Nghiên cứu thu nhận enzyme α amylase từ trực khuẩn bacillus subtilis

TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I BAN ðÀO T O SAU ð I H C  TRƯƠNG TH NGUY T NGHIÊN C U THU NH N ENZYME α - AMYLASE T TR C KHU N Bacillus subtilis LU N VĂN TH C SĨ NÔNG NGHI P Chuyên ngành : Công ngh Sinh h c Mã s : 60.42.02.01 Gi ng viên hư ng d n : PGS.TS LƯƠNG ð C PH M TS NGUY N VĂN GIANG HÀ N I - 2013 L I CAM ðOAN Tơi xin cam đoan s li u k t qu nghiên c u lu n văn hồn tồn trung th c chưa đư c s d ng ñ b o v m t h c v Tơi xin cam đoan m i s giúp ñ cho vi c th c hi n lu n văn ñã ñư c c m ơn thơng tin trích d n lu n văn đư c ghi rõ ngu n g c Tác gi lu n văn Trương Th Nguy t Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… i L I C M ƠN ð hoàn thành lu n văn t t nghi p này, ñã nh n ñư c s hư ng d n, giúp đ góp ý nhi t tình c a q th y tồn th cán b b môn Sinh h c phân t Công ngh vi sinh – khoa Công ngh Sinh h c – Trư ng đ i h c Nơng nghi p Hà N i Trư c h t, xin chân thành c m ơn đ n q th y trư ng Trư ng đ i h c Nơng nghi p Hà N i, ñ c bi t nh ng th y t n tình d y b o cho su t th i gian h c t p t i trư ng Tôi xin g i l i bi t ơn sâu s c ñ n th y giáo PGS.TS Lương ð c Ph m TS Nguy n Văn Giang ñã dành r t nhi u th i gian tâm huy t hư ng d n nghiên c u giúp tơi hồn thành lu n văn t t nghi p Tôi xin chân thành c m ơn t i th y cô b mơn, b n sinh viên, gia đình b n bè ñã t o r t nhi u u ki n đ tơi h c t p hoàn thành t t lu n văn t t nghi p M c dù tơi có nhi u c g ng hoàn thi n lu n văn b ng t t c s nhi t tình l c c a mình, nhiên khơng th tránh kh!i nh ng thi u sót, r t mong nh n đư c nh ng đóng góp q báu c a quý th y cô b n Hà N i, Ngày 24 tháng 06 năm 2013 H c viên Trương Th Nguy t Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ii M CL C L i cam ñoan i L i c m ơn ii M"c l"c iii Danh m"c ch vi t t t vii Danh m"c b ng viii Danh m"c hình ix Danh m"c bi u ñ# x M$ ð%U 1.1 ð tv nñ 1.2 N i dung ñ tài 2 T&NG QUAN TÀI LI'U 2.1 Vi khu n Bacillus subtilis 2.1.1 ð c ñi m chung vi khu n Bacillus 2.1.2 Vi khu n Bacillus subtilis 2.1.3 M t s Bacillus thư ng g p t nhiên 2.2 Enzyme α - amylase 10 2.2.1 C u t o α - amylase 10 2.2.2 Tính ch t 11 2.2.3 Cơ ch xúc tác 12 2.2.4 Ngu#n thu nh n enzyme α - amylase 2.2.5 M t s y u t 14 nh hư)ng ñ n sinh t*ng h p α - amylase c a vi sinh v t 16 2.2.6 Tách làm s ch enzyme 18 2.2.7 +ng d"ng enzyme α - amylase 18 V,T LI'U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C+U 21 3.1 V t li u 21 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iii 3.1.1 ð i tư ng 21 3.1.2 Thi t b/ d"ng c" 21 3.1.3 Hóa ch t 21 Các mơi trư ng đư c s d"ng 21 3.2.1 Môi trư ng phân l p nuôi Bacillus 21 3.2.2 Môi trư ng c m ng sinh t*ng h p amylase c a Bacillus 22 3.2.3 Mơi trư ng th ho t tính amylase 22 3.3 22 3.2 Các phương pháp nghiên c u 3.3.1 Phương pháp phân l p ch ng Bacillus t0 ñ t vư n qua trung gian c! khô 22 3.3.2 Phương pháp gi gi ng c y chuy n 22 3.3.3 Phương pháp nuôi c y b sâu 23 3.3.4 M t s phương pháp nghiên c u ñ c ñi m sinh h c c a Bacillus 23 3.3.5 Th ph n ng sinh hoá 26 3.3.6 Phương pháp ñ m khu n l c 29 3.3.7 Phương pháp ño ñ ñ"c 29 3.3.8 Phương pháp xác ñ/nh s sinh trư)ng c a vi khu n theo m t ñ quang 30 3.3.9 Phương pháp nghiên c u kh phân h y tinh b t 30 3.3.10 Phương pháp xác ñ/nh ho t ñ α - amylase theo Heinkel, 1956 31 3.3.11 Phương pháp nghiên c u xác đ/nh u ki n ni c y t i ưu 33 3.3.12 Phương pháp nhiên c u ñ ng h c 34 3.3.13 Phương pháp thu d/ch chi t enzyme thô t0 môi trư ng nuôi c y 35 3.3.14 Phương pháp thu nh n ch ph m enzyme amylase t0 d/ch chi t enzyme thô b ng tác nhân k t t a 35 3.3.15 Xác ñ/nh ho t ñ α - amylase c a ch ph m enzyme thu ñư c t0 tác nhân t a 37 3.3.16 Xác ñ/nh ñ b n α - amylase th y phân nguyên li u n p tr ng 37 3.3.17 Xác ñ/nh ñư ng kh theo phương pháp acid initrosalicylic(DNS) 39 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iv K1T QU2 VÀ TH2O LU,N 4.1 Phân l p n ch n ch ng tr c khu n có ho t tính amylase cao 4.2 41 41 Xác ñ/nh s sinh trư)ng ho t ñ α - amylase c a ch ng LB ñã ch n 46 4.2.1 Xác ñ/nh s sinh trư)ng c a ch ng LB 46 4.2.2 Xác ñ/nh ho t ñ α - amylase c a ch ng LB 47 4.3 M t s ñ c ñi m sinh h c c a ch ng LB3 47 4.3.1 ð c m hình thái t bào ch ng LB3 47 4.3.3 Kh hình thành bào t c a ch ng LB3 48 4.3.4 Nghiên c u kh sinh enzyme catalase 49 4.4 Kh o sát đ c m sinh hóa c a vi khu n LB3 4.5 Nghiên c u ñi u ki n nh hư)ng t i kh sinh t*ng h p α – amylase c a ch ng B subtilis LB3 50 51 4.5.1 Lo i ch t 51 4.5.2 2nh hư)ng n#ng ñ tinh b t tan 53 4.4.3 2nh hư)ng c a nhi t ñ 53 4.4.4 2nh hư)ng c a pH ban ñ u 54 4.4.6 2nh hư)ng c a lo i mu i 55 4.4.7 N#ng ñ NaCl cao nh t c ch sinh trư)ng 56 4.5 Nghiên c u ñ ng h c c a trình lên men bình tam giác lít 4.6 58 Tách enzyme t0 d/ch ni c y, xác đ/nh ho t đ ñ b n c a enzyme 4.6.1 Tách enzyme t0 d/ch nuôi c y v i tác nhân t a khác 59 59 4.6.2 Ho t ñ α – amylase c a CPE amylase thu ñư c b)i tác nhân k t t a 59 4.6.3 Xác ñ/nh nhi t ñ t i thích c a α - amylase 60 4.6.4 Xác đ/nh pH t i thích c a α - amylase 61 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… v 4.7 Th nghi m kh th y phân enzyme α – amylase nguyên li u g o n p tr ng 62 K1T LU,N VÀ KI1N NGH3 64 5.1 K t lu n 64 5.2 Ki n ngh/ 64 TÀI LI'U THAM KH2O 65 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vi DANH M C CÁC CH VI T T T B : Bacillus CPE : Ch ph m enzyme OD : Giá tr/ m t ñ quang dOD : Hi u s giá tr/ m t đ quang v/p : Vịng/phút Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vii DANH M C B NG STT Tên b ng Trang 2.1 M t s ph n ng sinh hoá c a B subtilis 2.2 ð b n nhi t c a - amylase t0 ngu#n khác 12 3.1 ð c m hình thái khu n l c ch ng phân l p 41 3.2 ð c ñi m t bào c a khu n l c nuôi c y môi trư ng 44 3.3 ðư ng kính vịng phân gi i tinh b t c a ch ng LB 45 3.4 So sánh ho t ñ α - amylase c a ch ng LB 47 3.3 Tóm t t m t s ñ c ñi m c a ch ng LB3 49 3.4 Các ph n ng sinh hoá c a LB3 50 3.5 S sinh trư)ng c a ch ng LB3 lo i ch t 51 3.6 N#ng ñ tinh b t tan nh hư)ng ñ n ho t ñ α - amylase 53 3.7 2nh hư)ng c a n#ng ñ mu i NaCl ñ n ho t ñ α - amylase 56 3.8 2nh hư)ng c a n#ng ñ mu i CaCl2 ñ n ho t ñ α - amylase 58 3.9 Hi u su t thu nh n CPE α - amylase t0 tác nhân t a 59 3.10 Ho t ñ α – amylase thu ñư c b)i tác nhân k t t a 60 3.11 Nhi t ñ t i thích c a CPE α - amylase 60 3.12 pH t i thích c a CPE α - amylase 61 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… viii DANH M C HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 T bào Bacillus subtilis 2.2 C u trúc không gian c a α - amylase 11 2.3 V/ trí c t c a α - amylase phân t tinh b t 14 4.1 Vòng phân gi i tinh b t c a ch ng LB3, LB4, LB8 47 4.2 Hình thái t bào ch ng LB3 48 4.3 Bào t c a ch ng LB3 48 4.4 Hình nh th catalase c a ch ng LB3 49 4.5 M t s ph n ng sinh hóa c a ch ng LB3 51 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ix Nghiên c u ñi u ki n nh hư)ng t i sinh trư)ng kh sinh t*ng h p α–amylase c a ch ng B subtilis LB3 B ng 3.1 2nh hư)ng c a b t g o ñ n sinh trư)ng c a ch ng B subtilis LB3 Th i gian (h) 20 30 40 45 50 55 60 70 L:n L:n L:n Trung bình ðLC 0.672 0.674 0.671 0.672 0.002 0.834 0.845 0.831 0.837 0.007 1.193 1.2 1.198 1.197 0.004 1.125 1.212 1.218 1.185 0.052 1.015 1.018 1.012 1.015 0.003 0.962 0.965 0.964 0.964 0.002 0.846 0.84 0.842 0.843 0.003 0.713 0.709 0.715 0.712 0.003 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 75 B ng 3.2 2nh hư)ng lo i ch t b t g o ñ n ho t ñ α – amylase Th i gian (h) 20 30 40 45 50 55 60 70 dOD Hàm lư Ho t ñ dOD Hàm lư Ho t ñ dOD Hàm lư Ho t ñ dOD Hàm lư Ho t ñ dOD Hàm lư Ho t ñ dOD Hàm lư Ho t ñ dOD Hàm lư Ho t ñ dOD Hàm lư Ho t ñ ng tinh b t (mg/ml) α - amylase (UI/ml) ng tinh b t (mg/ml) α - amylase (UI/ml) ng tinh b t (mg/ml) α - amylase (UI/ml) ng tinh b t (mg/ml) α - amylase (UI/ml) ng tinh b t (mg/ml) α - amylase (UI/ml) ng tinh b t (mg/ml) α - amylase (UI/ml) ng tinh b t (mg/ml) α - amylase (UI/ml) ng tinh b t (mg/ml) α - amylase (UI/ml) L n1 L n2 L n3 Trung bình 0.050 1.332 5.594 0.075 1.998 8.392 0.095 2.531 10.629 0.110 2.930 12.308 0.106 2.824 11.860 0.102 2.717 11.413 0.098 2.611 10.965 0.089 2.371 9.958 0.048 1.279 5.371 0.078 2.078 8.727 0.098 2.611 10.965 0.111 2.957 12.420 0.108 2.877 12.084 0.103 2.744 11.524 0.095 2.531 10.629 0.088 2.344 9.846 0.042 1.119 4.699 0.070 1.865 7.832 0.102 2.717 11.413 0.112 2.984 12.531 0.106 2.824 11.860 0.101 2.691 11.301 0.099 2.637 11.077 0.089 2.371 9.958 0.047 1.243 5.221 0.074 1.980 8.317 0.098 2.620 11.002 0.111 2.957 12.420 0.107 2.842 11.935 0.102 2.717 11.413 0.097 2.593 10.890 0.089 2.362 9.921 Sai s 0.004 0.111 0.466 0.004 0.108 0.452 0.004 0.094 0.393 0.001 0.027 0.112 0.001 0.031 0.129 0.001 0.027 0.112 0.002 0.055 0.233 0.001 0.015 0.065 B ng 3.3 2nh hư)ng c a b t mỳ ñ n sinh trư)ng c a ch ng B subtilis LB3 Th i gian (h) 20 30 40 45 50 55 60 70 L n1 0.662 0.725 1.128 1.102 0.957 0.925 0.854 0.724 L n2 0.687 0.743 1.144 1.116 0.972 0.939 0.869 0.734 L n3 0.647 0.71 1.113 1.087 0.942 0.91 0.839 0.709 Trung bình 0.665 0.726 1.128 1.102 0.957 0.925 0.854 0.722 ðLC 0.020 0.017 0.016 0.015 0.015 0.015 0.015 0.013 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 76 B ng 3.4 2nh hư)ng lo i ch t b t mỳ ñ n ho t ñ α – amylase Th i gian (h) 20 30 40 45 50 55 60 70 dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) L n1 L n2 L n3 Trung bình 0.066 1.758 7.385 0.087 2.318 9.734 0.102 2.717 11.413 0.108 2.877 12.084 0.104 2.771 11.636 0.100 2.664 11.189 0.098 2.611 10.965 0.095 2.531 10.629 0.068 1.812 7.608 0.085 2.264 9.510 0.105 2.797 11.748 0.116 3.090 12.979 0.108 2.877 12.084 0.102 2.717 11.413 0.097 2.584 10.853 0.092 2.451 10.294 0.062 1.652 6.937 0.088 2.344 9.846 0.107 2.850 11.972 0.102 2.717 11.413 0.101 2.691 11.301 0.101 2.691 11.301 0.096 2.557 10.741 0.097 2.584 10.853 0.065 1.740 7.310 0.087 2.309 9.697 0.105 2.788 11.711 0.109 2.895 12.158 0.104 2.779 11.674 0.101 2.691 11.301 0.097 2.584 10.853 0.095 2.522 10.592 Sai s 0.003 0.081 0.342 0.002 0.041 0.171 0.003 0.067 0.282 0.007 0.187 0.786 0.004 0.094 0.393 0.001 0.027 0.112 0.001 0.027 0.112 0.003 0.067 0.282 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 77 B ng 3.5 2nh hư)ng c a tinh b t tan ñ n sinh trư)ng ch ng B subtilis LB3 Th i gian (h) 20 30 40 45 50 55 60 70 L n1 L n2 0.912 1.212 1.625 1.503 1.358 1.214 1.122 0.936 L n3 0.918 1.209 1.623 1.502 1.356 1.214 1.115 0.931 0.915 1.214 1.621 1.502 1.353 1.218 1.128 0.942 TB ðLC 0.915 1.212 1.623 1.502 1.356 1.215 1.122 0.936 0.003 0.003 0.002 0.001 0.003 0.002 0.007 0.006 B ng 3.6 2nh hư)ng tinh b t tan ñ n ho t ñ α–amylase Th i gian (h) 20 30 40 45 50 55 60 70 0.088 2.344 0.084 2.238 0.084 2.238 Trung bình 0.085 2.273 9.846 0.112 2.984 9.399 0.114 3.037 9.399 0.115 3.064 9.548 0.114 3.028 0.258 0.002 0.041 12.531 0.145 3.863 12.755 0.148 3.943 12.867 0.142 3.783 12.718 0.145 3.863 0.171 0.003 0.080 16.224 0.178 4.742 16.559 0.176 4.689 15.888 0.172 4.582 16.224 0.175 4.671 0.336 0.003 0.081 19.916 0.172 4.582 19.692 0.169 4.502 19.245 0.171 4.555 19.618 0.171 4.547 0.342 0.002 0.041 19.245 0.168 4.476 18.909 0.169 4.502 19.133 0.171 4.555 19.096 0.169 4.511 0.171 0.002 0.041 18.797 0.165 4.396 18.909 0.162 4.316 19.133 0.162 4.316 18.946 0.163 4.342 0.171 0.002 0.046 18.462 0.158 4.209 17.678 18.126 0.155 4.129 17.343 18.126 0.154 4.103 17.231 18.238 0.156 4.147 17.417 0.194 0.002 0.055 0.233 L n1 dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase L n2 L n3 Sai s Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 0.002 0.062 78 (UI/ml) B ng 3.7 2nh hư)ng n#ng ñ tinh b t tan ñ n sinh trư)ng B subtilis LB3 N#ng ñ tinh b t (%) 0.5 1.5 2.5 L n1 1.186 1.425 1.786 1.602 1.139 L n2 1.187 1.431 1.782 1.603 1.132 L n3 1.189 1.429 1.787 1.609 1.138 Trung bình 1.187 1.428 1.785 1.605 1.136 Sai s 0.002 0.003 0.003 0.004 0.004 B ng 3.8 2nh hư)ng n#ng ñ tinh b t tan ñ n ho t ñ α–amylase c a ch ng B subtilis LB3 N#ng ñ 0.5 1.5 2.5 0.128 3.410 0.124 3.303 0.134 3.570 Trung bình 0.129 3.428 14.322 0.165 4.396 13.874 0.168 4.476 14.993 0.166 4.422 14.396 0.166 4.431 0.563 0.002 0.041 18.462 0.185 4.928 18.797 0.182 4.848 18.573 0.182 4.848 18.611 0.183 4.875 0.171 0.002 0.046 20.699 0.158 4.209 20.364 0.156 4.156 20.364 0.152 4.049 20.476 0.155 4.138 0.194 0.003 0.081 17.678 0.129 3.437 17.455 0.128 3.410 17.007 0.126 3.357 17.380 0.128 3.401 0.342 0.002 0.041 14.434 14.322 14.098 14.284 0.171 L n1 dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) L n2 L n3 Sai s 0.005 0.134 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 79 B ng 3.9 2nh hư)ng nhi t ñ ñ n sinh trư)ng c a ch ng B subtilis LB3 Nhi t đ L n1 L n2 L n3 Trung bình Sai s 25 1.246 1.248 1.249 1.248 30 1.351 1.354 1.359 1.355 33 1.517 1.512 1.515 1.515 37 1.614 1.613 1.618 1.615 40 1.504 1.509 1.515 1.509 45 1.34 1.348 1.347 1.345 48 1.215 1.218 1.217 1.217 0.002 0.004 0.003 0.003 0.006 0.004 0.002 3.10 2nh hư)ng nhi t ñ ñ n ho t ñ α–amylase c a ch ng B subtilis LB3 Nhi t ñ 25 30 33 37 40 45 48 0.108 2.877 0.104 2.771 0.104 2.771 Trung bình 0.105 2.806 12.084 0.135 3.596 11.636 0.138 3.676 11.636 0.136 3.623 11.786 0.136 3.632 0.258 0.002 0.041 15.105 0.155 4.129 15.441 0.152 4.049 15.217 0.152 4.049 15.254 0.153 4.076 0.171 0.002 0.046 17.343 0.178 4.742 17.007 0.176 4.689 17.007 0.172 4.582 17.119 0.175 4.671 0.194 0.003 0.081 19.916 0.166 4.422 19.692 0.167 4.449 19.245 0.165 4.396 19.618 0.166 4.422 0.342 0.001 0.027 18.573 0.159 4.236 18.685 0.158 4.209 18.462 0.156 4.156 18.573 0.158 4.200 0.112 0.002 0.041 17.790 17.678 17.455 17.641 0.171 0.139 3.703 0.138 3.676 0.136 3.623 0.138 3.667 0.002 0.041 15.552 15.441 15.217 15.403 0.171 L n1 dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) L n2 L n3 Sai s 0.002 0.062 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 80 B ng 3.11 2nh hư)ng n#ng ñ NaCl ñ n sinh trư)ng ch ng B subtilis LB3 N#ng ñ NaCl (%) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 L n1 1.014 1.124 1.345 1.618 1.447 1.405 1.314 L n2 1.014 1.128 1.349 1.621 1.451 1.408 1.321 L n3 Trung bình 1.021 1.016 1.131 1.128 1.352 1.349 1.624 1.621 1.453 1.450 1.402 1.405 1.318 1.318 Sai s 0.004 0.004 0.004 0.003 0.003 0.003 0.004 B ng 3.12 2nh hư)ng c a n#ng ñ NaCl ñ n ho t ñ α–amylase N#ng ñ NaCl (%) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.078 0.078 0.073 Trung bình 0.076 2.078 2.078 1.945 2.034 0.077 8.727 0.115 8.727 0.117 8.168 0.116 8.541 0.116 0.323 0.001 3.064 3.117 3.090 3.090 0.027 12.867 0.145 13.091 0.148 12.979 0.141 12.979 0.145 0.112 0.004 3.863 3.943 3.756 3.854 0.094 16.224 0.163 16.559 0.162 15.776 0.161 16.186 0.162 0.393 0.001 4.342 4.316 4.289 4.316 0.027 18.238 0.156 18.126 0.157 18.014 0.155 18.126 0.156 0.112 0.001 4.156 4.182 4.129 4.156 0.027 17.455 0.141 17.566 0.148 17.343 0.146 17.455 0.145 0.112 0.004 3.756 3.943 3.889 3.863 0.096 15.776 0.132 16.559 0.138 16.336 0.133 16.224 0.134 0.403 0.003 3.516 14.769 3.676 15.441 3.543 14.881 3.579 15.030 0.086 0.360 L n1 dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase L n2 L n3 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… Sai s 0.003 81 (UI/ml) B ng 3.13 2nh hư)ng n#ng ñ CaCl2 ñ n sinh trư)ng ch ng B subtilis LB3 N#ng ñ Trung CaCl2(%) L n L n2 L n3 bình Sai s 1.325 1.322 1.326 1.324 0.002 0.01 1.568 1.564 1.562 1.565 0.003 0.015 1.635 1.642 1.643 1.640 0.004 0.02 1.413 1.415 1.418 1.415 0.003 0.025 1.361 1.368 1.364 1.364 0.004 B ng 3.14 2nh hư)ng c a n#ng ñ CaCl2 ñ n ho t ñ α – amylase N#ng ñ CaCl2 (%) 0.01 0.015 0.02 0.025 dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) L n1 L n2 L n3 Trung bình Sai s 0.138 3.676 15.441 0.155 4.129 17.343 0.181 4.822 20.252 0.143 3.810 16.000 0.126 3.357 14.098 0.132 3.516 14.769 0.152 4.049 17.007 0.188 5.008 21.035 0.142 3.783 15.888 0.121 3.223 13.538 0.135 3.596 15.105 0.158 4.209 17.678 0.185 4.928 20.699 0.141 3.756 15.776 0.125 3.330 13.986 0.135 3.596 15.105 0.155 4.129 17.343 0.185 4.920 20.662 0.142 3.783 15.888 0.124 3.303 13.874 0.003 0.080 0.336 0.003 0.080 0.336 0.004 0.094 0.393 0.001 0.027 0.112 0.003 0.070 0.296 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 82 B ng 3.15 N#ng ñ NaCl c ch sinh trư)ng ch ng B subtilis LB3 N#ng ñ NaCl (%) L n1 L n2 L n3 Trung bình ðLC 0.852 0.842 0.845 0.846 0.005 0.685 0.678 0.682 0.682 0.004 0.543 0.541 0.544 0.543 0.002 0.418 0.415 0.416 0.416 0.002 0.326 0.321 0.324 0.324 0.003 0.251 0.249 0.251 0.250 0.001 0.145 0.142 0.144 0.144 0.002 0.095 0.092 0.094 0.094 0.002 0.064 0.068 0.06 0.064 0.004 10 0.036 0.032 0.034 0.034 0.002 Nghiên c u đ ng h c c a q trình lên men ch ng B subtilis LB3 bình tam giác lít B ng 4.1 : Sinh trư)ng c a ch ng B subtilis trình nghiên c u ñ ng h c Trung Th i gian L n1 L n2 L n3 bình ðLC 20 0.912 0.918 0.915 0.915 0.003 30 1.202 1.206 1.204 1.204 0.002 35 1.405 1.408 1.409 1.407 0.002 40 1.625 1.623 1.621 1.623 0.002 45 1.613 1.612 1.612 1.612 0.001 50 1.584 1.586 1.583 1.584 0.002 55 1.574 1.578 1.518 1.557 0.034 60 1.484 1.486 1.489 1.486 0.003 70 1.422 1.415 1.428 1.422 0.007 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 83 B ng 4.2: Ho t đ α – amylase q trình nghiên c u ñ ng h c Th i gian (h) 20 30 35 40 45 50 55 60 70 L n1 dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) L n2 L n3 Trung bình Sai s 0.095 0.096 0.098 0.096 0.002 2.531 2.557 2.611 2.566 0.041 10.629 0.125 10.741 0.128 10.965 0.122 10.779 0.125 0.171 0.003 3.330 3.410 3.250 3.330 0.080 13.986 0.145 14.322 0.148 13.650 0.142 13.986 0.145 0.336 0.003 3.863 3.943 3.783 3.863 0.080 16.224 0.165 16.559 0.168 15.888 0.162 16.224 0.165 0.336 0.003 4.396 4.476 4.316 4.396 0.080 18.462 0.182 18.797 0.181 18.126 0.183 18.462 0.182 0.336 0.001 4.848 4.822 4.875 4.848 0.027 20.364 0.179 20.252 0.178 20.476 0.179 20.364 0.179 0.112 0.001 4.769 4.742 4.769 4.760 0.015 20.028 0.175 19.916 0.178 20.028 0.175 19.991 0.176 0.065 0.002 4.662 4.742 4.662 4.689 0.046 19.580 0.172 19.916 0.175 19.580 0.173 19.692 0.173 0.194 0.002 4.582 4.662 4.609 4.618 0.041 19.245 0.165 19.580 0.168 19.357 0.169 19.394 0.167 0.171 0.002 4.396 4.476 4.502 4.458 0.055 18.462 18.797 18.909 18.723 0.233 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 84 B ng 4.2: Ho t đ α – amylase q trình nghiên c u ñ ng h c Th i gian (h) 20 30 35 40 45 50 55 60 70 L n1 dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) L n2 L n3 Trung bình Sai s 0.095 0.096 0.098 0.096 0.002 2.531 2.557 2.611 2.566 0.041 10.629 0.125 10.741 0.128 10.965 0.122 10.779 0.125 0.171 0.003 3.330 3.410 3.250 3.330 0.080 13.986 0.145 14.322 0.148 13.650 0.142 13.986 0.145 0.336 0.003 3.863 3.943 3.783 3.863 0.080 16.224 0.165 16.559 0.168 15.888 0.162 16.224 0.165 0.336 0.003 4.396 4.476 4.316 4.396 0.080 18.462 0.182 18.797 0.181 18.126 0.183 18.462 0.182 0.336 0.001 4.848 4.822 4.875 4.848 0.027 20.364 0.179 20.252 0.178 20.476 0.179 20.364 0.179 0.112 0.001 4.769 4.742 4.769 4.760 0.015 20.028 0.175 19.916 0.178 20.028 0.175 19.991 0.176 0.065 0.002 4.662 4.742 4.662 4.689 0.046 19.580 0.172 19.916 0.175 19.580 0.173 19.692 0.173 0.194 0.002 4.582 4.662 4.609 4.618 0.041 19.245 0.165 19.580 0.168 19.357 0.169 19.394 0.167 0.171 0.002 4.396 4.476 4.502 4.458 0.055 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 85 Ho t ñ α - amylase (UI/ml) 18.462 18.797 18.909 18.723 0.233 Hi u su t thu nh n enzyme α – amylase t0 tác nhân t a khác B ng Hi u su t thu nh n enzyme α – amylase t0 tác nhân t a Hi u su t thu nh n enzyme (g/100ml) Tác nhân t a L n L n L n Trung bình Sai s Etanol 96o 1.25 1.29 1.27 1.27 0.02 Acetone 1.96 2.01 1.95 1.97 0.03 Sulphate amon 0.84 0.88 0.82 0.85 0.03 Ho t ñ c a CPE amylase thu ñư c b)i tác nhân k t t a B ng Ho t ñ c a CPE (UI/gCPE) amylase thu ñư c b)i tác nhân k t t a Tác nhân t'a Etanol 96o Acetone Sulphate amon dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) L:n L:n L:n Trung bình Sai s% 0.142 3.783 0.141 3.756 0.140 3.730 1588.81 0.093 2.478 1040.55 1577.62 1566.43 0.091 2.424 0.091 2.424 1018.18 1018.18 0.141 3.756 0.001 0.027 1577.62 11.18 0.092 2.442 0.001 0.031 1025.64 12.92 0.067 1.785 0.067 1.785 0.065 1.732 0.066 1.767 0.001 0.031 749.65 749.65 727.27 742.19 12.92 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 86 2nh hư)ng nhi t ñ ñ n ho t ñ CPE α - amylase B ng 2nh hư)ng nhi t ñ ñ n ho t ñ CPE α - amylase Nhi t ñ$ 50 60 70 75 80 85 90 100 dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) dOD Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) Ho t ñ α - amylase (UI/ml) 0.140 Trung bình 0.142 0.002 3.783 3.730 3.774 0.041 1600.00 1588.81 1566.43 1585.08 17.09 0.140 0.138 0.139 0.139 0.001 3.730 3.676 3.703 3.703 0.027 1566.43 1544.05 1555.24 1555.24 11.19 0.135 0.135 0.134 0.135 0.001 3.596 3.596 3.570 3.588 0.015 1510.49 1510.49 1499.30 1506.76 6.46 0.132 0.133 0.135 0.133 0.002 3.516 3.543 3.596 3.552 0.041 1476.92 1488.11 1510.49 1491.84 17.09 0.118 0.117 0.119 0.118 0.001 3.144 3.117 3.170 3.144 0.027 1320.28 1309.09 1331.47 1320.28 11.19 0.072 0.073 0.071 0.072 0.001 1.918 1.945 1.891 1.918 0.027 805.59 816.78 794.40 805.59 11.19 0.039 0.038 0.036 0.038 0.002 1.039 1.012 0.959 1.003 0.041 436.36 425.17 402.80 421.44 17.09 0.012 0.011 0.011 0.011 0.001 0.320 0.293 0.293 0.302 0.015 134.27 123.08 123.08 126.81 6.46 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 L:n L:n L:n 0.143 0.142 3.810 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ðLC 87 2nh hư)ng pH ñ n ho t ñ CPE α - amylase B ng 2nh hư)ng pH ñ n ho t ñ CPE α - amylase pH L n1 L n2 L n3 Trung bình Sai s dOD 0.025 0.028 0.027 0.027 0.002 Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) 0.666 0.746 0.719 0.710 0.041 Ho t ñ α - amylase (UI/ml) 279.72 313.29 302.10 298.37 17.09 0.065 0.068 0.066 0.066 0.002 4.5 Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) 1.732 1.812 1.758 1.767 0.041 Ho t ñ α - amylase (UI/ml) 727.27 760.84 738.46 742.19 17.09 dOD 0.095 0.094 0.093 0.094 0.001 Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) 2.531 2.504 2.478 2.504 0.027 Ho t ñ α - amylase (UI/ml) 1062.94 1051.75 1040.56 1051.75 11.19 0.116 0.115 0.118 0.116 0.002 5.5 Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) 3.090 3.064 3.144 3.099 0.041 Ho t ñ α - amylase (UI/ml) 1297.90 1286.71 1320.28 1301.63 17.09 dOD 0.139 0.141 0.140 0.140 0.001 Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) 3.703 3.756 3.730 3.730 0.027 Ho t ñ α - amylase (UI/ml) 1555.24 1577.62 1566.43 1566.43 11.19 0.105 0.103 0.104 0.104 0.001 6.5 Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) 2.797 2.744 2.771 2.771 0.027 Ho t ñ α - amylase (UI/ml) 1174.82 1152.45 1163.64 1163.64 11.19 dOD 0.092 0.094 0.094 0.093 0.001 Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) 2.451 2.504 2.504 2.486 0.031 Ho t ñ α - amylase (UI/ml) 1029.37 1051.75 1051.75 1044.29 12.920 0.076 0.074 0.075 0.075 0.001 7.5 Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) 2.025 1.971 1.998 1.998 0.027 Ho t ñ α - amylase (UI/ml) 850.35 827.97 839.16 839.16 11.19 dOD 0.061 0.062 0.061 0.061 0.001 Hàm lư ng tinh b t (mg/ml) 1.625 1.652 1.625 1.634 0.015 Ho t ñ α - amylase (UI/ml) 682.52 693.71 682.52 686.25 6.46 dOD dOD dOD dOD Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 88 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 89 ... ñ thu ñư c d/ch enzyme α - amylase có ho t đ cao Tách chi t enzyme α – amylase t0 d/ch lên men, nghiên c u ñ nhi t ñ pH t i thích c a enzyme α – amylase Th nghi m kh th y phân tinh b t c a enzyme. .. ch ph m enzyme thương m i thu c nhóm α - amylase đ u có tính ch/u nhi t cao B ng 1: ð$ b)n nhi t c'a α - amylase t* ngu+n khác STT Enzym Ngu+n α - amylase vi Bacillus subtilis khu n α - amylase. .. 2.2 Enzyme α - amylase 2.2.1 C u t o α - amylase Enzyme α - amylase enzyme th y phân tinh b t ñư c ng d"ng r ng rãi công nghi p, y h c lĩnh v c khác đ#ng th i m t nh ng enzyme ñ u tiên ñư c nghiên