2.3.7. Bố trí thì nghiệm áp dụng thủy phân gelatin bằng chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn chủng tuyển chọn
a. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ giữa chế phẩm gelatinase với cơ chất gelatin 1% (E/S) đến tốc độ phản ứng
Việc nghiên cứu tỷ lệ E/S giúp thực hiện phản ứng thủy phân bằng enzyme một cách nhanh nhất với lượng enzyme phù hợp không thừa hay thiếu. Ban đầu khi tăng nồng độ enzyme thì vận tốc phản ứng tăng nhưng đến một giai đoạn nào đó nếu ta tiếp tục tăng nồng độ enzyme thì cũng không làm tăng vận tốc phản ứng vì trong môi trường lúc này không còn cơ chất để tác dụng.
- Mục đích: Xác định tỷ lệ E/S thích hợp cho phản ứng thủy phân gelatin 1%
bằng gelatinase.
- Tiến hành: Thủy phân gelatin 1% bằng chế phẩm gelatinase kỹ thuật với tỷ
lệ hoạt độ gelatinase/100ml gelatin 1% tăng dần như Hình 2.17. Phản ứng thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ và pH tối thích của gelatinase trong 30 phút. Tiến hành lấy mẫu và xác định hàm lượng aicid amin tạo thành ở các mẫu có tỷ lệ E/S
Ly tâm lạnh Kết tủa trong thời gian
Xác định hoạt độ 5 phút 10 phút 15 phút
Dịch gelatinase thô
Thời gian kết tủa thích hợp
khác nhau. Tỷ lệ E/S mà tại đó hàm lượng đạm aicid amin hình thành không tăng hoặc tăng không đáng kể sẽ được chọn để áp dụng thủy phân gelatin 1%.
Hình 2.17. Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ giữa chế phẩm gelatinase với cơ chất gelatin 1% (E/S) đến tốc độ phản ứng
b. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian và mức độ thủy phân gelatin bằng gelatinase từ chủng tuyển chọn
Việc nghiên cứu thời gian và mức độ thủy phân gelatin của chế phẩm gelatinase thu được là cần thiết cho quá trình ứng dụng chế phẩm này trong sản xuất. Mức độ thủy phân được xác định bằng tỷ lệ đạm acid amin trên hàm lượng đạm tổng số.
- Mục đích: Xác định thời gian thủy phân gelatin 1% thích hợp và đánh giá
hiệu quả thủy phân của chế phẩm gelatinase thu nhận từ chủng tuyển chọn.
- Tiến hành: Chuẩn bị dịch gelatin 1%. Lấy một phần dịch gelatin này xác
định hàm lượng đạm tổng số, phần còn lại đưa đi thủy phân bằng chế phẩm gelatinase thu được từ chủng tuyển chọn. Phản ứng thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ, pH và nồng độ E/S thích hợp từ các nghiên cứu trên.
Xác định hoạt độ
Thủy phân 100 gelatin 1% lượng enzyme(UI) Định lượng đạm acid amin Lượng dịch enzyme thích hợp 2 4 6 8 10 12 Dịch CPE gelatinase 14 16
Sau 2 giờ thủy phân, tiến hành lấy mẫu thứ nhất xác định hàm lượng đạm acid amin tạo thành. Tiếp tục lấy mẫu và xác định đạm aicd amin sau mỗi 1 giờ thủy phân. Quá trình lấy mẫu kết thúc khi hàm lượng đạm acid amin hình thành không tăng nữa hoặc tăng không đáng kể.
Hình 2.18. Sơ đồ xác định thời gian và mức độ thủy phân gelatin 1% của chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn