Thu hồi và tinh sạch phytase tái tổ hợp có nguồn gốc từ Bacillus subtilis trong dịch lên men Escherichia coli theo mẻ

Phytase là enzyme có ứng dụng quan trong trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi và chế biến thực phẩm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã cải tiến môi trường lên men LB và thu hồi được enzyme phytase BacP tái tổ hợp bằng phương pháp lên men theo mẻ chủng E. coli BL21(DE3) mang gen phyC tái tổ hợp.

HNUE JOURNAL OF SCIENCE Natural Sciences 2019, Volume 64, Issue 3, pp 123-132 This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn DOI: 10.18173/2354-1059.2019-0015 THU HỒI VÀ TINH SẠCH PHYTASE TÁI TỔ HỢP CÓ NGUỒN GỐC TỪ Bacillus subtilis TRONG DỊCH LÊN MEN Escherichia coli THEO MẺ Trần Thị Thúy Mai Thị Ngọc Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tóm tắt Phytase enzyme có ứng dụng quan trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi chế biến thực phẩm Trong nghiên cứu này, cải tiến môi trường lên men LB thu hồi enzyme phytase BacP tái tổ hợp phương pháp lên men theo mẻ chủng E coli BL21(DE3) mang gen phyC tái tổ hợp Enzyme BacP tái tổ hợp với hoạt độ 18,49 IU/mL thu sau 18 kích hoạt lactose, cao so với việc sử dụng chất kích hoạt biểu isopropyl β-D-1-thio-galactopyranoside (IPTG) Bằng phương pháp sắc kí lực kết hợp với đặc dịch lên men qua màng có kích thước lỗ KDa, enzyme BacP tinh 4,5 lần, đạt hoạt độ riêng 24,48 IU/mg protein Nghiên cứu tiền đề cho việc đánh giá khả sử dụng BacP, loại phytase kiềm có khả thủy phân phytate thành dẫn xuất inositol phosphate bậc thấp (IP 2, IP3) có giá trị dược học, chế biến thực phẩm Từ khóa: Phytase, enzyme tái tổ hợp, lên men mẻ, Bacillus subtilis, Escherichia coli Mở đầu Phytase enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic thành myo-inositol phosphate gốc phosphate vô tự Dạng muối axit phytic (các phytate) dạng dự trữ phosphate yếu hạt ngũ cốc (chiếm 1-3% hàm lượng chất khô hạt) [1] Đây nguyên nhân gây ức chế q trình tiêu hóa, làm giảm khả hấp thụ chất khoáng protein thể người động vật [2, 3] Chính vậy, enzyme phytase nghiên cứu ứng dụng rộng rãi enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm tăng hiệu kinh tế, giảm ô nhiễm phosphate môi trường đất nước cho trang trại chăn nuôi quy mô công nghiệp, bán công nghiệp [4] Căn vào vị trí nhóm phosphate bị phytase tác động, Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế chia phytase thành hai nhóm: 3-phytase 6-phytase [5] Tuy nhiên, thực tế ứng dụng, đặc tính hóa lí, hóa sinh enzyme lại quan tâm nhiều hơn; vậy, người ta thường phân chia phytase thành phytase axit (Histidine Acid Phosphatase, HAP phytase) phytase kiềm (Beta Propeller Phytase, BPP phytase) [6] Các HAP phytase (phytase từ E coli nấm mốc Aspergillus sp.) nghiên cứu nhiều ứng dụng rộng rãi chăn nuôi; nhiên, nghiên cứu BPP phytase (phytase kiềm từ Bacillus sp từ phấn số lồi hoa huệ tây) hạn chế [7, 8, 9], loại phytase cho thủy phân phytate khơng hồn tồn, tạo nhiều inositol phosphate bậc thấp (IP2, IP3) có lợi cho sức khỏe [10] Ngày nhận bài: 12/3/2019 Ngày sửa bài: 20/3/2019 Ngày nhận đăng: 27/3/2019 Tác giả liên hệ: Trần Thị Thúy Địa e-mail: thuy_tt@hnue.edu.vn 123 Trần Thị Thúy Mai Thị Ngọc Phytase kiềm hoa huệ tây (Lilium longixorum) tinh Garchow cs, 2006 [11] Đầu tiên, dịch enzyme kết tủa dung dịch (NH4)2SO4 với nồng độ bão hòa 25 - 60% thu enzyme với hoạt tính lại 41,1 - 56,5% Dịch thu tiếp tục tinh theo phương pháp sắc kí trao đổi ion cột HiTrap Q-FF HiPrep (Amersham Biosciences) cuối tinh đến đồng sắc kí lọc gel Powar Jagannathan, năm 1982, tinh phytase từ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis [12] Dịch lọc kết tủa cồn ethanol acetone, sau tiến hành sắc kí lọc gel cột lọc Amberlite IRP-64 tinh sắc kí trao đổi ion DEAE-cellulose Năm 1998, hai nhóm nghiên cứu độc lập Kerovuo J Kim YO chuyển biểu thành cơng gen mã hóa phytase kiềm Bacillus subtilis tinh phytase kiềm tái tổ hợp (PhyC TS-phy) từ dịch lên men sắc kí lực [7, 8] Nghiên cứu chúng tơi thực phytase kiềm có nguồn gốc từ Bacillus subtilis biểu E coli BL21 (DE3), vật chủ dùng phổ biến có hiệu suất sinh tổng hợp protein tái tổ hợp cao [13] Phytase Đỗ Thị Ngọc Huyền cs (2007) nghiên cứu tinh phần xác định đặc tính chưa đánh giá vai trò chất kích hoạt tồn trình lên men thu hồi enzyme tái tổ hợp [14] Nội dung nghiên cứu 2.1 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Nguyên vật liệu Chủng E coli NB tái tổ hợp mang plasmid tái tổ hợp pE10C2 chứa gen phyC mã hóa phytase từ Bacillus subtilis tạo lưu giữ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội (Tran, 2010) Chủng E coli BL21(DE3), dòng thường kí hiệu BL (Novagen, Mỹ) dòng biến nạp nhanh (One-shot) kí hiệu OS (Invitrogen, Mỹ) dùng để biểu nguồn gen mã hóa phytase từ Bacillus subtilis; dòng dùng để lên men, sinh tổng hợp phytase tái tổ hợp (BacP) Môi trường Luria Betani - LB (Difco), môi trường LBA (mơi trường LB có bổ sung ampicillin 100 mg/l) Các hóa chất: Tris-base (Sigma); axit axêtic, axit clohidric, natri hidroxit, ethanol, iso-propanol, glyxerol, canxi clorua, natri clorua, EDTA, IPTG, lactose, glucose, ammonium molypdate tricloroaxetic axit (Merck); natri-phytate (Sigma, P3168) tinh mức phân tích 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu * Xác định hoạt tính enzyme phytase BacP Hoạt tính enzyme phytase xác định theo phương pháp Shimizu, năm 1992 [15] Lượng phosphate vô (Pvc) giải phóng tác dụng phytase xác định dung dịch thử màu, dung dịch có chứa lần thể tích dung dịch A (1,5% amoniummolypdate (NH4)6Mo7O24 pha dung dịch 5,5% H2SO4 ) lần thể tích dung dịch B (2,7% FeSO4.7H2O) So mầu máy quang phổ tử ngoại khả kiến bước sóng 700 nm định lượng Pvc dịch enzyme dựa vào đồ thị chuẩn Pvc với hàm lượng NaH2PO4 từ 0,05 đến mM Một đơn vị hoạt tính phytase (IU) quy định lượng enzyme để giải phóng µmol P vc phút điều kiện thí nghiệm * Biểu enzyme BacP dịch nuôi cấy chủng E coli BL21(DE3) tái tổ hợp Chủng E coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang gen phyC hoạt hóa cách cấy khuẩn lạc từ đĩa thạch giữ giống 4-10℃ vào đĩa thạch chứa môi trường LBA nuôi tủ 37ºC Từ khuẩn lạc đĩa mơi trường thạch hoạt hóa cấy vào 25ml LBA bình nón, thể tích 100ml, ni lắc 37ºC 200 vòng/phút Giống vi khuẩn hoạt hóa bổ sung vào 200ml 124 Thu hồi tinh phytase tái tổ hợp có nguồn gốc từ Bacillus subtilis dịch lên men… mơi trường LBA lỏng bình tam giác 1000 ml cho OD620 ban đầu đạt 0,1; ni lắc 37ºC 200 vòng/phút OD620 đạt giá trị 1,0 -100 (Giai đoạn tăng sinh khối) Gen mã hóa phytase kích hoạt biểu cách bổ sung chất cảm ứng - IPTG 1mM lactose (112,5 mM) CaCl 10mM OD620 đạt giá trị 1,0 – 100 (tùy thuộc vào chiến lược lên men) nồng độ Pvc < 1mM Lấy mẫu (3 mL) định kỳ giờ/lần để kiểm tra khả sinh trưởng sinh tổng hợp phytase * Thu hồi enzyme BacP từ dịch nuôi cấy tế bào Dịch nuôi cấy E coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang gen phyC li tâm 8000 vòng/phút 10 phút để thu dịch (dịch enzyme dịch nuôi) cặn tế bào Cặn tế bào hòa dung dịch đệm 100mM Tris – HCl pH = 7, 5mM CaCl2 với thể tích 1/10 thể tích ban đầu, đặt nước đá (0ºC) đem phá tế bào sóng siêu âm với âm tần 20kHz, lặp lại vòng (mỗi vòng gồm phút siêu âm từ mức 10 đến 50% công suất phút nghỉ) Dịch phá tế bào li tâm thu dịch (dịch enzyme tế bào) loại bỏ cặn mảnh vỡ tế bào * Tinh enzyme BacP Enzyme BacP tinh sắc kí lực IMAC (Immobilized metal affinity chromatography) Cột sắc kí lực chứa hạt gel mang nhóm chức NTA (nitrilotriacetic acid) gắn với Ni2+, protein tái tổ hợp chứa đuôi 6-His tag (đi histidine) có khả tạo liên kết tĩnh điện với ion kim loại Ni2+, giúp protein giữ lại hạt gel chiết rút lực ion mơi trường có chất cạnh tranh (imidazole) với đuôi 6-His tag nồng độ cao Quy trình tinh gồm 05 bước: (1) Cân cột dung dịch đệm cân cột (100mM Tris – HCl pH = 7, 300 mM NaCl, 5mM CaCl2, 1% Glycerol); (2) Gắn protein đích: Mẫu protein enzyme (trong dung dịch 100mM Tris – HCl pH = 7, mM CaCl2 dung dịch đệm cân cột trộn theo tỉ lệ thể tích mẫu protein: dung dịch đệm) bổ sung vào cột; (3) Rửa cột dung dịch đệm cân cột; (4) Chiết enzyme khỏi cột dung dịch đệm chiết enzyme (100mM Tris – HCl pH = 7, 300 mM NaCl, 5mM CaCl2, 1% Glycerol, 250mM imidazol); (5) Cân lại cột dung dịch đệm cân cột Vận tốc dòng chảy suốt trình tinh mL/phút Protein tổng số dung dịch xác định phản ứng màu với coomasie brilliant blue [16] Kích thước phytase BacP xác định điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 12,5% (w/v) vị trí băng vạch protein hiển thị cách nhuộm gel dung dịch coomassie brillant blue [17] Trọng lượng phân tử protein xác định protein chuẩn hãng Lonza 2.2 Kết thảo luận 2.2.1 Hoạt hóa, đánh giá lựa chọn chủng E coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang gen mã hóa phytase từ Bacillus subtilis Plasmid tái tổ hợp pE10C2 mang đoạn ADN ngoại lai (phyC) mã hóa phytase kiềm (BacP) Bacillus subtilis bảo quản tế bào chủ tách dòng E coli NB hãng Novagen Để phục vụ mục đích lên men, biểu gen E coli, tách chiết, tinh plasmid từ dịch nuôi cấy E coli NB tái tổ hợp biến nạp vào tế bào khả biến E coli BL21(DE3) Kết biến nạp vào hai dòng tế bào chủ E coli BL21(DE3) khả biến BL OS thu số khuẩn lạc to tách biệt môi trường thạch LB có chứa kháng sinh ampicilin 100 µg/mL yếu tố chọn lọc Các khuẩn lạc mọc môi trường khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp pE10C2, nhiên, thực việc kiểm tra lại có mặt gen phyC số dòng tế bào lựa chọn ngẫu nhiên từ khuẩn lạc mọc tách biệt đĩa thạch mơi trường LB có chứa kháng sinh ampicilin 100 µg/mL phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen phyC Kết điện di để kiểm tra nhân lên gen phyC phản 125 Trần Thị Thúy Mai Thị Ngọc ứng PCR trực tiếp từ dịch phá vỡ tế bào dòng E coli kiểm tra dương tính (Hình 1) Như vậy, dòng tế bào mang đoạn ADN đích (gen phyC), đoạn ADN có kích thước khoảng 1,1 kb (đúng với kích thước gen phyC) Hình Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR nhân gen phyC trực tiếp từ khuẩn lạc Chú thích: ADN ladder: Thang chuẩn ADN; plasmid pE10C2: đối chứng dương (phản ứng PCR có ADN khn plasmid pE10C2 tách chiết từ E coli NB); BL3, 6: dòng tế bào biến nạp E coli BL21 (DE3), OS1 2: dòng tế bào biến nạp nhanh E coli One shotBL21 (DE3) Kết đánh giá khả biểu dòng E coli mang gen mã hóa phytase kiềm, phyC, trình bày Hình Trên mơi trường LBA, sử dụng mM IPTG với 10 mM CaCl2 làm chất kích hoạt biểu OD620 đạt giá trị 1, dòng E coli kiểm tra biểu protein tái tổ hợp có hoạt tính phytase từ 0,03 IU/mL đến 1,73 IU/mL dịch ni cấy (Hình 2) Mẫu đối chứng kích hoạt nước 10mM CaCl2 khơng thể hoạt tính Tuy nhiên, protein tái tổ hợp từ dòng biểu sau kích hoạt đạt cực đại sau 20 kích hoạt; chậm so với nghiên cứu Tran cs (2010) 10 [13] Khác biệt tốc độ sinh trưởng thời điểm kích hoạt dòng E coli tái tổ hợp nghiên cứu (OD620  1,0 sau nuôi cấy) thấp nhiều so với tốc độ sinh trưởng quần thể vi sinh vật thời điểm kích hoạt nghiên cứu Tran cs (OD620 = 10,8) Hình Đánh giá khả biểu gen phyC dòng E coli tái tổ hợp 126 Thu hồi tinh phytase tái tổ hợp có nguồn gốc từ Bacillus subtilis dịch lên men… Sau 22 ni cấy, dòng BL5 BL6 cho khả tổng hợp phytase cao so với chủng lại (1,7 IU/ml), nhiên dòng BL5 sinh trưởng tốt mơi trường LBA (OD620 đạt 4,7) so với dòng BL6 (OD620 đạt 4,2) Do đó, chúng tơi lựa chọn dòng BL5 cho nghiên cứu 2.2.2 Lên men thu hồi phytase BacP tái tổ hợp Từ kết đánh giá biểu dòng biến nạp, chúng tơi nhận thấy chủng sản xuất sinh trưởng tốt môi trường LBA Tuy nhiên, giá thành tryptone – thành phần quan trọng môi trường LBA tương đối cao nên chúng tơi tiến hành thí nghiệm môi trường LBA cải tiến sử dụng peptone làm nguồn cung cấp carbon nitơ Chất kích hoạt biểu có vai trò quan trọng định đến q trình sinh tổng hợp phytase, để lựa chọn chất kích hoạt phù hợp với nồng độ thích hợp cần thiết Dựa vào kết nghiên cứu Tran (2010), sử dụng IPTG lactose làm chất kích hoạt đạt kết tương đối cao với tổng hoạt tính thu kích hoạt sử dụng IPTG 10 U/mL đạt 71 U/mL sử dụng lactose, tiến hành lên men tổng hợp phytase chủng sản xuất với hai chất kích hoạt IPTG lactose Các chất kích hoạt bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ lần lượt: 1mM IPTG 12,5 mM lactose với 10 mM CaCl2, tế bào E coli pha sinh trưởng cấp số * Kết kích hoạt biểu gen phyC IPTG IPTG chất kích hoạt biểu gen phổ biến nghiên cứu tổng hợp enzyme tái tổ hợp IPTG liên kết với lacI bất hoạt chúng khơng phải chất β– galactosidase nên khơng bị chuyển hóa thành sản phẩm khác, đồng thời nồng độ chúng không đổi khơng bị chuyển hóa E coli [18] Sau kích hoạt IPTG, chúng tơi thu mẫu tế bào dịch nuôi cấy để tiến hành xác định hoạt tính phytase tổng số Dòng E coli BL5 bắt đầu tổng hợp phytase sau ni cấy Hoạt tính phytase tăng dần từ 4,25 IU/mL đạt cao sau 14 kích hoạt biểu (đạt 12 IU/mL) thời điểm OD620 đạt 3,36 Sau đó, q trình tổng hợp phytase tái tổ hợp rơi vào pha cân bằng; sau 21 nuôi cấy, OD620 tăng nhẹ đến 28 sau kích hoạt protein tái tổ hợp không sinh tổng hợp thêm (Hình 3) Hình Kết kích hoạt biểu gen phyC IPTG Trong đầu sau kích hoạt biểu gen, enzyme phytase tái tổ hợp biểu chủ yếu tế bào khoảng 4,25 IU/mL (khơng đo hoạt tính phytase bên ngồi dịch ni cấy) Sau kích hoạt biểu gen, lượng phytase tái tổ hợp (20 - 30% tổng hoạt tính phytase 127 Trần Thị Thúy Mai Thị Ngọc biểu hiện) xuất dịch nuôi tế bào Hoạt tính phytase bên ngồi tế bào, dịch nuôi tăng dần đạt mức 50-60% tổng hoạt độ phytase tái tổ hợp đo Việc enzyme tái tổ hợp biểu xoang chu chất tế bào E coli ngồi mơi trường ni cấy có CaCl2 mơi trường ni cấy báo cáo nhiều tác giả Choi Lee năm 2004 [19], Pugsley năm 1993 [20]; giải thích lượng protein tái tổ hợp biểu nhiều xoang chu chất, mức chứa xoang nên bên ngồi tế bào có tác động ion Ca2+ * Kết kích hoạt biểu gen phyC lactose Lactose chất kích hoạt biểu tự nhiên hệ thống operon lac Do có giá thành rẻ chất kích hoạt tổng hợp hóa học IPTG, lactose dùng nhiều kích hoạt biểu gen tái tổ hợp điều khiển lac operator quy mô công nghiệp Tuy nhiên, vấn đề chất kích hoạt tế bào chủ E coli ln có hệ thống enzyme β – galactosidase thủy phân chất thành đường glucose lactose phục vụ cho hoạt động sống E coli; vậy, lactose bị tế bào chủ phân hủy phần tồn mơi trường Để ngăn ngừa tượng xảy ra, người ta thường bổ sung lactose với hàm lượng lớn IPTG nhiều dùng lactose để kích hoạt biểu gen; ra, người ta sử dụng chiến lược bổ sung thêm lactose suốt q trình kích hoạt biểu gen Kết thu kích hoạt lactose tương tự với q trình lên men kích hoạt IPTG, hoạt tính phytase tổng số tăng dần từ sau kích hoạt, tăng từ 5,32 IU/mL đến 18,49 IU/mL sau 18 kích hoạt (Hình 4) sau lại giảm Hoạt tính phytase tái tổ hợp xoang tế bào bắt đầu thoát bên ngồi tế bào, dịch ni cấy sau kích hoạt biểu tăng dần đến mức chiếm 70% tổng hoạt tính phytase sau 18 kích hoạt biểu gen Theo báo cáo Tran cs (2010), hoạt tính phytase tái tổ hợp bên ngồi tế bào chủ kích hoạt lactose lên đến 90% mơi trường khống sở [13] Hình Kết kích hoạt biểu gen phyC lactose So sánh trình sinh tổng hợp phytase sử dụng hai chất kích hoạt IPTG lactose, chúng tơi nhận thấy dòng E coli tái tổ hợp BL5 có khả sinh tổng hợp phytase cao với hai chất kích hoạt biểu IPTG lactose Tuy nhiên sử dụng lactose làm chất kích hoạt chủng có hoạt tính cao gấp 1,53 lần so với sử dụng IPTG (Hình 5); chất kích hoạt rẻ tiền dễ kiếm hơn; đó, chúng tơi lựa chọn lactose làm chất kích hoạt biểu để thu enzyme với lượng lớn để phục vụ cho trình tinh phytase 128 Thu hồi tinh phytase tái tổ hợp có nguồn gốc từ Bacillus subtilis dịch lên men… Hình So sánh hoạt độ phytase BacP tái tổ hợp sử dụng chất kích hoạt biểu IPTG lactose 2.2.3 Tinh phytase BacP tái tổ hợp Sau lên men sản xuất phytase BacP tái tổ hợp mơi trường LBA cải tiến sử dụng chất kích hoạt biểu lactose, tiến hành phá tế bào tinh phytase theo quy trình trình bày Theo báo cáo tác giả khác kích thước phân tử BacP từ 35-50 kDa [13] Do vậy, tiến hành li tâm dịch phá tế bào qua cột có màng lọc kilodalton, kết từ 300 mL dịch enzyme thô thu 11 2mL dịch li tâm chứa phytase BacP với hoạt độ riêng tăng gấp 1,9 lần hiệu suất thu hồi đạt 74,12 % (Bảng 1) Phytase BacP tái tổ hợp tinh từ 112 mL dịch li tâm cô đặc cột sắc kí lực cột Ni-NTA mL Các phân đoạn thu với thể tích mL/phân đoạn (giai đoạn rửa giải) mL/phân đoạn (giai đoạn gắn protein), xác định protein tổng số quang phổ UV với bước sóng 280 nm Kết tinh phytase BacP sắc kí lực trình bày Hình Bảng Kết tinh phytase BacP tái tổ hợp 129 Trần Thị Thúy Mai Thị Ngọc Hình Sắc kí đồ tinh phytase BacP tái tổ hợp sắc kí lực cột Ni-NTA Hoạt tính enzyme phytase phân đoạn số 20-60; 61-93; 94-115 116-145 kiểm tra đồng thời Các phân đoạn 20-60; 61-93 116-145 khơng có hoạt tính có hoạt tính thấp Hoạt tính enzyme phytase tái tổ hợp thu chủ yếu phân đoạn 94-115; đỉnh hoạt tính trùng với đỉnh protein rửa giải khỏi cột (Hình 6) hoạt tính trung bình enzyme thu phân đoạn 99 - 100 cao đạt 148,87 IU/mL Đây phân đoạn mà imidazole bổ sung vào dung dịch đệm thay hoàn toàn đẩy phytase tái tổ hợp khỏi cột Các phân đoạn tinh sắc kí lực kiểm tra độ tinh điện di SDS - PAGE (Hình 7) Hình Kết chạy điện di SDS – PAGE Chú thích: (1) Thang protein chuẩn Lonza (4,5-300 kDa); (2) Dịch enzyme thô; (3) Dịch enzyme li tâm qua cột kDa; (4) phân đoạn 40; (5) phân đoạn 50; (6) phân đoạn 99 – Enzyme tinh pha loãng 10 lần dung dịch đệm Kết chạy điện di SDS-PAGE vị trí đỉnh protein rửa giải enzyme (phân đoạn 99) cho thấy có băng vạch xuất đậm nét nằm vạch 40 55 KDa thang protein chuẩn; vạch phụ khác có hàm lượng protein thấp (không rõ nét) Kết tương ứng với kết kiểm tra hoạt tính, chứng tỏ enzyme tinh tốt sắc kí lực cột Ni-NTA 130 Thu hồi tinh phytase tái tổ hợp có nguồn gốc từ Bacillus subtilis dịch lên men… Phytase kiềm BacP tái tổ hợp có khối lượng khoảng 44 kDa, phù hợp với nghiên cứu trước phytase kiềm [21] Kết luận Bằng phương pháp lên men chủng E coli BL21(DE3) (mang gen phyC tái tổ hợp) theo mẻ môi trường LB cải tiến, thu hồi enzyme BacP tái tổ hợp với hoạt độ 18,49 IU/ml sau 18 kích hoạt lactose 12 IU/ml sau 14 kích hoạt biểu IPTG Kết tinh sắc kí lực thu enzyme BacP tinh 4,5 lần, enzyme tinh có hoạt độ riêng đạt 24,48 IU/mg protein Phytase BacP tinh tiếp tục đánh giá tính an tồn để ứng dụng chế biến thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Cheryan M, 1980 Phytic acid interactions in food systems CRC Crit Rev Food Sci Nutr, 13, pp 297-335 [2] Reddy NR, Pierson MD, Sathe SK, Salunkhe DK, 1989 Interactions of phytate with proteins and minerals, In: Reddy NR, Pierson MD, Sathe SK, Salunkhe DK, editors Phytate in legumes and cereal, CRC Press, pp 57-70 [3] Harland BF, Morris ERM, 1995 Phytate: A good or a bad food component? Nutrition Reseach,15(5), pp 733-754 [4] Tran Thi Thuy and Dao Thi Nu, 2017 Synergic effect of different phytase preparations in feed HNUE Journal of Science, Chemical and Biological Sciences, Vol 62 Iss.10, pp 143-152 [5] Greiner R, Konietzny U, Jany KD, 1993 Purification and chacracterization of two phytases from Escherichia coli Arch Biochem Biophys 303, pp 107-113 [6] Oh BC, Chang BS, Park KH, Ha NC, Kim HK, 2001 Calcium-dependent catalytic activity of a novel phytase from Bacillus amyloliquefaciens DS11 Biochem (40), pp 9669-9676 [7] Kerovuo J, Lauraeus M, Nurminen P, Kalkkinen N, Apajalahti J, 1998 Isolation, characterization, molecular gene cloning of a novel phytase from Bacillus subtilis Appl Environ Microbiol 64(6), pp 2079-2085 [8] Kim YO, Kim HK, Bae KS, Yu JH, Oh TK, 1998 Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus sp DS 11, Enzyme Microbiol Technol 22, pp 2-7 [9] Tye AJ, Siu F, Leung T, Lim B, 2001 Molecular cloning and the biochemical characterization of two novel phytases from B subtilis 168 and B Licheniformis Appl Microbiol Biotechnol 59, pp 190-197 [10] Oh BC, Choi WC, Park S, Kim YO, Oh TK, 2004 Biochemical properties and substrate specificities of alkaline and histidine acid phytase Appl Micro Biotech 63, pp 362- 372 [11] Garchow BG, Jog SP, Mehta BD, Monosso JM, Murthy PP, 2006 Alkaline phytase from Lilium longiflorum: purification and structural characterization Protein Expression and Purification, 46(2), pp 221-232 [12] Powar VK and Jagannathan V, 1982 Purification and properties of phytate-specific phosphatase from bacillus subtilis J Bacteriol, 151(3), pp 1102-1108 [13] Tran TT, Mamo G, Mattiasson B, Hatti-Kaul R, 2010 A thermostable phytase from Bacillus sp MD2: cloning, expression and high-level production in Escherichia coli J Industrial Microbiol Biotechnol, 37(3), pp 279-287 131 Trần Thị Thúy Mai Thị Ngọc [14] Đỗ Thị Ngọc Huyền cs, 2007 Tinh xác định tính chất phytase tái tổ hợp Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5(3), tr 331-336 [15] Shimizu M, 1992 Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77 Biosci Biotechnol Biochem, 56(8), pp 1266-1269 [16] Bradford M, 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principal of protein dye binding Anal Biochem, 72, pp 248-254 [17] Laemmli UK, 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227(5259), pp 680-685 [18] https://www.biologicscorp.com/blog/iptg-induction-protein-expression/#.W_HMsegzbIU (16/2/2018) [19] Choi JH, Lee SY, 2004 Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli Appl Microbiol Biotechnol 64, pp 625-635 [20] Pugsley AP, 1993 The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria Microbiol Rev 57, pp 50-108 [21] Lehmann M, Kostrewa D, Wyss M, Brugger R, D’Arcy A, Pasamontes L., 2000 From DNA sequence to improved functionality: using protein sequence comparisons to rapidly design a thermostable consensus phytase Protein Eng, 13, pp 49-57 ABSTRACT Expression and purificaton of a recombinant phytase originated from Bacillus subtilis in batch cultivation of escherichia coli Tran Thi Thuy and Mai Thi Ngoc Faculty of Biology, Hanoi National University of Education Phytase is an important enzyme in feed and food processing In this study, common medium (LB broth) have been modified for batch cultivation of E coli BL21(DE3) to express phyC gene coding for a recombinant phytase (BacP) originated from Bacillus suntilis Recombinant BacP enzyme was recovered at 18.49 IU/ml after 18 hours of induction by lactose, which was higher than that of induction by isopropyl β-D-1-thio-galactopyranoside (IPTG) Cutivation both was concentrated by filteration through a KDa cutoff membrane and BacP enzyme was purified 4.5 times by affinity chromatography through Ni-NTA column to reach a specific activity of 24,48 IU/mg protein These shall be a preliminary results for further study on application of phytase enzyme BacP which can catalyse the hydrolysis of phytate to lower myo- inositol phosphate (IP2 and IP3) having potential health benefit in food Keywords: Phytase, recombinant enzyme, batch cultivation, Bacillus subtilis, Escherichia coli 132 ... khả biểu gen phyC dòng E coli tái tổ hợp 126 Thu hồi tinh phytase tái tổ hợp có nguồn gốc từ Bacillus subtilis dịch lên men Sau 22 nuôi cấy, dòng BL5 BL6 cho khả tổng hợp phytase cao so với chủng... để thu enzyme với lượng lớn để phục vụ cho trình tinh phytase 128 Thu hồi tinh phytase tái tổ hợp có nguồn gốc từ Bacillus subtilis dịch lên men Hình So sánh hoạt độ phytase BacP tái tổ hợp. .. cột Ni-NTA 130 Thu hồi tinh phytase tái tổ hợp có nguồn gốc từ Bacillus subtilis dịch lên men Phytase kiềm BacP tái tổ hợp có khối lượng khoảng 44 kDa, phù hợp với nghiên cứu trước phytase kiềm