phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn
a. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tác nhân và nồng độ kết tủa đến hoạt độ của chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn
Việc nghiên cứu tinh chế gelatinase là cần thiết cho quá trình ứng dụng enzyme cũng như việc bảo quản enzyme sau này. Có nhiều phương pháp để thu chế phẩm enzyme (CPE) kỹ thuật. Tùy vào từng mục đích sử dụng enzyme mà ta chọn phương pháp thu nhận CPE phù hợp. Trong nghiên cứu này, tiến hành tinh sạch gelatinase bằng phương pháp kết tủa bằng các tác nhân là amonium sulfat bão hòa, ethanol 99,5o và aceton 96% như Hình 2.15.
Hình 2.15. Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của các tác nhân và nồng độ kết tủa đến hoạt độ của chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn
- Mục đích: Xác định loại tác nhân kết tủa với nồng độ thích hợp để kết tủa
gelatinase thu chế phẩm kỹ thuật.
Ly tâm lạnh Kết tủa gelatinase Xác định hoạt độ Amoniumsulfat 1/2, 1/3, 1/4 Aceton 1/2, 1/3, 1/4 Ethanol 1/2, 1/3, 1/4 Dịch gelatinase thô Tác nhân và nồng độ thích hợp
- Tiến hành: Chủng vi khuẩn được nuôi sinh enzyme ở chế độ tối ưu đã nghiên cứu và đưa đi ly tâm lạnh để thu dịch gelatinase thô.
Dịch gelatinase thô được đưa đi kết tủa bằng các tác nhân đã chọn với các tỷ lệ giữa dịch enzyme/tác nhân kết tủa lần lược là 1/2 , 1/3 và 1/4, nhiệt độ kết tủa là 4oC và trong thời gian 10 phút.
Sau thời gian kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 phút để thu kết tủa. Phần kết tủa được hòa tan trở lại trong nước muối sinh lý và đưa đi xác định hoạt độ. Tác nhân kết tủa cùng với nồng độ kết tủa thu được chế phẩm gelatinase có hoạt tính cao sẽ được lựa chọn để kết tủa thu chế phẩm enzyme này.
Lưu ý:
Ethanol và aceton cần được làm lạnh trước để hạn chế gây biên tình enzyme trong quá trình kết tủa.
Khi cho ethanol và aceton vào dịch enzyme phải cho từ từ để tránh kết tủa cục bộ.
b. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ
của chế phẩm gelatinase từ chủng tuyển chọn
Thời gian kết tủa dài hay ngắn sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính cũng nhưng lượng chế phẩm enzyme thu được. Do đó, trong quá trình kết tủa enzyme cần nghiên cứu thời gian kết tủa để thu chế phẩm gelatinase có hoạt độ cao nhất hay nói cách khác là ít bị giảm hoạt độ nhất.
- Mục đích: Xác định thời gian kết tủa thích hợp để thu chế phẩm gelatinase
kỹ thuật.
- Tiến hành: Dịch gelatinase thô được kết tủa với tác nhân kết tủa ở nồng độ
thích hợp từ nghiên cứu ở trên theo thời gian.
Dịch gelatinase được kết tủa ở nhiệt độ lạnh 4oC trong các khoảng thời gian khác nhau như Hình 2.16. Sau khoảng thời gian kết tủa, thì tiến hành ly tâm lạnh 4oC với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 phút để thu kết tủa. Phần kết tủa được hòa tan trong nước muối sinh lý và đưa đi xác định hoạt độ. Thời gian kết tủa thu được chế phẩm gelatinase có hoạt tính cao sẽ được lựa chọn để kết tủa thu phẩm enzyme này.
Hình 2.16. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hoạt độ