TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI BAN ðÀO TẠO SAU ðẠI HỌC TRƯƠNG THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME α - AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN THẠC SĨ NƠNG NGHIỆP Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học Mã số : 60.42.02.01 Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS LƯƠNG ðỨC PHẨM TS NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI - 2013 LỜI CAM ðOAN Tơi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tơi xin cam ñoan giúp ñỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Trương Thị Nguyệt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……………………… i LỜI CẢM ƠN ðể hồn thành luận văn tốt nghiệp này, tơi nhận hướng dẫn, giúp đỡ góp ý nhiệt tình q thầy tồn thể cán bộ môn Sinh học phân tử Công nghệ vi sinh – khoa Cơng nghệ Sinh học – Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Trước hết, xin chân thành cảm ơn đến q thầy trường Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội, đặc biệt thầy tận tình dạy bảo cho tơi suốt thời gian học tập trường Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến thầy giáo PGS.TS Lương ðức Phẩm TS Nguyễn Văn Giang ñã dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu giúp hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô môn, bạn sinh viên, gia đình bạn bè tạo nhiều điều kiện để tơi học tập hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Mặc dù tơi có nhiều cố gắng hồn thiện luận văn tất nhiệt tình lực mình, nhiên khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đóng góp q báu quý thầy cô bạn Hà Nội, Ngày 24 tháng 06 năm 2013 Học viên Trương Thị Nguyệt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii MỤC LỤC Lời cam ñoan Lời cảm ơn i ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Danh mục biểu đồ x MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề 1.2 Nội dung ñề tài 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus 2.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.3 Một số Bacillus thường gặp tự nhiên 2.2 Enzyme α - amylase 10 2.2.1 Cấu tạo α - amylase 10 2.2.2 Tính chất 11 2.2.3 Cơ chế xúc tác 12 2.2.4 14 Nguồn thu nhận enzyme α - amylase 2.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sinh tổng hợp α - amylase vi sinh vật 16 2.2.6 Tách làm enzyme 18 2.2.7 Ứng dụng enzyme α - amylase 18 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu 21 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii 3.1.1 ðối tượng 21 3.1.2 Thiết bị dụng cụ 21 3.1.3 Hóa chất 21 3.2 Các mơi trường sử dụng 21 3.2.1 Môi trường phân lập nuôi Bacillus 21 3.2.2 Môi trường cảm ứng sinh tổng hợp amylase Bacillus 22 3.2.3 Mơi trường thử hoạt tính amylase 22 3.3 22 Các phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp phân lập chủng Bacillus từ ñất vườn qua trung gian cỏ khô 22 3.3.2 Phương pháp giữ giống cấy chuyền 22 3.3.3 Phương pháp nuôi cấy bề sâu 23 3.3.4 Một số phương pháp nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học Bacillus 23 3.3.5 Thử phản ứng sinh hố 26 3.3.6 Phương pháp đếm khuẩn lạc 29 3.3.7 Phương pháp ño ñộ ñục 29 3.3.8 Phương pháp xác ñịnh sinh trưởng vi khuẩn theo mật ñộ quang 30 3.3.9 Phương pháp nghiên cứu khả phân hủy tinh bột 30 3.3.10 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase theo Heinkel, 1956 31 3.3.11 Phương pháp nghiên cứu xác định điều kiện ni cấy tối ưu 33 3.3.12 Phương pháp nhiên cứu ñộng học 34 3.3.13 Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy 35 3.3.14 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme amylase từ dịch chiết enzyme thô tác nhân kết tủa 35 3.3.15 Xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase chế phẩm enzyme thu ñược từ tác nhân tủa 37 3.3.16 Xác ñịnh ñộ bền α - amylase thủy phân nguyên liệu nếp trắng 37 3.3.17 Xác ñịnh ñường khử theo phương pháp acid initrosalicylic(DNS) 39 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập tuyển chọn chủng trực khuẩn có hoạt tính amylase cao 4.2 41 41 Xác ñịnh sinh trưởng hoạt ñộ α - amylase chủng LB ñã chọn 46 4.2.1 Xác ñịnh sinh trưởng chủng LB 46 4.2.2 Xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase chủng LB 47 4.3 47 Một số ñặc ñiểm sinh học chủng LB3 4.3.1 ðặc ñiểm hình thái tế bào chủng LB3 47 4.3.3 Khả hình thành bào tử chủng LB3 48 4.3.4 Nghiên cứu khả sinh enzyme catalase 49 4.4 Khảo sát ñặc ñiểm sinh hóa vi khuẩn LB3 50 4.5 Nghiên cứu ñiều kiện ảnh hưởng tới khả sinh tổng hợp α – amylase chủng B subtilis LB3 51 4.5.1 Loại chất 51 4.5.2 Ảnh hưởng nồng ñộ tinh bột tan 53 4.4.3 Ảnh hưởng nhiệt ñộ 53 4.4.4 Ảnh hưởng pH ban ñầu 54 4.4.6 Ảnh hưởng loại muối 55 4.4.7 Nồng ñộ NaCl cao ức chế sinh trưởng 56 4.5 Nghiên cứu động học q trình lên men bình tam giác lít 4.6 58 Tách enzyme từ dịch ni cấy, xác định hoạt độ độ bền enzyme 4.6.1 Tách enzyme từ dịch nuôi cấy với tác nhân tủa khác 59 59 4.6.2 Hoạt ñộ α – amylase CPE amylase thu ñược tác nhân kết tủa 59 4.6.3 Xác ñịnh nhiệt độ tối thích α - amylase 60 4.6.4 Xác định pH tối thích α - amylase 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 4.7 Thử nghiệm khả thủy phân enzyme α – amylase nguyên liệu gạo nếp trắng 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 5.1 Kết luận 64 5.2 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT B : Bacillus CPE : Chế phẩm enzyme OD : Giá trị mật ñộ quang dOD : Hiệu số giá trị mật độ quang v/p : Vịng/phút Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Một số phản ứng sinh hoá B subtilis 2.2 ðộ bền nhiệt - amylase từ nguồn khác 12 3.1 ðặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng phân lập 41 3.2 ðặc ñiểm tế bào khuẩn lạc nuôi cấy môi trường 44 3.3 ðường kính vịng phân giải tinh bột chủng LB 45 3.4 So sánh hoạt ñộ α - amylase chủng LB 47 3.3 Tóm tắt số ñặc ñiểm chủng LB3 49 3.4 Các phản ứng sinh hoá LB3 50 3.5 Sự sinh trưởng chủng LB3 loại chất 51 3.6 Nồng ñộ tinh bột tan ảnh hưởng ñến hoạt ñộ α - amylase 53 3.7 Ảnh hưởng nồng ñộ muối NaCl ñến hoạt ñộ α - amylase 56 3.8 Ảnh hưởng nồng ñộ muối CaCl2 ñến hoạt ñộ α - amylase 58 3.9 Hiệu suất thu nhận CPE α - amylase từ tác nhân tủa 59 3.10 Hoạt ñộ α – amylase thu ñược tác nhân kết tủa 60 3.11 Nhiệt độ tối thích CPE α - amylase 60 3.12 pH tối thích CPE α - amylase 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……………………… viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Tế bào Bacillus subtilis 2.2 Cấu trúc không gian α - amylase 11 2.3 Vị trí cắt α - amylase phân tử tinh bột 14 4.1 Vòng phân giải tinh bột chủng LB3, LB4, LB8 47 4.2 Hình thái tế bào chủng LB3 48 4.3 Bào tử chủng LB3 48 4.4 Hình ảnh thử catalase chủng LB3 49 4.5 Một số phản ứng sinh hóa chủng LB3 51 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix Nghiên cứu ñiều kiện ảnh hưởng tới sinh trưởng khả sinh tổng hợp α–amylase chủng B subtilis LB3 Bảng 3.1 Ảnh hưởng bột gạo ñến sinh trưởng chủng B subtilis LB3 Thời gian (h) Lần Lần Lần Trung bình ðLC 0.672 0.674 0.671 0.672 0.002 0.834 0.845 0.831 0.837 0.007 1.193 1.2 1.198 1.197 0.004 1.125 1.212 1.218 1.185 0.052 50 1.015 1.018 1.012 1.015 0.003 55 0.962 0.965 0.964 0.964 0.002 0.846 0.84 0.842 0.843 0.003 0.713 0.709 0.715 0.712 0.003 20 30 40 45 60 70 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 75 Bảng 3.2 Ảnh hưởng loại chất bột gạo ñến hoạt ñộ α – amylase Thời gian (h) 20 30 40 45 50 55 60 70 dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) Lần Lần Lần Trung bình 0.050 1.332 5.594 0.075 1.998 8.392 0.095 2.531 10.629 0.110 2.930 12.308 0.106 2.824 11.860 0.102 2.717 11.413 0.098 2.611 10.965 0.089 2.371 9.958 0.048 1.279 5.371 0.078 2.078 8.727 0.098 2.611 10.965 0.111 2.957 12.420 0.108 2.877 12.084 0.103 2.744 11.524 0.095 2.531 10.629 0.088 2.344 9.846 0.042 1.119 4.699 0.070 1.865 7.832 0.102 2.717 11.413 0.112 2.984 12.531 0.106 2.824 11.860 0.101 2.691 11.301 0.099 2.637 11.077 0.089 2.371 9.958 0.047 1.243 5.221 0.074 1.980 8.317 0.098 2.620 11.002 0.111 2.957 12.420 0.107 2.842 11.935 0.102 2.717 11.413 0.097 2.593 10.890 0.089 2.362 9.921 Sai số 0.004 0.111 0.466 0.004 0.108 0.452 0.004 0.094 0.393 0.001 0.027 0.112 0.001 0.031 0.129 0.001 0.027 0.112 0.002 0.055 0.233 0.001 0.015 0.065 Bảng 3.3 Ảnh hưởng bột mỳ ñến sinh trưởng chủng B subtilis LB3 Thời gian (h) 20 30 40 45 50 55 60 70 Lần 0.662 0.725 1.128 1.102 0.957 0.925 0.854 0.724 Lần 0.687 0.743 1.144 1.116 0.972 0.939 0.869 0.734 Lần 0.647 0.71 1.113 1.087 0.942 0.91 0.839 0.709 Trung bình 0.665 0.726 1.128 1.102 0.957 0.925 0.854 0.722 ðLC 0.020 0.017 0.016 0.015 0.015 0.015 0.015 0.013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 76 Bảng 3.4 Ảnh hưởng loại chất bột mỳ ñến hoạt ñộ α – amylase Thời gian (h) 20 30 40 45 50 55 60 70 dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) Lần Lần Lần Trung bình 0.066 1.758 7.385 0.087 2.318 9.734 0.102 2.717 11.413 0.108 2.877 12.084 0.104 2.771 11.636 0.100 2.664 11.189 0.098 2.611 10.965 0.095 2.531 10.629 0.068 1.812 7.608 0.085 2.264 9.510 0.105 2.797 11.748 0.116 3.090 12.979 0.108 2.877 12.084 0.102 2.717 11.413 0.097 2.584 10.853 0.092 2.451 10.294 0.062 1.652 6.937 0.088 2.344 9.846 0.107 2.850 11.972 0.102 2.717 11.413 0.101 2.691 11.301 0.101 2.691 11.301 0.096 2.557 10.741 0.097 2.584 10.853 0.065 1.740 7.310 0.087 2.309 9.697 0.105 2.788 11.711 0.109 2.895 12.158 0.104 2.779 11.674 0.101 2.691 11.301 0.097 2.584 10.853 0.095 2.522 10.592 Sai số 0.003 0.081 0.342 0.002 0.041 0.171 0.003 0.067 0.282 0.007 0.187 0.786 0.004 0.094 0.393 0.001 0.027 0.112 0.001 0.027 0.112 0.003 0.067 0.282 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 77 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tinh bột tan ñến sinh trưởng chủng B subtilis LB3 Thời gian (h) 20 30 40 45 50 55 60 70 Lần Lần 0.912 1.212 1.625 1.503 1.358 1.214 1.122 0.936 Lần3 0.918 1.209 1.623 1.502 1.356 1.214 1.115 0.931 0.915 1.214 1.621 1.502 1.353 1.218 1.128 0.942 TB ðLC 0.915 1.212 1.623 1.502 1.356 1.215 1.122 0.936 0.003 0.003 0.002 0.001 0.003 0.002 0.007 0.006 Bảng 3.6 Ảnh hưởng tinh bột tan ñến hoạt ñộ α–amylase Thời gian (h) 20 30 40 45 50 55 60 70 0.088 2.344 0.084 2.238 0.084 2.238 Trung bình 0.085 2.273 9.846 0.112 2.984 9.399 0.114 3.037 9.399 0.115 3.064 9.548 0.114 3.028 0.258 0.002 0.041 12.531 0.145 3.863 12.755 0.148 3.943 12.867 0.142 3.783 12.718 0.145 3.863 0.171 0.003 0.080 16.224 0.178 4.742 16.559 0.176 4.689 15.888 0.172 4.582 16.224 0.175 4.671 0.336 0.003 0.081 19.916 0.172 4.582 19.692 0.169 4.502 19.245 0.171 4.555 19.618 0.171 4.547 0.342 0.002 0.041 19.245 0.168 4.476 18.909 0.169 4.502 19.133 0.171 4.555 19.096 0.169 4.511 0.171 0.002 0.041 18.797 0.165 4.396 18.909 0.162 4.316 19.133 0.162 4.316 18.946 0.163 4.342 0.171 0.002 0.046 18.462 0.158 4.209 17.678 18.126 0.155 4.129 17.343 18.126 0.154 4.103 17.231 18.238 0.156 4.147 17.417 0.194 0.002 0.055 0.233 Lần dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase Lần Lần Sai số Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 0.002 0.062 78 (UI/ml) Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng ñộ tinh bột tan ñến sinh trưởng B subtilis LB3 Nồng ñộ tinh bột (%) 0.5 1.5 2.5 Lần 1.186 1.425 1.786 1.602 1.139 Lần2 1.187 1.431 1.782 1.603 1.132 Lần 1.189 1.429 1.787 1.609 1.138 Trung bình 1.187 1.428 1.785 1.605 1.136 Sai số 0.002 0.003 0.003 0.004 0.004 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng ñộ tinh bột tan ñến hoạt ñộ α–amylase chủng B subtilis LB3 Nồng ñộ 0.5 1.5 2.5 0.128 3.410 0.124 3.303 0.134 3.570 Trung bình 0.129 3.428 14.322 0.165 4.396 13.874 0.168 4.476 14.993 0.166 4.422 14.396 0.166 4.431 0.563 0.002 0.041 18.462 0.185 4.928 18.797 0.182 4.848 18.573 0.182 4.848 18.611 0.183 4.875 0.171 0.002 0.046 20.699 0.158 4.209 20.364 0.156 4.156 20.364 0.152 4.049 20.476 0.155 4.138 0.194 0.003 0.081 17.678 0.129 3.437 17.455 0.128 3.410 17.007 0.126 3.357 17.380 0.128 3.401 0.342 0.002 0.041 14.434 14.322 14.098 14.284 0.171 Lần dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) Lần2 Lần Sai số 0.005 0.134 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 79 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến sinh trưởng chủng B subtilis LB3 Nhiệt ñộ Lần Lần2 Lần Trung bình Sai số 25 1.246 1.248 1.249 1.248 0.002 30 1.351 1.354 1.359 1.355 0.004 33 1.517 1.512 1.515 1.515 0.003 37 1.614 1.613 1.618 1.615 0.003 40 1.504 1.509 1.515 1.509 0.006 45 1.34 1.348 1.347 1.345 0.004 48 1.215 1.218 1.217 1.217 0.002 3.10 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ α–amylase chủng B subtilis LB3 Nhiệt ñộ 25 30 33 37 40 45 48 0.108 2.877 0.104 2.771 0.104 2.771 Trung bình 0.105 2.806 12.084 0.135 3.596 11.636 0.138 3.676 11.636 0.136 3.623 11.786 0.136 3.632 0.258 0.002 0.041 15.105 0.155 4.129 15.441 0.152 4.049 15.217 0.152 4.049 15.254 0.153 4.076 0.171 0.002 0.046 17.343 0.178 4.742 17.007 0.176 4.689 17.007 0.172 4.582 17.119 0.175 4.671 0.194 0.003 0.081 19.916 0.166 4.422 19.692 0.167 4.449 19.245 0.165 4.396 19.618 0.166 4.422 0.342 0.001 0.027 18.573 0.159 4.236 18.685 0.158 4.209 18.462 0.156 4.156 18.573 0.158 4.200 0.112 0.002 0.041 17.790 17.678 17.455 17.641 0.171 0.139 3.703 0.138 3.676 0.136 3.623 0.138 3.667 0.002 0.041 15.552 15.441 15.217 15.403 0.171 Lần dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) Lần2 Lần Sai số 0.002 0.062 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……………………… 80 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ NaCl ñến sinh trưởng chủng B subtilis LB3 Nồng ñộ NaCl (%) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Lần 1.014 1.124 1.345 1.618 1.447 1.405 1.314 Lần2 1.014 1.128 1.349 1.621 1.451 1.408 1.321 Lần Trung bình 1.021 1.016 1.131 1.128 1.352 1.349 1.624 1.621 1.453 1.450 1.402 1.405 1.318 1.318 Sai số 0.004 0.004 0.004 0.003 0.003 0.003 0.004 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nồng ñộ NaCl ñến hoạt ñộ α–amylase Nồng ñộ NaCl (%) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.078 0.078 0.073 Trung bình 0.076 2.078 2.078 1.945 2.034 0.077 8.727 0.115 8.727 0.117 8.168 0.116 8.541 0.116 0.323 0.001 3.064 3.117 3.090 3.090 0.027 12.867 0.145 13.091 0.148 12.979 0.141 12.979 0.145 0.112 0.004 3.863 3.943 3.756 3.854 0.094 16.224 0.163 16.559 0.162 15.776 0.161 16.186 0.162 0.393 0.001 4.342 4.316 4.289 4.316 0.027 18.238 0.156 18.126 0.157 18.014 0.155 18.126 0.156 0.112 0.001 4.156 4.182 4.129 4.156 0.027 17.455 0.141 17.566 0.148 17.343 0.146 17.455 0.145 0.112 0.004 3.756 3.943 3.889 3.863 0.096 15.776 0.132 16.559 0.138 16.336 0.133 16.224 0.134 0.403 0.003 3.516 14.769 3.676 15.441 3.543 14.881 3.579 15.030 0.086 0.360 Lần dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase Lần2 Lần Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… Sai số 0.003 81 (UI/ml) Bảng 3.13 Ảnh hưởng nồng ñộ CaCl2 ñến sinh trưởng chủng B subtilis LB3 Nồng ñộ Trung CaCl2(%) Lần Lần2 Lần bình Sai số 1.325 1.322 1.326 1.324 0.002 0.01 1.568 1.564 1.562 1.565 0.003 0.015 1.635 1.642 1.643 1.640 0.004 0.02 1.413 1.415 1.418 1.415 0.003 0.025 1.361 1.368 1.364 1.364 0.004 Bảng 3.14 Ảnh hưởng nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ α – amylase Nồng ñộ CaCl2 (%) 0.01 0.015 0.02 0.025 dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) Lần Lần2 Lần Trung bình Sai số 0.138 3.676 15.441 0.155 4.129 17.343 0.181 4.822 20.252 0.143 3.810 16.000 0.126 3.357 14.098 0.132 3.516 14.769 0.152 4.049 17.007 0.188 5.008 21.035 0.142 3.783 15.888 0.121 3.223 13.538 0.135 3.596 15.105 0.158 4.209 17.678 0.185 4.928 20.699 0.141 3.756 15.776 0.125 3.330 13.986 0.135 3.596 15.105 0.155 4.129 17.343 0.185 4.920 20.662 0.142 3.783 15.888 0.124 3.303 13.874 0.003 0.080 0.336 0.003 0.080 0.336 0.004 0.094 0.393 0.001 0.027 0.112 0.003 0.070 0.296 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 82 Bảng 3.15 Nồng ñộ NaCl ức chế sinh trưởng chủng B subtilis LB3 Nồng ñộ NaCl (%) Lần Lần Lần Trung bình ðLC 0.852 0.842 0.845 0.846 0.005 0.685 0.678 0.682 0.682 0.004 0.543 0.541 0.544 0.543 0.002 0.418 0.415 0.416 0.416 0.002 0.326 0.321 0.324 0.324 0.003 0.251 0.249 0.251 0.250 0.001 0.145 0.142 0.144 0.144 0.002 0.095 0.092 0.094 0.094 0.002 0.064 0.068 0.06 0.064 0.004 10 0.036 0.032 0.034 0.034 0.002 Nghiên cứu ñộng học trình lên men chủng B subtilis LB3 bình tam giác lít Bảng 4.1 : Sinh trưởng chủng B subtilis q trình nghiên cứu động học Trung Thời gian Lần Lần Lần bình ðLC 20 0.912 0.918 0.915 0.915 0.003 30 1.202 1.206 1.204 1.204 0.002 35 1.405 1.408 1.409 1.407 0.002 40 1.625 1.623 1.621 1.623 0.002 45 1.613 1.612 1.612 1.612 0.001 50 1.584 1.586 1.583 1.584 0.002 55 1.574 1.578 1.518 1.557 0.034 60 1.484 1.486 1.489 1.486 0.003 70 1.422 1.415 1.428 1.422 0.007 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 83 Bảng 4.2: Hoạt ñộ α – amylase q trình nghiên cứu động học Thời gian (h) 20 30 35 40 45 50 55 60 70 Lần dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) Lần Lần Trung bình Sai số 0.095 0.096 0.098 0.096 0.002 2.531 2.557 2.611 2.566 0.041 10.629 0.125 10.741 0.128 10.965 0.122 10.779 0.125 0.171 0.003 3.330 3.410 3.250 3.330 0.080 13.986 0.145 14.322 0.148 13.650 0.142 13.986 0.145 0.336 0.003 3.863 3.943 3.783 3.863 0.080 16.224 0.165 16.559 0.168 15.888 0.162 16.224 0.165 0.336 0.003 4.396 4.476 4.316 4.396 0.080 18.462 0.182 18.797 0.181 18.126 0.183 18.462 0.182 0.336 0.001 4.848 4.822 4.875 4.848 0.027 20.364 0.179 20.252 0.178 20.476 0.179 20.364 0.179 0.112 0.001 4.769 4.742 4.769 4.760 0.015 20.028 0.175 19.916 0.178 20.028 0.175 19.991 0.176 0.065 0.002 4.662 4.742 4.662 4.689 0.046 19.580 0.172 19.916 0.175 19.580 0.173 19.692 0.173 0.194 0.002 4.582 4.662 4.609 4.618 0.041 19.245 0.165 19.580 0.168 19.357 0.169 19.394 0.167 0.171 0.002 4.396 4.476 4.502 4.458 0.055 18.462 18.797 18.909 18.723 0.233 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 84 Bảng 4.2: Hoạt độ α – amylase q trình nghiên cứu ñộng học Thời gian (h) 20 30 35 40 45 50 55 60 70 Lần dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Lần Lần Trung bình Sai số 0.095 0.096 0.098 0.096 0.002 2.531 2.557 2.611 2.566 0.041 10.629 0.125 10.741 0.128 10.965 0.122 10.779 0.125 0.171 0.003 3.330 3.410 3.250 3.330 0.080 13.986 0.145 14.322 0.148 13.650 0.142 13.986 0.145 0.336 0.003 3.863 3.943 3.783 3.863 0.080 16.224 0.165 16.559 0.168 15.888 0.162 16.224 0.165 0.336 0.003 4.396 4.476 4.316 4.396 0.080 18.462 0.182 18.797 0.181 18.126 0.183 18.462 0.182 0.336 0.001 4.848 4.822 4.875 4.848 0.027 20.364 0.179 20.252 0.178 20.476 0.179 20.364 0.179 0.112 0.001 4.769 4.742 4.769 4.760 0.015 20.028 0.175 19.916 0.178 20.028 0.175 19.991 0.176 0.065 0.002 4.662 4.742 4.662 4.689 0.046 19.580 0.172 19.916 0.175 19.580 0.173 19.692 0.173 0.194 0.002 4.582 4.662 4.609 4.618 0.041 19.245 0.165 19.580 0.168 19.357 0.169 19.394 0.167 0.171 0.002 4.396 4.476 4.502 4.458 0.055 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……………………… 85 Hoạt độ α - amylase (UI/ml) 18.462 18.797 18.909 18.723 0.233 Hiệu suất thu nhận enzyme α – amylase từ tác nhân tủa khác Bảng Hiệu suất thu nhận enzyme α – amylase từ tác nhân tủa Hiệu suất thu nhận enzyme (g/100ml) Tác nhân tủa Lần Lần Lần Trung bình Sai số Etanol 96o 1.25 1.29 1.27 1.27 0.02 Acetone 1.96 2.01 1.95 1.97 0.03 Sulphate amon 0.84 0.88 0.82 0.85 0.03 Hoạt ñộ CPE amylase thu ñược tác nhân kết tủa Bảng Hoạt ñộ CPE (UI/gCPE) amylase thu ñược tác nhân kết tủa Tác nhân tủa Etanol 96o Acetone Sulphate amon dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) Lần Lần Lần Trung bình Sai số 0.142 3.783 0.141 3.756 0.140 3.730 1588.81 0.093 2.478 1040.55 1577.62 1566.43 0.091 2.424 0.091 2.424 1018.18 1018.18 0.141 3.756 0.001 0.027 1577.62 11.18 0.092 2.442 0.001 0.031 1025.64 12.92 0.067 1.785 0.067 1.785 0.065 1.732 0.066 1.767 0.001 0.031 749.65 749.65 727.27 742.19 12.92 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 86 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ CPE α - amylase Bảng Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hoạt ñộ CPE α - amylase Nhiệt ñộ 50 60 70 75 80 85 90 100 dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) 0.140 Trung bình 0.142 0.002 3.783 3.730 3.774 0.041 1600.00 1588.81 1566.43 1585.08 17.09 0.140 0.138 0.139 0.139 0.001 3.730 3.676 3.703 3.703 0.027 1566.43 1544.05 1555.24 1555.24 11.19 0.135 0.135 0.134 0.135 0.001 3.596 3.596 3.570 3.588 0.015 1510.49 1510.49 1499.30 1506.76 6.46 0.132 0.133 0.135 0.133 0.002 3.516 3.543 3.596 3.552 0.041 1476.92 1488.11 1510.49 1491.84 17.09 0.118 0.117 0.119 0.118 0.001 3.144 3.117 3.170 3.144 0.027 1320.28 1309.09 1331.47 1320.28 11.19 0.072 0.073 0.071 0.072 0.001 1.918 1.945 1.891 1.918 0.027 805.59 816.78 794.40 805.59 11.19 0.039 0.038 0.036 0.038 0.002 1.039 1.012 0.959 1.003 0.041 436.36 425.17 402.80 421.44 17.09 0.012 0.011 0.011 0.011 0.001 0.320 0.293 0.293 0.302 0.015 134.27 123.08 123.08 126.81 6.46 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Lần Lần Lần 0.143 0.142 3.810 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ðLC 87 Ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ CPE α - amylase Bảng Ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ CPE α - amylase pH Lần Lần Lần Trung bình Sai số dOD 0.025 0.028 0.027 0.027 0.002 Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 0.666 0.746 0.719 0.710 0.041 Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) 279.72 313.29 302.10 298.37 17.09 0.065 0.068 0.066 0.066 0.002 4.5 Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 1.732 1.812 1.758 1.767 0.041 Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) 727.27 760.84 738.46 742.19 17.09 dOD 0.095 0.094 0.093 0.094 0.001 Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 2.531 2.504 2.478 2.504 0.027 Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) 1062.94 1051.75 1040.56 1051.75 11.19 0.116 0.115 0.118 0.116 0.002 5.5 Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 3.090 3.064 3.144 3.099 0.041 Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) 1297.90 1286.71 1320.28 1301.63 17.09 dOD 0.139 0.141 0.140 0.140 0.001 Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 3.703 3.756 3.730 3.730 0.027 Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) 1555.24 1577.62 1566.43 1566.43 11.19 0.105 0.103 0.104 0.104 0.001 6.5 Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 2.797 2.744 2.771 2.771 0.027 Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) 1174.82 1152.45 1163.64 1163.64 11.19 dOD 0.092 0.094 0.094 0.093 0.001 Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 2.451 2.504 2.504 2.486 0.031 Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) 1029.37 1051.75 1051.75 1044.29 12.920 0.076 0.074 0.075 0.075 0.001 7.5 Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 2.025 1.971 1.998 1.998 0.027 Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) 850.35 827.97 839.16 839.16 11.19 dOD 0.061 0.062 0.061 0.061 0.001 Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 1.625 1.652 1.625 1.634 0.015 Hoạt ñộ α - amylase (UI/ml) 682.52 693.71 682.52 686.25 6.46 dOD dOD dOD dOD Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 88 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 89 ... thu dịch enzyme α - amylase có hoạt độ cao Tách chiết enzyme α – amylase từ dịch lên men, nghiên cứu ñộ nhiệt ñộ pH tối thích enzyme α – amylase Thử nghiệm khả thủy phân tinh bột enzyme α – amylase. .. 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus 2.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.3 Một số Bacillus thường gặp tự nhiên 2.2 Enzyme α - amylase 10 2.2.1 Cấu tạo α - amylase. .. số chế phẩm enzyme thương mại thu? ??c nhóm α - amylase có tính chịu nhiệt cao Bảng 1: ðộ bền nhiệt α - amylase từ nguồn khác STT Enzym Nguồn α - amylase vi Bacillus subtilis khuẩn α - amylase vi