NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME PHYTASE TỪ Bacillus sp. VÀ THỬ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG PHYTASE TRONG KHẨU PHẦN THỨC ĂN ĐẾN KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN CHO CÁ RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME PHYTASE TỪ Bacillus sp VÀ THỬ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG PHYTASE TRONG KHẨU PHẦN THỨC ĂN ĐẾN KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN CHO CÁ RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : VÕ ĐỨC TUẤN Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 7/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME PHYTASE TỪ Bacillus sp VÀ THỬ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG PHYTASE TRONG KHẨU PHẦN THỨC ĂN ĐẾN KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN CHO CÁ RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG VÕ ĐỨC TUẤN ThS NGUYỄN THỊ THANH TRÚC Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Trước hết xin chân thành cảm ơn Ba Mẹ sinh dưỡng dục nên người Những người thân u gia đình nguồn động viên cho tơi vượt qua khó khăn Ban giám hiệu Trường đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học tất q Thầy Cơ ngồi trường truyền đạt kiến thức cho tơi q trình học tập trường ThS Trương Phước Thiên Hoàng ThS Nguyễn Thị Thanh Trúc tận tình giúp đỡ, dìu dắt, động viên giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài KS Nguyễn Minh Quang ThS Võ Thị Thúy Huệ tạo điều kiện trau dồi kinh nghiệm cho suốt thời gian học trường KS Trần Thị Quỳnh Diệp, KS Trương Thị Ngọc Hân, KS Nguyễn Trường Ngọc Tú, anh chị bạn Bộ môn Công nghệ Sinh học động viên giúp đỡ tơi lúc khó khăn Các bạn Trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản toàn thể lớp DH08SH tận tình giúp đở tơi suốt thời gian làm thí nghiệm Xin chân thành cám ơn Tp Hồ Chí Minh, tháng 7/2012 Võ Đức Tuấn i TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu nhằm thu nhận enzyme phytase từ chủng vi khuẩn Bacillus sp thử nghiệm ảnh hưởng việc bổ sung enzyme phytase phần thức ăn lên khả tăng trưởng, hiệu sử dụng thức ăn sử dụng phosphor cá rơ phi vằn (Oreochromis niloticus) Thí nghiệm tiến hành từ 14 chủng vi khuẩn Bacillus sp 10 chủng Bacillus subtilis Dựa vào đường kính vòng phân giải acid phytic định lượng hoạt độ enzyme phytase môi trường bán rắn chọn chủng Ba58 cho hoạt độ enzyme phytase cao Chủng Ba58 sinh tổng hợp phytase tối ưu điều kiện: mật độ giống 106, thời gian nuôi cấy 48 giờ, nồng độ Ca2+ 0,35%, độ ẩm môi trường khoảng 60% Chế phẩm enzyme thô bổ sung vào thức ăn cho cá nhằm đánh giá ảnh hưởng khả tăng trưởng, hiệu sử dụng thức ăn sử dụng phosphor cá rô phi vằn (O.niloticus) phần thức ăn chứa 27,4% protein thô 4,2% lipid thô bổ sung phytase hàm lượng: 750 U/kg, 1000 U/kg, 1250 U/kg 1500 UI/kg đối chứng (không bổ sung phytase) Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Sau 12 tuần thí nghiệm, kết cho thấy cá cho ăn với thức ăn có bổ sung enzyme phytase giúp cải thiện trọng lượng, tăng trọng, tốc độ tăng trưởng đặc biệt, hệ số biến đổi thức ăn phosphor cá cao so với đối chứng (P < 0,05) Thêm vào đó, việc bổ sung enzyme phytase làm giảm lượng phosphor thải môi trường từ việc ni cá rơ phi vằn Trong đó, bổ sung phytase 1500 U/kg thức ăn mang lại kết cao ii ABSTRACT The study were conducted to acquire phytase from Bacillus sp strains and the effects of phytase supplementation in diets on growth, feed efficiency and phosphorus content of fish (O.niloticus) Experiment were conducted from 14 strains of Bacillus sp and 10 strains Bacillus sbtilis Based on periphery zone from acid phytic and through quantitative method activity of phytase enzyme were choise strain Bacillus subtilis Ba58 is highest capable of synthesizing phytase Phytase from Ba58 strain biosynthesis optimal with conditions: the seed density 106, culture time was 48 hours, Ca2+ concentration is 0.35%, and relative humidity around 60% Unrefined preparation of phytase were supplemented in diets on growth, feed utilization and phosphorus content of zebra tilapia (O.niloticus) Experiment includes five isonitrogenous (27.4% crude protein) and isolipidic (4.2% crude lipid) were prepared with graded levels of supplemental phytase (750 U/kg, 1000 U/kg, 1250 U/kg and 1500 U/kg) and controls (no added phytase) in diets Each treatment was repeated times for weeks At the end of the experiment, the results show that fish fed with feed supplemented phytase improved final body weight, weight gain and specific growth rate and higher phosphor fish compared to controls (P < 0.05) Furthermore, the addition of phytase reduce the amount of phosphorus discharged from catfish In particular, additional 1500 U phytase/kg feed helps the best results Keywords: Phytase, Bacillus, phosphor iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii ABSTRACT iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC HÌNH xi Chương MỞ ĐẦU 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Enzyme phytase 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2.1 Dựa vị trí nhóm phosphor bị enzyme tác động 2.1.2.2 Dựa khác biệt cấu trúc đặc trưng thủy phân phytase .5 2.1.3 Các nguồn thu nhận enzyme phytase .5 2.1.3.1 Nguồn thực vật .5 2.1.3.2 Nguồn động vật 2.1.3.3 Nguồn vi sinh vật 2.1.3 Cơ chất đặc hiệu enzym phytase 2.1.3.1 Acid phytic muối phytate 2.1.3.2 Các chất khác 2.1.4 Các đặc tính lý hóa enzym phytase 2.1.4.1 Cấu tạo trọng lượng phân tử .8 2.1.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ phytase iv 2.1.4.3 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ phytase .9 2.1.4.4 Ảnh hưởng ion kim loại số hóa chất lên hoạt độ phytase .10 2.1.4.5 Các điều kiện khác ảnh hưởng đến hoạt độ phytase 10 2.1.5 Vị trí phản ứng, sản phẩm cuối phản ứng thủy giải acid phytic 11 2.1.6 Động học enzyme phytase 11 2.1.7 Ứng dụng enzyme phytase 11 2.1.7.1 Trong chăn nuôi nuôi trồng thủy sản .11 2.1.7.2 Trong dinh dưỡng thực phẩm .12 2.1.7.3 Trong sản suất bột giấy công nghiệp giấy .13 2.2 Bacillus enzyme phytase Bacillus 13 2.2.1 Tổng quan Bacillus 13 2.2.3 Cơ chất đặc hiệu enzyme phytase từ Bacillus 15 2.2.4 Các đặc tính lý hóa enzyme phytase từ Bacillus 15 2.2.4.1 Trọng lượng phân tử .15 2.2.4.2 Thành phần acid amin 15 2.2.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH 16 2.2.4.4 Các tác nhân khác ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme phytase .16 2.2.5 Vai trò Ca2+ cấu trúc chức enzyme phytase 16 2.2.6 Sản phẩm cuối động học thuỷ giải acid phytic 17 2.3.1 Phân loại 19 2.3.2 Nguồn gốc 19 2.3.3 Đặc điểm hình thái cá rơ phi vằn (Oreochromis niloticus) 19 2.3.4 Môi trường sống cá rô phi vằn 20 2.3.4.1 Nhiệt độ 20 2.3.4.2 Độ mặn 20 2.3.4.3 Khoảng pH .20 v 2.3.4.4 Hàm lượng Oxy hòa tan 20 2.3.4.5 Hàm lượng NH .21 2.3.5 Dinh dưỡng cho cá rô phi vằn 21 2.3.6 Sinh trưởng cá rô phi vằn 21 2.3.7 Sự sinh sản cá rô phi vằn 21 2.3.7.1 Thành thục sinh dục 21 2.3.7.2 Chu kỳ sinh sản cá rô phi vằn 22 2.3.7.3 Tập tính sinh sản .22 2.3.8 Nhu cầu biến dưỡng phosphor loài cá 22 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 3.2 Vật liệu 24 3.2.1 Giống vi sinh vật 24 3.2.2 Các mơi trường dùng thí nghiệm .24 3.2.3 Dụng cụ , thiết bị, hố chất dung thí nghiệm .24 3.2.3.1 Dụng cụ thí nghiệm 24 3.2.3.2 Thiết bị dùng thí nghiệm 24 3.2.3.3 Hoá chất dùng thí nghiệm .25 3.3 Phương pháp nghiên cứu 25 3.3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm 25 3.1 Khảo sát khả sinh tổng hợp phytase chủng Bacillus sp .25 3.1.1 Định tính 25 3.1.2 Phương pháp khảo sát hoạt độ enzym phytase .26 3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến trình sinh tổng hợp phytase .26 3.3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian mật độ giống 26 3.3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng ion Ca2+ .26 vi 3.3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm 27 3.3.6 Thu nhận enzyme phytase từ Bacillus sp quy mô pilot 27 3.3.7 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm phytase thô 27 3.3.9 Khảo ảnh hưởng enzyme phytase lên hiệu tiêu hóa tăng trọng cá rô phi vằn .28 3.3.9.1 Thức ăn dung thí nghiệm 28 3.3.9.2 Bố trí thí nghiệm .28 3.3.9.3 Phương pháp đánh giá thông số mơi trường thí nghiệm .29 3.3.9.4 Phương pháp thu thập số liệu 29 3.3.9.5 Đánh giá ảnh hưởng phytase đến tỷ lệ sống tăng trưởng cá rô phi 30 3.3.9.6 Đánh giá ảnh hưởng phytase đến hiệu sử dụng thức ăn cá rô phi 30 4.1 Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme phytase chủng Bacillus sp 31 4.1.1 Kết định tính 31 4.1.2 Kết định lượng 32 4.2 Các yếu tố ảnh hưởng lên khả sinh enzyme phytase Ba58 .33 4.2.1 Ảnh hưởng mật độ giống đầu vào thời gian nuôi cấy 33 4.2.2 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường bán rắn 35 4.2.3 Ảnh hưởng nồng độ Ca2+ môi trường bán rắn .35 4.3 Kết nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme phytase thô quy mô pilot 36 4.4 Kết khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm phytase thô 37 4.5 Kết thử nghiệm 38 4.5.1 Các thơng số mơi trường thí nghiệm 38 4.5.1.1 Nhiệt độ nước q trình thí nghiệm 38 4.5.1.2 Hàm lượng oxy hòa tan q trình thí nghiệm 39 4.5.1.3 Thơng số pH q trình thí nghiệm 39 4.5.1.4 Hàm lượng NH3 40 vii 4.5.2 Thành phần sinh hóa cơng thức thức ăn 40 4.5.3 Tăng trưởng tỷ lệ sống cá thí nghiệm 41 4.5.4 Hiệu sử dụng thức ăn cá rơ thí nghiệm 43 4.5.5 Lượng phosphor đào thải mơi trường khí sản xuất kg cá 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO .46 viii 4.5.5 Lượng phosphor đào thải mơi trường khí sản xuất kg cá Đây thông số đánh giá khả làm giảm thiểu ô nhiễm phosphor từ thức ăn ngồi mơi trường qua việc bổ sung enzyme phytase vào thức ăn Kết thể qua biểu đồ (Hình 4.10) Kết cho thấy, lượng phosphor thải nghiệm thức có bổ sung phytase thấp ý nghĩa (P < 0,05) so với nghiệm thức đối chứng khơng bổ sung enzyme phyatse Nghiệm thức có bổ sung phytase 1500 UI/kg thức ăn khơng có dư lượng phospho thải mơi trường Hình 4.10 Lượng phosphor thải môi trường sản xuất kg cá 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chủng Ba58 cho đường kính vòng phân giải acid phytic lớn chủng sinh tổng hợp enzyme phytase cao Chủng Ba58 sinh tổng hợp enzyme phytase cao sau 48 nuôi cấy mật độ giống 106 mơi trường bán rắn có bổ sung 0,35% Ca2+, độ ẩm 60% Chế phẩm enzyme phytase thô chứa 3,1 x 109 tế bào Bacillus subtilis 172,67 đơn vị enzyme phytase g chế phẩm Chế phẩm enzym phytase thơ bổ sung vào thức ăn có tác dụng cải thiện tăng trọng nâng cao hiệu tiêu hóa thức ăn cá rơ phi vằn: Bổ sung phytase nồng độ 1000 UI/ kg thức ăn cho kết tăng trưởng tốt Bổ sung phytase nồng độ 1500 UI/ kg thức ăn cho kết hấp thụ phosphor tốt 5.2 Đề nghị Nghiên cứu thu nhận enzyme phytase chủng Ba58 nhiều chất cảm ứng khác Nghiên cứu tinh enzyme phytase từ chủng Ba58 Khảo sát thêm điều kiện hoạt động tối ưu enzyme phytase để nâng cao hiệu sử dụng chế phẩm Nghiên cứu thử nghiệm enzyme phytase quy mô lớn đối tượng thủy sản khác 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đỗ Thị Ngọc Huyền ctv, 2007 Tinh xác định tính chất phytase tái tổ hợp Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Trang 331 – 336 Lê Thanh Hùng, 2008 Thức ăn dinh dưỡng thủy sản Nhà xuất Nông Nghiệp Tp.HCM, 299 trang Lê Quốc Phong ctv, 2009 Khảo sát ảnh ưởng nguyên liệu, độ ẩm môi trường, nhiệt độ sấy thời gian bảo quản hoạt độ phytase chế phẩm thô nuôi cấy bán rắn Bacillus subtilis Kỷ yếu hội thảo, ứng dụng công nghệ enzyme lĩnh vực nông nghiệp: 183 -188 Nguyễn Đức Lượng, 2006.Thí nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp.HCM, 463 trang Trần Ngọc Thiên Kim 2005 Khảo sát ảnh hưởng phytase lên tăng trưởng khả tiêu hóa cá basa (Pangasius bocourti) Luận văn tốt nghiệp kỹ sư thủy sản, Đại học Nông Lâm TP HCM Trần Thị Thanh Hiền 2004 Dinh dưỡng thức ăn thủy sản Đại học Cần Thơ 138 trang TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI Baldi BG, Franceschi VR, Loewus FA,1987 Localization of phosphorus and cation reserves in Lilium longiflorum pollen Plant Physiol 61: 1018 - 1021 Dipesh Debnath, N P Sahu, A K Pal, Kartik Baruah, Sona Yengkokpam and S C Mukherjee 2005 Present Scenario and Future Prospects of Phytase in Aquafeed Asian-Aust J Anim Sci Vol 18, No 12: 1800-1812 Ha NC, Oh BC, Shin S, Kim HJ, Oh TK and et al 2000 Crystal structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states Nat Struct Biol 7: 147-153 10 Imelda Joseph and R Paul Raj 2007 Isolation and characterization of phytase producing Bacillus strains from mangrove ecosystem Central Marine Fisheries Research Institute, Post Box No 1603: 177- 182 46 11 Janne Kerovuo, Juha Rouvinen and Frank Hatzack 2000 Analysis of myoinositol hexakisphosphate hydrolysis by Bacillus phytase: indication of a novel reaction mechanism Biochem J 352: 623- 628 12 Kim YO, Lee JK, Oh BC and Oh TK 1999 High-level of a recombinant thermostable phytase in Bacillus subtilis Biosci Biotechnol Biochem 63: 2205-2207 13 Kim YO, Kim HK, Bae KS, Yu JH and Oh TK 1998 Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus sp DS11 Enzyme Microb Technol 22: 2-7 14 Ling Cao, Weimin Wang, Chengtai Yang, YiYang, James Diana, Amararatne Yakupitiyage, Zhi Luo and Dapeng Li 2007 Application of microbial phytase in fish feed Enzyme and Microbial Technology 40: 497–507 15 McCance RA, Edgecombe CN and Widdowson EM 1943 Phytic acid and iron absorption Lancet 2: 126-128 16 Nelson TS, Shieh TR, Wodzinski RJ and Ware JH 1968 The availability of phytate phosphorus in soybean meal before and after treatment with a mold phytase Poult Sci 47: 1842-1848 17 Oh BC, Choi WC, Park S, Kim YO and Oh TK 2004 Biochemical properties and substrate specificities of alkaline and histidine acid phytase Apply Microbiol Biotechnol 63: 362 - 372 18 Oh BC, Kim MH, Yun BS, Choi WC, Park SC and et al 2006 Ca2+ -inositol phosphate chelation mediates the substrate specificity of β-propeller phytase Biochem 45: 931-939 19 Phillippy BQ and Graf E 1997 Antioxidant functions of inositol 1,2,3-trisphosphate and inositol 1,2,3,6-tetrakisphosphate Free Radical Biol Med 22 939-946 20 Phillippy BQ, Johnston MR, Tao SH and Fox MRS 1998 Inositol phosphates in processed foods J Food Sci 53 496-499 21 Portz L Liebert F Growth, nutrient utilization and parameters of mineral metabolism in Nile tilapia Oreochromis niloticus fed plant-based diets with graded levels of microbial phytase J Anim Physiol Anim Nutr (Berl) 2004: 311 - 320 22 Thuy Thi Tran 2010 Thermostable phytase from a Bacillus sp Printed by MediaTryck, Lund University, Sweden pp - 25 47 23 Tomschy A, Tessier M, Wyss M, Brugger R, Broger C and et al 2000 Optimization of the catalytic properties of Aspergillus fumigatus phytase based on the three-dimensional structure Protein Sci 9: 1304-1311 24 Yang Mun Choi, Hyung Joo Suh and Jin Man Kim 2001 Purification and Properties of Extracellular Phytase from Bacillus sp KHU-10 Journal of Protein Chemistry, Vol 20, No 4: 287 – 293 25 Yetti Marlida, Rina Delfita , Neni Gusmanizar and Gita Ciptaan 2010 Identification Characterization and Production of Phytase from Endophytic Fungi World Academy of Science, Engineering and Technology 65: 1043 – 1046 26 Wyss M, Brugger R, Kronenberger A, Remy R, Fimbel R, et al 1999 Biochemical characterization of fungal phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): catalytic properties Appl Environ Microbiol 65: 367-373 27 Wolf WJ and Briggs DR 1959 Purification and characterization of 11S component of soybean proteins Arch Biochem Biophys 85: 186-199 28 Wyss M, Pasamontes L, Remy R, Kohler J, Kusznir E et al 1998 Comparison of the thermostability properties of three acid phosphatases from molds: Aspergillus fumigatus phytase, A niger phytase, and A niger pH 2.5 acid phosphatase Appl Environ Microbiol 64: 4446-4451 TÀI LIỆU INTERNET 29 http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=brownian-motion-bacteria 30 http://faculty.evansville.edu/km123/Research/Research.htm 31 http://en.wikipedia.org/wiki/Phytic_acid 32 http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=561 48 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các mơi trường dùng thí nghiệm Mơi trường giử giống Bacillus : Giá đậu Pepton Glucose Agar Nước vừa đủ 200 g 10 g 50 g 24 g 1000 ml Môi trường tăng sinh Bacillus (MT1): Giá đậu Pepton Glucose Nước vừa đủ 100 g 10 g 50 g 1000 ml Mơi trường định tính sinh tổng hợp phytase (MT2): NaNO K2HPO4 MgSO4 KCl FeSO4 Agar Nước cất Acid phytic 33g 1g 0,5g 0,5g 0,1g 20g lít 10g Mơi trường bán rắn sinh tổng hợp phytase (MT3): Bột bắp vàng Bột đậu nành Trấu KH2PO4 (NH4)SO4 CaCl2 Độ ẩm 45 g 45g 10g 0,75g 0,15g 0,3g 50-55% Phụ lục 2: Phương pháp xác định mật độ tế bào Nguyên tắc Đếm số khuẩn lạc mọc môi trường MT1 từ lượng mẫu xác định sở xem khuẩn lạc hình thành từ tế bào Số lượng khuẩn lạc xuất đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường điều kiện ủ Mật độ tế bào lớn làm khuẩn lạc chồng chéo lên nhau, khó xác định Ngược lại, mật độ khuẩn lạc đĩa q nhỏ khơng có ý nghĩa mặt thống kê, số lượng khuẩn lạc tối ưu 25 – 250 khuẩn lạc/ đĩa ( theo FDA, AOAC) Cách thức tiến hành: Bước 1: Pha loãng mẫu theo dãy thập phân Mẫu pha loãng thành dãy nồng độ thập phân 10-1, 10-2, 10-3, Mỗi bậc pha loãng 10-1 thực cách hút 1ml mẫu vào 9ml nước cất có ống nghiệm khử trùng Sau khi lắc kỹ pha loãng 10-1 Tiếp tục pha loãng ta 10-2, 10-3… Bước 2: Tạo hộp trải hay hộp đổ Hộp trải: Lắc ống pha loãng liên tiếp, dùng micro pipet hút 0,1 ml dịch pha loãng dàn mặt thạch que gạt thỷ tinh vơ trùng Mỗi đọ pha lỗng dàn mặt thạch que cấy trang vô trùng Mỗi độ pha loãng cấy lặp lại đĩa petri, đem ủ nhiệt độ thích hợp Hộp đổ: Môi trường chuẩn bị chai thủy tinh hấp khử trùng sau để nguội đến khoảng 50oC ( môi trường dạng lỏng) Dùng micro pipet hút 1ml dịch pha loãng vào đĩa petri trống hấp khử trùng sấy khô (mỗi nồng độ lập lại lần) Sau đổ khoảng 15 ml môi trường chuẩn bị vào đĩa Xoay đĩa để môi trường dịch pha loảng trộn đều, để khơ đem ủ nhiệt dộ thích hợp Phụ lục 3: Phương pháp thu dịch chiết enzyme Cân 1g canh trường hòa tan vào đệm sodium acetat pH 5, lắc lắc khoảng 15 phút để enzym hòa tan hết, lọc bỏ cặn Dịch chiết đem xác định hoạt độ Phụ Lục 4: Phương pháp xác định hoạt độ enzyme (Fiske Subbarow,1925) Nguyên tắc Khi cho phosphate tác dụng với ammonium molybdat tạo phosphomolybdat có màu vàng Khi khử phosphomolybdat, màu vàng chuyển thành màu xanh molybdat Độ đậm màu sắc tỉ lệ với hàm lượng phospho mẫu Phản ứng minh họa sau: 2(MoO2.4MoO3) + H3PO4 + 4H2O (MoO2.4MoO3)2 H3PO4 H2O Các chất khử thường sử dụng SnCl2, hydrazin, acit ascorbic, FeSO4, quinon, oxalat, sulfit Các chất khử sử dụng đơn độc hay phối hợp với Ví dụ: phối hợp sulfit quinon Khi cho phytase tác dụng với chất phytate giải phóng phosphate Dựa vào hàm lượng phosphate sinh để đánh giá hoạt tính enzymephytase Hóa chất - Dung dịch chất sodium phytat 0,2% (m/v ) đệm sodium axetae 0,1M pH5 : cân 1g sodium phytat 500ml sodium acetat 0,1M dùng acid acetic đậm đặc để chỉnh pH5 - Dung dịch phospho mẫu 0,01M: cân 0,136g KH2PO4 hòa với nước thành100ml - Dung dịch phospho 500 nmo/ml: hút 5ml dung dịch phospho 0,01M, pha thành 100ml Dung dịch ammonium molybdat 1,5% (w/v) H2SO4 5,5% ( kí hiệu dung dịch a) + Hút 28ml H2SO4 đđ (98%) pha với nước thành 500ml, dung dịch H2SO4 5,5% + Cân 7,5g ammonium molybdate [(NH4)6Mo7O24 4H2O] hòa tan vào 500ml H2SO4 5,5% vừa pha - Dung dịch FeSO4 5%: cân 5g FeSO4 hòa với nước cất lạnh thành 100ml ( kí hiệu dung dịch b) Pha điều kiện lạnh dùng liền sau pha ( dung dịch FeSO4 phải suốt, khơng màu có màu vàng nhạt, có màu vàng đậm phải pha lại) - Dung dịch thuốc thử phosphat (dùng ngày): hỗn hợp dung dịch a b tỷ lệ a:b = 4:1 - Dung dịch TCA ( acid trichloro acetic) 5% : cân 25g TCA hòa với nước thành 500ml Cách tiến hành: Dựng đường chuẩn: Lấy loạt ống nghiệm sạch, tiến hành pha dung dịch phospho với nồng độ theo bảng 3.4 Bảng 3.1: Xây dựng đường chuẩn phosphor Ống nghiệm Dung dịch phospho 500nmol/ml Nước cất (ml) Nồng độ phospho (nmol/ml) Thuốc thử phosphate (ml) 5 0 100 200 300 400 500 5 5 5 Lắc đều, để yên nhiệt độ phòng (30oC), đem đo mật độ quang bước sóng 700nm Dựng đồ thị biễu diễn biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo nồng độ phospho (nmol/ml) Phản ứng enzyme: Cân m(g) chế phẩm enzyme nghiền hòa với V (ml) nước cất, lắc máy lắc 45 phút để enzyme hòa tan hồn tồn vào nước, lọc qua giấy lọc ta thu dịch enzyme thơ Xác định hoạt tính phytase dịch enzyme Trình tự thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme phytase Ống nghiệm Thử thật Thử không Dung dịch chất phytate (ml) 2 Ứng dịch TCA 5% (ml) 2,5 Dung dịch enzyme (ml) 0,5 Lắc để yên 39oC, 30 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 2,5 Dung dịch enzyme (ml) 0,5 Thuốc thử phosphate (ml) 5 Lắc để yên phút Cách tính: Một đơn vị hoạt tính (đvht) phytase định nghĩa lượng enzyme giải phóng 1nm phospho vô phút từ sodium phytat 39oC, pH5 Với: a: nồng độ phospho suy từ đường chuẩn (nmol) V: thể tích dung dịch phospho trước cho thuốc thử (5ml) L: độ pha loãng enzyme 0,5: thể tích enzyme cho vào phản ứng m: khối lượng chế phẩm enzyme phân tích T: thời gian phản ứng ( phút) Phụ lục 5: Bảng phân tích số liệu chương trình Microsoft Ofice Excel 2007 MSTATC 1.2 5.1 Đường chuẩn phosphor Nồng độ phospho (nmol/ml) L1 L2 L3 Giá trị OD OD TB ΔOD 100 200 300 400 500 0,02 0,02 0,02 0,02 0,185 0,192 0,184 0,187 0,167 0,332 0,333 0,331 0,332 0,312 0,472 0,476 0,479 0,476 0,456 0,625 0,631 0,63 0,629 0,609 0,744 0,742 0,746 0,744 0,724 5.2 Kết vòng phân giải acid phytic Kết phân tích ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 23 329.870 14.342 53.183 0.0000 Within 24 6.472 0.270 -Total 47 336.342 Coefficient of Variation = 9.01% Error Mean Square = 0.2700 Error Degrees of Freedom = 23 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 1.459 at alpha = 0.010 &k2S Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 5.750 5.500 4.750 8.835 3.500 5.500 3.500 11.17 2.750 5.500 5.750 0.0000 2.500 6.750 4.835 5.000 6.000 9.000 9.835 5.500 2.500 6.335 7.585 10.00 EFG EFG GH BC HI EFG HI A I EFG EFG J I DE GH FG EFG BC AB EFG I DEF CD AB Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order 24 19 18 23 14 22 17 11 10 20 16 15 21 13 12 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 11.17 10.00 9.835 9.000 8.835 7.585 6.750 6.335 6.000 5.750 5.750 5.500 5.500 5.500 5.500 5.000 4.835 4.750 3.500 3.500 2.750 2.500 2.500 0.0000 A AB AB BC BC CD DE DEF EFG EFG EFG EFG EFG EFG EFG FG GH GH HI HI I I I J 5.3 Kết định lượng phytase chủng Bs14, Bs24, Ba58, Ba64, Ba85 Bảng kết phân tích ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 28994.503 7248.626 78.603 0.0000 Within 10 922.184 92.218 -Total 14 29916.687 Coefficient of Variation = 8.90% Bảng kết trắc nghiệm phân hạng Error Mean Square = 92.22 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 36.10 at alpha = 0.010 &k2S Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 122.9 65.78 178.0 56.22 116.9 B C A C B Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 178.0 122.9 116.9 65.78 56.22 A B B C C 5.4 Kết khảo sát thời gian mật độ Bảng phân tích ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob Factor A 12459.293 4153.098 39.2310 0.0000 Factor B 645319.533 80664.942 761.9781 0.0000 AB 24 62020.813 2584.201 24.4109 0.0000 -7 Error 72 7622.103 105.863 Total 107 727421.743 -Coefficient of Variation: 7.05 Bảng kết trắc nghiệm phân hạng Error Mean Square = 105.9 Error Degrees of Freedom = 24 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 23.50 s_ = 5.940 at alpha = 0.010 x &k2S Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 58.44 84.45 151.1 211.1 297.8 202.2 126.7 82.22 55.55 73.33 111.1 157.8 224.4 337.8 266.7 133.3 106.7 66.67 80.00 93.33 126.7 284.4 268.9 222.2 Ranked Order QRS MNOPQ GHI D B DE IJK NOPQ RS PQR JKL FGH D A C HIJ KLMN QR OPQR LMNOP IJK BC C D Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 14 22 23 31 15 13 24 32 30 33 12 16 21 29 11 34 17 25 28 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 337.8 297.8 284.4 268.9 266.9 266.7 224.4 222.2 211.1 202.2 200.0 182.2 166.7 157.8 151.1 133.3 126.7 126.7 120.0 111.1 108.9 106.7 104.4 93.44 A B BC C C C D D D DE DE EF FG FGH GHI HIJ IJK IJK JK JKL JKLM KLMN KLMNO LMNOP Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 = = = = = = = = = = = = 104.4 73.33 28.89 93.44 120.0 182.2 266.9 200.0 166.7 108.9 55.55 33.33 KLMNO PQR T LMNOP JK EF C DE FG JKLM RS ST Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 20 19 26 10 18 35 36 27 = = = = = = = = = = = = 93.33 84.45 82.22 80.00 73.33 73.33 66.67 58.44 55.55 55.55 33.33 28.89 LMNOP MNOPQ NOPQ OPQR PQR PQR QR QRS RS RS ST T ... vằn Trong đó, bổ sung phytase 1500 U/kg thức ăn mang lại kết cao ii ABSTRACT The study were conducted to acquire phytase from Bacillus sp strains and the effects of phytase supplementation in... diets on growth, feed efficiency and phosphorus content of fish (O.niloticus) Experiment were conducted from 14 strains of Bacillus sp and 10 strains Bacillus sbtilis Based on periphery zone from... and higher phosphor fish compared to controls (P < 0.05) Furthermore, the addition of phytase reduce the amount of phosphorus discharged from catfish In particular, additional 1500 U phytase/kg