đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn
Hình 2.9. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi sinh enzyme đển khả năng sinh gelatinase từ chủng tuyển chọn
Thành phần môi trường là một trong những yếu tố quyết định ảnh hưởng đến hoạt độ sống của vi sinh vật cũng như khả năng sinh tổng hợp enzyme của chúng. Bên cạnh đó, các yếu tố như nhiệt độ, pH nuôi, thời gian nuôi cũng ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh gelatinase của vi sinh vật. Do đó, việc nghiên cứu các điều
Hoạt hóa trên môi trường TSA
Đánh giá hoạt độ enzyme
Nuôi sinh enzyme trong điều kiện
Điều kiện nuôi thích hợp Nồng độ chất cảm
ứng gelatin: 0.5,1, 1.5, 2, 2.5, 3 (%)
Nhiệt độ nuôi: 30, 35, 40, 45
Thời gian nuôi: 12, 24, 36, 48,
60, (giờ)
pH nuôi: 4, 5, 6, 7, 8 Môi trường nuôi:
MT1, MT2, MT3
Chủng vi khuẩn
Sinh khối trong môi trường MT1
kiện ảnh hưởng đến quá trình nuôi sinh gelatinase từ chủng vi khuẩn đã tuyển chọn là cần thiết. Quá trình nghiên cứu được tiến hành như sơ đồ Hình 2.9.
a. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn
Để đảm bảo những yêu cầu tối thiểu cho sự sinh trưởng của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzyme thì trong môi trường cần có các chất chứa nguồn C, N, H, O và các chất khoáng [1]. Trong nghiên cứu này, sử dụng glucose, pepton và cao nấm men để cung cấp nguồn cacbon và nitơ ... đồng thời bổ sung các muối KH2PO4, MgSO4, NaHPO4, CaCl2 để cung cấp nguồn khoáng quan trọng như P, S, K, Na, Mg, Ca [5, 8]. Ngoài các thành phần cơ bản trên, một thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi sinh gelatinase là chất cảm ứng gelatinase. Việc sử dụng chất cảm ứng làm tăng đáng kể lượng enzyme được tổng hợp của vi sinh vật. Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát ba môi trường MT1, MT2 và MT3 được trình bày ở Mục 2.1.2.
- Mục đích: Lựa chọn môi trường nuôi sinh gelatinase thích hợp từ chủng
tuyển chọn.
- Tiến hành: Chuẩn bị các bình môi trường MT1, MT2 và MT3, điều chỉnh
về pH 7 và vô trùng.
Quá trình nghiên cứu được thực hiện như sơ đồ Hình 2.10. Chủng vi khuẩn được nuôi sinh khối trên môi trường MT1 trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 180 vòng/phút.
Sinh khối vi khuẩn được bổ sung vào ba bình môi trường MT1, MT2 và MT3 đã chuẩn bị với tỷ lệ bổ sung là 10%. Tiến hành nuôi sinh enzyme các mẫu ở 30oC, pH 7 trên máy lắc 180 vòng/phút trong 36 giờ.
Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành ly tâm dịch nuôi với tốc độ 4000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu dịch gelatinase thô. Tiến hành xác định hoạt độ dịch gelatinase ở từng môi trường nuôi. Môi trường nuôi cho dịch enzyme gelatinase thu được có hoạt độ cao nhất sẽ được chọn cho các nghiên cứu sau.
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn
b. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn
- Mục địch: Xác định thời gian nuôi sinh gelatinase thích hợp từ vi khuẩn
tuyển chọn.
- Tiến hành: Chuẩn bị các bình môi trường nuôi sinh gelatinase thích hợp từ
nghiên cứu trên.
Quá trình nghiên cứu được thực hiện như sơ đồ Hình 2.11. Chủng vi khuẩn được nuôi sinh khối trong môi trường thích hợp từ nghiên cứu trên, ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 180 vòng/phút trong 12 giờ.
Sinh khối vi khuẩn được bổ sung vào các bình môi trường đã chuẩn bị với tỷ lệ sinh khối bổ sung là 10% để nuôi sinh enzyme. Tiến hành nuôi sinh enzyme ở 30oC, pH 7 trên máy lắc 180 vòng/phút theo thời gian.
Sau 24 giờ nuôi cấy thì bất đầu lấy mẫu thứ nhất để xác định hoạt độ dịch gelatinase. Tương tự cứ sau là 4 giờ lấy mẫu xác định hoạt độ gelatinase đến khi
Chủng vi khuẩn
Sinh khối
Nuôi sinh gelatinase
MT1 MT2 MT3 Ly tâm Xác định hoạt độ Nhiệt độ phòng Thời gian: 36 h Lắc 180 vòng/phút Môi trường thích hợp
hoạt độ dịch gelatinase thu được không tăng nữa thì dừng. Thời gian nuôi cấy cho dịch enzyme gelatinase thu được có hoạt độ cao nhất được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng tuyển chọn
c. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng gelatin trong môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn
Trong quá trình nuôi sinh enzyme từ vi khuẩn, cơ chất với một nồng độ nhất định thường đóng vai trò là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp một loại enzyme tương ứng [3]. Ban đầu khi nồng độ chất cảm ứng tăng thì lượng enzyme vi sinh vật tiết ra môi trường tăng nên hoạt độ enzyme thu được cao. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ chất cảm ứng đến một mức nào đó thì hoạt độ enzyme sẽ giảm. Do đó, việc xác định nồng độ chất cảm ứng thích hợp là cần thiết để tránh thiếu hoặc thừa chất cảm ứng ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme thu được.
Chủng vi khuẩn
Sinh khối
Nuôi sinh gelatinase
24h 32h 40h Ly tâm Xác định hoạt độ Nhiệt độ phòng MT: Thích hợp Lắc 180 vòng/phút 28h 36h … Thời gian thích hợp
Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng trong môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng vi
khuẩn tuyển chọn
- Mục đích: Xác định nồng độ gelatin thích hợp trong môi trường nuôi sinh
gelatinase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn.
- Tiến hành: Chuẩn bị các bình môi trường nuôi sinh gelatinase thích hợp từ
nghiên cứu trên với nồng độ gelatin khác nhau từ 0,5÷2% như Hình 2.12.
Chủng vi khuẩn được nuôi sinh khối trong môi trường thích hợp từ nghiên cứu trên, ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 180 vòng/phút trong 12 giờ.
Sinh khối vi khuẩn được bổ sung vào các bình môi trường đã chuẩn bị với tỷ lệ bổ sung là 10%. Tiến hành nuôi sinh enzyme gelatinase ở 30oC, pH 7 trên máy lắc 180 vòng/phút trong khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp từ nghiên cứu trên.
Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành xác định hoạt độ gelatinase ở các mẫu nuôi cấy có nồng độ chất cảm ứng khác nhau. Nồng độ gelatin trong môi trường nuôi cấy cho dịch enzyme gelatinase thu được có hoạt độ cao nhất được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Chủng vi khuẩn
Sinh khối
Nuôi sinh gelatinase
1,0 % 2,0 % Ly tâm Xác định hoạt độ Nhiệt độ phòng Lắc 180 vòng/phút MT: Thích hợp Nồng độ gelatin:0,5-2% 0,5 % 1,5 % Nồng độ gelatin thích hợp
d. Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn
Giá trị pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid hoặc là trung tính hoặc là kiềm.
Hình 2.13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng vi khuẩn
tuyển chọn
- Mục đích: Xác định giá trị pH môi trường ban đầu thích hợp để nuôi sinh
gelatinase từ vi khuẩn tuyển chọn.
- Tiến hành: Chuẩn bị các bình môi trường nuôi sinh gelatinase với nồng độ
gelatin thích hợp từ nghiên cứu trên với giá trị pH ban đầu thay đổi từ pH 4 đến pH 8 như sơ đồ Hình 2.13 và đưa đi vô trùng.
Chủng vi khuẩn được nuôi sinh khối trong môi trường thích hợp từ nghiên cứu trên, ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 180 vòng/phút trong 12 giờ.
Chủng vi khuẩn
Sinh khối
Nuôi sinh gelatinase
pH 6 pH 8 Ly tâm Xác định hoạt độ Nhiệt độ phòng Lắc 180 vòng/phút MT: Thích hợp Thời gian thích hợp pH 5 pH 7 pH thích hợp pH 4
Sinh khối vi khuẩn được bổ sung vào các bình môi trường đã chuẩn bị với tỷ lệ bổ sung là 10%. Tiến hành nuôi sinh enzyme gelatinase ở 30oC, trên máy lắc 180 vòng/phút trong khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp từ nghiên cứu trên.
Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành xác định hoạt độ gelatinase ở các mẫu nuôi cấy có pH khác nhau. Giá trị pH ban đầu của môi trường nuôi cấy cho dịch enzyme gelatinase thu được có hoạt độ cao nhất được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
e. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase của chủng tuyển chọn
Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, do hầu hết mọi quá trình chuyển đổi hóa sinh trong tế bào đều phụ thuộc vào nhiệt độ và từ đó ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vât. Mỗi loài vi sinh vật đều phát triển tốt trong một khoảng nhiệt độ nhất định, với vi khuẩn từ 25÷40oC.
Hình 2.14. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi sinh enzyme đến khả năng sinh gelatinase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn
- Mục đích: Xác định nhiệt độ tối ưu nuôi gelatinase từ chủng vi khuẩn tuyển
chọn.
Chủng vi khuẩn
Sinh khối
Nuôi sinh Enzyme
28oC 32oC 40oC Ly tâm Xác định hoạt độ MT: thích hợp Thời gian thích hợp Lắc 180 vòng/phút Môi trường thích hợp 36oC
- Tiến hành: Chuẩn bị các bình môi trường nuôi sinh gelatinase với nồng độ gelatin, pH ban đầu thích hợp từ những nghiên cứu trên và đưa đi vô trùng.
Chủng vi khuẩn được nuôi sinh khối trong môi trường thích hợp từ nghiên cứu trên, ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 180 vòng/phút trong 12 giờ.
Sinh khối vi khuẩn được bổ sung vào các bình môi trường đã chuẩn bị với tỷ lệ bổ sung là 10%. Tiến hành nuôi sinh enzyme gelatinase ở các nhiệt khác nhau như Hình 2.14, trên máy lắc 180 vòng/phút trong khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp từ nghiên cứu trên.
Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành xác định hoạt độ gelatinase ở các mẫu nuôi cấy có nhiệt độ khác nhau. Giá trị nhiệt độ nuôi cấy cho dịch enzyme gelatinase thu được có hoạt độ cao nhất được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.