chủng tuyển chọn
Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ và pH của môi trường, các ion kim loại và các chất khác. Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định pH, nhiệt độ tối thích của gelatinase thu và ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính của enzyme này. Quá trình nghiên cứu ảnh của các yếu tố đến hoạt tính của gelatinase được trình bày như sơ đồ (Hình 2.5).
Cấy trên môi trường gelatin-agar
Chọn chủng sinh gelatinase cao Xác định tỷ lệ đường kính vòng phân
giải/khuẩn lạc
Định danh chủng Chủng vi khuẩn
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nghiên cứu một số tính chất của enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn
a. Bố trí thí nghiệm xác định cơ chất đặc hiệu của enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định cơ chất đặc hiệu của enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn
Thủy phân dung dịch gelatin 1%
Điều kiện hoạt động thích hợp Nhiệt độ: 30, 40, 50,
60 và 70oC
Các ion kim loại: Ca2+, Mn2+, Mg 2+, Cu2+, Fe2+ pH môi trường: 5, 6, 7, 8, 9 Test cơ chất đặc trưng: Casein, BSA, Gelatin Dịch gelatinase thô Dịch gelatinase
Thủy phân với cơ chất
Xác định hoạt độ gelatinase
Cơ chất đặc hiệu
- Mục đích: Xác định cơ chất đặc hiệu cho gelatinase từ chủng nghiên cứu.
- Tiến hành: Chuẩn bị các dung dịch casein 1%, BSA 1% và gelatin 1%, điều
chỉnh pH các dung dịch về pH 7. Thực hiện phản ứng thủy phân bằng enzyme gelatinase lần lược với ba dung dịch đã chuẩn bị. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 40oC, trong 1 giờ với tỷ lệ E/S là 1/3.
Sau thời gian thủy phân, xác định hoạt độ CPE gelatinase tương ứng với mỗi cơ chất thủy phân. Cơ chất nào enzyme gelatinase đạt hoạt độ cao nhất là cơ chất đặc hiệu của enzyme này.
b. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn
Nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính xúc tác của enzyme, mỗi enzyme có một nhiệt độ phản ứng thích hợp. Trong giới hạn nhiệt độ chưa làm biến tính enzyme, hoạt tính enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng qua một giới hạn nào đó thì hoạt tính của enzyme lại giảm [1].
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme gelatinase từ chủng tuyển chọn
Dịch gelatinase
Thủy phân gelatin ở nhiệt độ
Xác định hoạt độ gelatinase
Nhiệt độ tối ưu
- Mục đích: Xác định nhiệt độ hoạt động tối ưu của gelatinase thu được từ chủng tuyển chọn.
- Tiến hành: Chuẩn bị các bình môi trường geletin 1%. Thực hiện phản ứng
thủy phân gelatin 1% bằng enzyme gelatinase ở pH 7, tỷ lệ E/S là 1/3 trong 1 giờ với nhiệt độ khác nhau từ 30÷70oC như Hình 2.7.
Sau thời gian phản ứng, tiến hành xác định hoạt độ gelatinase ở các mẫu thủy phân. Giá trị nhiệt độ gelatinase đạt hoạt độ cao nhất là nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme này sẽ được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
c. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase từ chủng tuyển chọn
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ gelatinase từ chủng tuyển chọn
Giá trị pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng của enzyme, mỗi enzyme chỉ hoạt động tốt tại một giá trị pH xác định gọi là pH hoạt động tối ưu của enzyme [1, 11]. Tùy thuộc vào bản chất enzyme mà pH hoạt động thích hợp của enzyme có thể trung tính, kiềm hoặc acid [1].
- Mục đích: Xác định giá trị pH hoạt động tối ưu của enzyme gelatinase thu
được từ chủng tuyển chọn.
pH tối ưu Dịch gelatinase
Thủy phân gelatin ở pH
Xác định hoạt độ gelatinase
- Tiến hành: Chuẩn bị các bình môi trường gelatin 1%. Chuẩn bị các bình môi trường geletin 1%. Thực hiện phản ứng thủy phân gelatin 1% bằng enzyme gelatinase ở nhiệt độ tối ưu, tỷ lệ E/S là 1/3 trong 1 giờ với giá trị pH phản ứng khác từ pH (5÷9) như Hình 2.8.
Sau thời gian phản ứng, tiến hành xác định hoạt độ gelatinase ở các mẫu thủy phân. Giá trị pH gelatinase đạt hoạt độ cao nhất là pH hoạt động tối ưu của enzyme này sẽ được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.