a. Phương pháp nuôi cấy [1, 2, 3]
Để thu được enzyme có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật khác nhau về nguyên tắc. Phương pháp bề mặt và phương nuôi cấy bề sâu hay còn gọi là phương pháp chìm, trong phương pháp nuôi cấy chìm có thể có phương pháp nuôi cấy chìm 2 bước.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt: Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường
dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng. Trong môi trường dinh dưỡng này người ta thường cho thêm chất cảm ứng cần thiết cho sự sinh tổng hợp enzyme hoặc một số chất dinh dưỡng nitơ, photpho … Để đảm bảo độ xốp cho môi trường cần có các chất làm xốp như trấu với tỷ lệ 10% đến 20%. Môi trường được vô trùng trước khi cấy vi sinh vật để tránh nhiễm vi sinh vật lạ trong quá trình nuôi.
Phương pháp này thích hợp để nuôi các loài nấm mốc vì chúng phát triển nhanh, mạnh ít bị tạp nhiễm.
Phương pháp nuôi cấy chìm: Vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng có
cảm ứng và một số chất dinh dưỡng để cung cấp nguồn cacbon, nitơ và các chất khoáng. Môi trường nuôi cấy cần được phối chế và thanh trùng trước khi nuôi cấy. Trong phương pháp nuôi cấy này, việc lựa chọn môi trường, tỷ lệ các chất dinh dưỡng thích hợp với từng chủng, đặc biệt phải chú ý đến các chất cảm ứng là cần thiết cho vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme ở mức độ tối đa.
Phương pháp nuôi cấy chìm hai bước: Đầu tiên các vi sinh vật được nuôi
trong thiết bị để phát triển tối đa, sau đó chuyển tới thiết bị lên men sinh tổng hợp enzyme, trong đó thành phần môi trường giữa hai quá trình này là khác nhau. Trong phương pháp này đảm bảo vô trùng quá trình thu sinh khối và chuyển sang nuôi sinh enzyme là cần thiết.
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi sinh enzyme từ vi sinh vật [1, 2, 6]
- Môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường là một trong những yếu tố quyết định ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật cũng như khả năng sinh tổng hợp enzyme.
Để đảm bảo những yêu cầu tối thiểu cho sự sinh trưởng của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzyme trong môi trường cần có các chất chứa C, N, H, O và các chất vô cơ khác như Mn, Ca, P, S, Fe, K và một số chất khác. Trong đó nguồn cacbon thường là gluxit hoặc dầu, mỡ, các acid hữu cơ, rượu các hợp chất có chứa nhóm metyl (-CH3), nhóm metylen (-CH2); nguồn nitơ là các hợp chất hữu cơ và vô cơ như cao ngô, bột đậu tương, khô đậu hoặc các peptid, các acid amin; các khoáng vi lượng thường có trong nước hoặc trong các thành phân môi trường; các khoáng đa lượng quan trọng là P, S … có thể bổ sung bằng các muối vô cơ được trình bày trong Bảng 1.9.
Khi lựa chọn môi trường dinh dưỡng cần lưu ý cả thành phần định tính và định lượng của môi trường, tỷ lệ giữa các thành phần trong môi trường. Cũng cần nhớ rằng trong nhiều trường hợp, môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật chưa hẳn đã là thích hợp để sinh tổng hợp enzyme. Có khi môi trường kìm hãm sự tích lũy sinh khối tế bào nhưng vẫn tăng cường sinh tổng hợp enzyme.
Môi trường nuôi cấy gồm có hai loại là môi trường tự nhiên và môi trường tổng hợp. Môi trường tự nhiên thường dùng là các phế liệu hoặc các nguyên liệu tự nhiên có chứa các chất hữu cơ khác nhau làm nguồn dinh dưỡng. Môi trường tổng
hợp bao gồm các chất với lượng xác định với nguồn cacbon là tinh bột, đường, rượu…nguồn nitơ là các muối, acid amin, peptide …loại môi trường này được dùng cho mục đích nghiên cứu.
Bảng 1.9. Nhu cầu khoáng đối với một số vi sinh vật [5, 8]
Nồng độ cần thiết Nồng độ cần thiết Loại muối khoáng Vi khuẩn Nấm và xạ khuẩn Loại muối khoáng Vi khuẩn Nấm và xạ khuẩn K2HPO4 0,2÷0,5 1÷2 Na2MoO4 0,001÷0,005 0,01÷0,02 KH2PO4 0,2÷0,5 1÷2 ZnSO4.7H2O 0,02÷0,03 MgSO4.7H2O 0,1÷0,2 0,2÷0,5 CoCl2 0,03 0,06 MnSO4.7H2O 0,005÷0,01 0,02÷0,1 CaCl2 0,01÷0,03 0,02÷0,1 FeSO4.7H2O 0,005÷0,01 0,05÷0,2 CaSO4.5H2O 0,001÷0,005 0,001÷0,05
Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hòa sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt là các chất cảm ứng làm tăng đáng kể lượng enzyme được tổng hợp.
- Các yếu tố ngoại cảnh
Vi sinh vật không thể tổng hợp enzyme tốt khi khả năng sinh trường và phát triển yếu. Nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường, thời gian nuôi cấy … là những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật từ đó cũng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của chúng. Mỗi loài vi sinh vật sẽ sinh tổng hợp một enzyme nào đó cao nhất trong một khoảng nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy nhất định. Do đó, trong quá trình nuôi enzyme thì cần thiết nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố trên để vi sinh vật có thể tổng hợp enzyme cao nhất.