu tính từ số liệu của ñộ pha loãng Di ñược tính theo công thức:

Mi = Ai * Di/V Trong ñó: Mi là mật ñộ tế bào (CFU/ml)

Ai là số khuẩn lạc trung bình /ñĩa

Di là ñộ pha loãng

V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi ñĩa (ml)

Mật ñộ tế bào trung bình trong mẫu ban ñầu là trung bình cộng của

Mi ở các nồng ñộ pha loãng khác nhau

3.3.7 Phương pháp ño ñộ ñục

• Nguyên tắc

Định dạng
Số trang	100
Dung lượng	2,71 MB