Nghiên cứu tạo đột biến khử độc và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin b (seb) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện tụ cầu vàng trong thực phẩm

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-* -

PHAN THỊ HOÀNG HẢO

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC

VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG

TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 604280

Người hướng dẫn khoa học: TS NCVC Chu Hoàng Hà

Thái Nguyên, Năm 2010

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng sự nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học thực hiện từ tháng 3 tới tháng 9 năm 2010

Hà Nội, ngày 27 tháng 09 năm 2010 Học viên ký tên

Phan Thị Hoàng Hảo

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS NCVC Chu Hoàng Hà, TS Nguyễn Hữu Cường, TS Phạm Bích Ngọc phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Nghiêm Ngọc Minh đã cho phép tôi tham gia thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ cho tạo kít phát hiện nhanh ngộ độc thực phẩm do độc

tố tụ cầu vàng”

Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của TS Lê Văn Sơn, TS Lâm Đại Nhân, CN Hoàng Hà, Ths Lê Thu Ngọc và các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật cùng các bạn sinh viên trong phòng

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Phan Thị Hoàng Hảo

Trang 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam 3

1.1.1 Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm 3

1.1.2 Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam 4

1.2 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 6

1.2.1 Đặc điểm phân loại 6

1.2.2 Đặc điểm vi khuẩn học 6

1.2.2.1 Hình dạng và kích thước 6

1.2.2.2 Độc tố và khả năng gây bệnh 7

1.2.3 Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 10

1.3 Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B 10

1.3.1 Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B 10

Trang 5

1.3.2 Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B 12

1.3.3 Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng 14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 17

2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 18

2.2.2.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 18

2.2.2.2 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 20

2.2.2.3 Phương pháp xử lý enzym hạn chế 20

2.2.2.4 Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose 22

2.2.2.5 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector 23

Trang 6

2.2.2.6 Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia

2.2.2.9 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 26

2.2.2.10 Phương pháp tinh sạch protein 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Kết quả nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện 29

3.1.1 Thiết kế mồi 30

3.1.2 Kết quả PCR nhân gen seb 31

3.1.3 Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb 32

3.2 Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen seb đột biến 34

3.2.1 Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên pET21a+ 34

3.2.2 Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu hiện 36

3.2.3 Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR 37

3.2.4 Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế 38

3.2.5 Kết quả giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện …… ……….……40

3.3 Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEB tái tổ hợp 39

Trang 7

3.3.1 Biến nạp vector tái tổ hợp pET 21a+/SEB vào Escherichia coli chủng

BL21(DE3) 40

3.3.2 Kiểm tra sự biểu hiện gen seb 41

3.3.3 Tối ƣu các điều kiện biểu hiện gen seb 43

3.3.4 Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB 47

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

Trang 8

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Deoxyribonucleic acid

APS Ammonium persulphate ARN Ribonucleic Acid

bp Base pair cs Cộng sự dH2O Nước khử ion

dNTP Deoxyribonucleotide

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

IPTG Isopropylthio--D-galactoside Kb Kilobase

LB Luria and Bertani

PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction

SDS Sodium dodecyl sulfate SEB Staphylococcal enterotoxin B

SEs Staphylococcal enterotoxins v/p Vòng / phút

Trang 9

DANH MỤC BẢNG

1.1 Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 – 2009 5

3.1 Trình tự cặp mồi nhân bản đoạn gen seb đột biến từ vector GS45350 31

Trang 10

Trang 11

DANH MỤC HÌNH

1.1 Hình ảnh các vi khuẩn S aureus dưới kính hiển vi điện tử 7

1.4 Mô phỏng cấu trúc 3 chiều của protein SEB 12 1.5 Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của các tế bào T 13

3.1 Các axit amin sai khác giữa protein SEB đột biến và protein SEB kiểu dại 29 3.2 Sơ đồ vector GS45350 mang gen seb đột biến 30 3.3 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F và

mSEB- R

32

3.6 Điện di plasmid pET21a+ sau khi cắt bằng các enzym hạn chế 35 3.7 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB vào tế bào khả biến E

Trang 12

3.12 Điện di so sánh protein tổng số của các tế bào E.coli BL21(DE3) 42 3.13 Điện di so sánh khả năng biểu hiện protein SEB ở các nhiệt độ khác nhau 45 3.14 So sánh khả năng biểu hiện protein SEB tại các điều kiện khác nhau 46 3.15 Điện di kiểm tra protein SEB dạng tan trước khi tinh sạch 47 3.16 Điện di kết quả tinh sạch protein SEB tái tổ hợp 48

Trang 13

MỞ ĐẦU

Thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn chứa các chất có tính độc hại đối với người ăn là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở các các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu, kém phát triển Tại Việt Nam, trong những năm gần đây số vụ nhiễm độc thực phẩm cũng ngày càng tăng và hậu quả ngày càng nghiêm trọng

Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất ở

người và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với

nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus Hiện nay, việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều

khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh Vì vậy, việc xác định sự có

mặt SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm đóng vai trò hết sức quan trọng

Trên thế giới và tại Việt Nam hiện nay cũng đã phát triển các loại kít phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch, phương pháp này đòi hỏi cần có kháng thể đặc hiệu Do vậy việc biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên SEB tái tổ hợp không có độc tính, có khả năng gây phản ứng miễn dịch tạo các

kháng thể IgG đặc hiệu là cấp thiết

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo đột

biến khử độc và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện tụ cầu vàng trong thực phẩm ”

Trang 14

Mục tiêu nghiên cứu

- Biểu hiện và tinh sạch protein SEB trong tế bào vi khuẩn E coli tạo nguyên liệu

tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng trong thực phẩm

Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được mục tiêu đặt ra, đề tài thực hiện những nội dung chính sau: - Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB đã được gây đột biến loại độc tính

- Nghiên cứu các điều kiện để tối ưu khả năng biểu hiện protein SEB trong tế bào vi

khuẩn E coli

- Tinh sạch protein SEB để sử dụng làm nguyên liệu tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng trong thực phẩm

Trang 15

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hoá, việc sản xuất và phân phối sản phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn đến khả năng lan tràn khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm Đồng thời, trong quá trình công nghiệp hoá, thực phẩm thường được sản xuất hàng loạt, đã làm số ca mắc các bệnh do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [21] Hậu quả và thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày càng tăng

Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm: vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus; trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% ca bệnh và tử vong ở người [9] Trong số các nguyên nhân đã được xác định, một số vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc cấp

tính rất nguy hiểm, với tỷ lệ tử vong cao như: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio chlolera, Samonella aureuslmonella, Campylobacterer, Yersinia enterocolitica v.v [12] Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng (S aureus) là nguyên nhân hàng đầu gây ra ngộ độc [2]

Thực phẩm ô nhiễm các vi sinh vật và các độc tố của chúng là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở các các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu, kém phát triển [37] Tại

Trang 16

Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), thịt hun khói (100%), xúc xích

(96,6%), bánh gato (85%), Patê (83,3%) v.v Đáng chú ý là vi khuẩn S aureus

thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn [5]

1.1.2 Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc

tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam

Tụ cầu S aureus là một trong những loài vi khuẩn gây bệnh được ghi nhận

sớm nhất vào đầu những năm 1880 Sự liên quan của tụ cầu tới nhiễm trùng, nhiễm độc thức ăn được biết đến từ năm 1914, nhưng mãi tới năm 1930, Dack và cs mới xác định được nhiễm trùng, nhiễm độc tụ cầu có thể gây ra bởi các độc tố ruột có trong dịch nuôi cấy tụ cầu vàng [4]

Từ giữa những năm 1969 và 1990, tại Anh, 53% trường hợp ngộ độc thực

phẩm do S aureus được ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc biệt là

ruốc); 22% các trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên quan sữa, 7%

từ cá, sò, ốc v.v và 3,5% từ trứng [38] Tại Pháp, trong số các thực phẩm nhiễm S aureus được ghi nhận trong hai năm (1999-2000) có các sản phẩm từ sữa (đặc biệt

là pho-mát) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá và hải sản (11%), trứng và các sản phẩm từ trứng (11%) hoặc các sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%) [17] Tại Hoa

Kỳ, trong số các trường hợp ngộ độc thực phẩm do S aureus được báo cáo giữa các

năm 1975 và 1982 thì 36% là do tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt: 5,1% đến 1,4%, còn lại là từ các sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản [41] Như vậy, giữa các nước khác nhau loại thực phẩm dễ nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau

Cho tới nay tại Việt Nam thực tế chưa có những thống kê cụ thể về số ca mắc hay tử vong do ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB Có nhiều nguyên nhân gây khó khăn cho quá trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do SEB: 1) Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các cơ sở chuyên khoa; 2) Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thường có nhiều bệnh có biểu

Trang 17

hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chưa kết luận đúng bệnh; 3) Việc tiến hành các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá mới mẻ, chủ yếu vẫn dựa vào các phương pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức và thời gian kéo dài Do đó, khi bệnh nhân nhiễm độc tụ cầu và các nội độc tố như SEB sẽ gặp nguy hiểm gấp bội vì SEB là một siêu kháng nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh , có thể dẫn tới tử vong ở người

Bảng 1.1 Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 – 2009

Dựa theo bảng 1.2 trên đây, chúng tôi nhận thấy tình trạng xuất hiện vi sinh

vật S aureus ở các loại thực phẩm diễn ra khá phổ biến trong cả nước.Vi khuẩn có thể gây ngộ độc cấp tính cho nhiều người trong cùng một thời điểm khi họ cùng tiêu

Số người mắc bệnh

Đặc điểm bệnh nhân 1 Mầm non bán công Vĩnh Thọ - Phú Thọ 9/2007 100 Học sinh

2 Mầm non Vườn Hồng, P9 - Tân Bình; Tiểu học Âu

Trẻ em (từ 2-5 tuổi)

đám cưới 5 Cty TNHH Alliace One, KCN Giao Long, Bến Tre 6/2008 100 Công nhân

7 Tiểu học Tam Bình, Q Thủ Đức -TP HCM 11/ 2008 51 Học sinh và phụ huynh 8 Cty Phú Nguyên, KCN An Đồng

Trang 18

thụ một loại thực phẩm Ngộ độc thực phẩm do S aureus có thể xảy ra với bất kì

đối tượng nào Tuy nhiên, người già, trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém sẽ dễ mắc và biểu hiện triệu chứng nhiễm độc nặng nề hơn [3]

Việc tìm ra phương pháp phát hiện sớm S aureus và độc tố SEB của nó gây

nhiễm trùng nhiễm độc trực tiếp trên thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng và cấp thiết, nhằm loại bỏ và có biện pháp xử lý sớm đối với các thực phẩm đang nhiễm độc nhiễm trùng Chính vì vậy, việc tiến hành đề tài này sẽ là một nhu cầu thực tiễn và cấp bách

1.2 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus

1.2.1 Đặc điểm phân loại

Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ

Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài Staphyococcus aureus

- Tên khoa học: Staphyococcus aureus Rosenbach 1884 [6]

Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chính: tụ

cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase S aureus gây bệnh ngộ độc thực

phẩm là tụ cầu có coagulase Nhờ enzym này mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn được gọi là tụ cầu vàng

Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn Nhưng dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn

Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các nhóm

I, II, III, IV Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại S aureus [4]

1.2.2 Đặc điểm vi khuẩn học 1.2.2.1 Hình dạng và kích thước

Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với “staphyle” có nghĩa

chùm nho) là những cầu khuẩn có đường kính khoảng 1 μm, không di động và sắp

Trang 19

xếp theo mọi hướng tạo thành cụm (tụ) trông giống như chùm nho Chúng là các cầu khuẩn Gram dương, không có lông, không tạo nha bào và thường không có vỏ (Hình 1.1)

Ngoài ra, cầu khuẩn S aureus không có khả năng tạo bào tử như các vi khuẩn Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum, và Bacillus cereus cũng

thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn [41]

1.2.2.2 Độc tố và khả năng gây bệnh - Các loại độc tố

Tụ cầu vàng sản sinh ra 11 độc tố (hình 1.2): độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc (TSST-Toxic shock syndrome toxin); độc tố exfoliatin hay độc tố epidermolitic; độc tố alpha; độc tố bạch cầu (leucocidin); ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic); dung huyết tố (hemolysin hay staphylolysin); fribrinolysin (staphylokinase); coagulase;

hyaluronidase; β – lactamase và độc tố ruột (enterotoxin) – trong đó có SEB [4]

Ngoài ra, tụ cầu có hệ enzym phong phú góp phần làm tăng độc lực của chúng đối với các tế bào vật chủ

Hình 1.1 Hình ảnh các vi khuẩn S aureus dưới kính hiển vi điện tử

Trang 20

Hình 1.2 Các độc tố quyết định của S aureus

(Nguồn: http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/staph.html)

Độc tố ruột được sản xuất bởi phần lớn các chủng tụ cầu vàng, nhưng không phải là tất cả mọi chủng Các độc tố này là những protein tương đối bền với nhiệt, nên không bị phá hủy bởi sự đun nấu, có trọng lượng phân tử từ 28000-30000 Dalton và bao gồm 6 loại (type) được ký hiệu từ A tới E [4] Ono và cs (2008), đã phát hiện ra 2 loại độc tố mới là SES và SET cũng nằm trong nhóm những độc tố

ruột do S aureus tạo ra [27] Về miễn dịch, các loại này được phân biệt khá rõ ràng,

mặc dù giữa chúng có những kháng nguyên chéo Về cơ chế gây bệnh, độc tố ruột kích thích miễn dịch ở cơ thể vật chủ tạo ra một lượng lớn interleukin I và II Các enterotoxin có thể được xác định bằng các kỹ thuật miễn dịch [4] Trong các dạng

độc tố ruột do S aureus sinh ra thì các độc tố SEA, B, C và D là những độc tố

thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do độc tố của tụ cầu Ngoài ra SEB còn là một trong những nhóm độc tố do vi sinh vật sản sinh ra được liệt kê trong danh mục vũ khí sinh học dùng để tấn công khủng bố sinh học và chiến tranh sinh học [16]

Trang 21

- Cơ chế gây bệnh

Việc tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong quá trình phòng chống bệnh Bước quan trọng đầu tiên trong

quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính (adherence)

của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ Các bề mặt này bao gồm da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) và các tổ chức sâu hơn (tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô) Giống như các vi

khuẩn Gram dương khác là Streptococcus và Mycobacteria, S aureus bám dích vào

bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide Một khi đã bám dính vào

bề mặt tế bào vật chủ, tác nhân gây bệnh như S aureus mới có khả năng khởi động

các quá trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm nhập và

hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ S aureus sẽ tiếp tục tiến sâu vào trong cơ thể vật chủ để tiếp tục chu trình xâm nhập (invasion) S aureus xâm nhập

ngoại bào bằng cách tiết một số enzym như: hyaluronidase; hemolysine, leukocidin; exfoliatine v.v, phá hủy các thành phần cấu tạo tế bào vật chủ [44, 45]

Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn đường ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt, tạo điều kiện thuận lợi cho tụ cầu vàng tăng trưởng về số lượng Ngoài bệnh nguyên do là tụ cầu, một số trường

hợp có thêm vai trò của vi khuẩn Clostridium difficile [4] Ước tính khoảng 0,1 μg S aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở người Tuy nhiên, lượng này cũng có thể

thay đổi tùy thuộc độ nhạy cảm với tác nhân ở mỗi bệnh nhân [14, 41]

- Triệu chứng ngộ độc thức ăn do nhiễm tụ cầu vàng Staphylococcus aureus

Ngộ độc thức ăn do tụ cầu S aureus và độc tố của nó thường có các triệu

chứng cấp tính Thời gian ủ bệnh của tụ cầu vàng ngắn hơn (chỉ 1-6 giờ) thời gian ủ bệnh của nhóm vi khuẩn đường ruột gây ngộ độc thức ăn khác (trung bình 2-3 giờ) Bệnh nhân ngộ độc thức ăn do tụ cầu xuất hiện các triệu chứng nôn ói, đau quặn

Trang 22

bụng và tiêu chảy dữ dội, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước Triệu chứng tiêu chảy do tụ cầu cũng không kèm theo máu và ít mất nước hơn so với tả

và E coli Bệnh nhân không sốt hay phát ban, đây là đặc điểm để phân biệt giữa

ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng với các nhóm vi khuẩn khác; thần kinh người bệnh bình thường Phần lớn trường hợp bệnh tự khỏi và hồi phục trong vòng 8-24 giờ sau khởi phát nhưng trường hợp nặng có thể bị tụt huyết áp và gây tử vong Bệnh nhân ngoài ra có thể bị sốc do mất nhiều nước và chất điện giải Khác với ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn thông thường không gây sốt hoặc sốt nhẹ, bệnh nhân

mắc ngộ độc do độc tố SEB của S aureus sẽ bị sốt cao [3]

1.2.3 Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus

Hiện nay người ta cũng đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng tụ cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315, Mu50, RF122 v.v [7, 15, 19, 8, 23, 18] Ví dụ: Steven và cs đã thành công trong

việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S aureus COL Kết quả giải

trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gen plasmid Theo đó, trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít các cặp G-C, điều này gây ra mối quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới các tác nhân gây bệnh Gram dương khác [34]

Trong số các chủng S aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ giống

enterotoxigenic được ước tính khoảng 25% [10] Tại Pháp, trong số 61 chủng phân lập từ pho-mát và sữa tươi có 15,9% chủng là giống enterotoxigenic [30] Ở Pháp,

trong 332 chủng S aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa các gen seg, seh, sei và sej xuất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen sea và

1.3 Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B 1.3.1 Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B

SEB là 1 trong các nội độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn S aureus Thông

thường khi bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các hệ thống vận chuyển ion và nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin (độc tố ruột) [11]

Trang 23

Độc tố ruột SEB bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ

ngộ độc thực phẩm do S aureus [11] Độc tố ruột SEB được hình thành khi tụ cầu S aureus sống trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ môi trường gia tăng đột

ngột, thiếu oxy, sự mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu v.v [3]

Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn S aureus

nên SEB được nghiên cứu khá chi tiết Trình tự axit amin của SEB đã được xác

định từ năm 1970 [20] Giống như các cấu trúc protein ngoại bào khác của S.aureus

thường được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy hay trong thực phẩm bị ô nhiễm, protein SEB bao gồm một trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 axit amin ở đầu N’ Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhất định SEB dạng hoạt động trong môi trường ngoài tế bào gồm 239 amino axit trong 1 chuỗi polypeptit đơn, có khối lượng phân tử khoảng 28,336 KDa Ở dạng hoạt động protein SEB có cấu trúc gồm: 7 cấu trúc xoắn α, 14 phiến gấp nếp β và một cầu nối disulphit nối cystein ở vị trí 120 và 140 [46] Theo Gleason và cs (2009), protein SEB có 2 vùng cấu trúc đặc biệt phức tạp được đóng gói nhỏ gọn chặt chẽ nên cho phép SEB chống lại sự tác động của các proteases, gồm trypsin, chymotrypsin và papain có trong ruột [11]

Staphylococcal enterotoxin B có cấu trúc và đặc tính sinh học gần giống với

các độc tố ruột khác là A, C, D, E, F, G ,S, T cùng do vi khuẩn S aureus tạo ra Đặc

biệt, trình tự axit amin của SEB có mối tương đồng cao với trình tự axit amin độc tố ruột C1 cũng có 239 axit amin [13] SEB chỉ thiếu các vị trí bám của kẽm so với các siêu kháng nguyên staphylococcal enterotoxin A, C2 và D chỉ có một vị trí bám trên phân tử MHC nhóm II Phân tích chi tiết vị trí bám trên TCR của các kháng nguyên

SEA, SEB và SEC2 sẽ chỉ ra sự khác biệt dẫn tới hiệu quả bám lên vùng Vβ [11] Năm 1986, Christopher và cs đã xác định thành công trình tự gen seb của

chủng vi khuẩn S aureus S6 Theo đó, trình tự của 1 gen seb hoàn thiện được tính

từ codon mở đầu ATG ở vị trí nucleotide 244, sau đó là vùng khung đọc mở gồm

Trang 24

798 nucleotide, và kết thúc tại codon TGA tại vị trí nucleotide thứ 1042 [13] Đoạn

gen seb phân lập từ các chủng được phân lập từ nhiều vùng địa lý khác nhau đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết Trình tự gen seb của các chủng

khác nhau như PM36 (AB479118, ATCC14458, AY518386), COL (CP000046, AF410775) v.v đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) [26, 15, 40]

Cấu trúc tinh thể của protein SEB trình bày ở hình 1.4 được xác định ở độ phân giải 1,5 A là độ phân giải cao nhất cho đến nay dành cho 1 siêu kháng nguyên

1.3.2 Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B

Staphylococcal enterotoxin B (SEB) là trung gian kích thích các lympho T ở hệ miễn dịch của các vật chủ Các độc tố liên kết trực tiếp đến phức hợp protein (MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích, sau đó kích thích gia tăng số lượng lớn các lympho T SEB được coi là một "siêu kháng nguyên” của vi khuẩn vì có thể tạo thành một “cầu nối” giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện kháng nguyên và vùng Vβ của các thụ thể tế bào T như CD 4, CD 8; từ đó, kích thích hoạt hóa các tế

Hình 1.4 Mô phỏng cấu trúc 3 chiều của protein SEB

(Nguồn : http//www.pdb.org/pdb/explore.do?structureId=3SEB )

Trang 25

bào T biểu hiện các đoạn gen Vβ mà không cần thiết phải có một quá trình chế biến

và trình diện thông thường Điều này gây ra sự sản sinh một số lượng lớn của cytokine, interleukin 2 (IL-2), các yếu tố hoại tử khối u β (TNF-β), và các interferon Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnh nhân có các triệu chứng như chán ăn, buồn nôn, nôn, và tiêu chảy Các triệu chứng này xuất hiện là do các cytokine trong

các tế bào T của lông ruột được sinh ra ồ ạt [11]

SEB dễ dàng hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định SEB có khả năng chịu tác động cơ học ở mức vừa phải và có thể chịu được nhiệt độ sôi trong vài phút Nếu được bảo quản trong môi trường đông lạnh khô, SEB có thể được lưu trữ trong hơn một năm [11]

Hình 1.5 Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của các tế bào T

Siêu kháng nguyên bám trực tiếp vào phức hợp MHC lớp II của tế bào trình diện kháng nguyên bên ngoài vị trí bám thông thường của kháng nguyên 1/5 các tế bào T trong cơ thể bị kích thích

sản xuất cytokin một cách ồ ạt gây lên hiện tượng shock độc tính trong cơ thể (Nguồn: http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/staph.html)

Trang 26

1.3.3 Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng

Công nghệ sinh học hiện đại có khả năng tạo ra các protein tái tổ hợp ứng

dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có y sinh học Biểu hiện gen seb thành protein

tái tổ hợp không độc phục vụ nghiên cứu tạo vaccine cũng được quan tâm nghiên cứu từ khá sớm Năm 2002, Lee và cs đã nghiên cứu tạo vaccine tiềm năng phòng chống SEB dựa trên việc sử dụng hệ vector từ virus mang gen mã hóa SEB đột biến Chuột sau khi tiêm vaccine này có khả năng chống lại được 5 liều trung bình SEB [24] Tiếp đó, Woody và cs, (1997) đã nghiên cứu tạo được 2 loại protein SEB mang đột biến thay thế asparagine bằng lysine tại vị trí 23 (N23K) và phenylalanine bằng serine tại vị trí 44 (F44S) trên trình tự polypeptid SEB không độc Theo đó, khi thử nghiệm 10µg SEB N23K và F44S (tương đương liều 30 LD50) đã không gây chết chuột thử nghiệm Một điều thú vị là mặc dù protein SEB N23K và F44S thử nghiệm ở liều lượng thấp nhưng vẫn được phát hiện bởi phương pháp miễn dịch liên kết enzym ELISA nhờ kháng thể đa dòng kháng SEB Sử dụng SEB tái tổ hợp N23K, F44S sẽ thúc đấy phản ứng kháng SEB bảo vệ 80 - 87% chuột [39] Ngoài ra, Lowell và cs cũng đã nghiên cứu tạo được vaccine proteosome SEB có hiệu quả miễn dịch 100% cả trong cơ và trong thể dịch ở khỉ [25]

Swaminathan và cs (1992) đã nhận thấy những thay đổi nhỏ trên bề mặt phân tử SEB tại vị trí hoạt động rãnh 4α tạo ra các SEB không độc trong khi vẫn bảo thủ khả năng miễn dịch của phân tử [35] Năm 1994, Thibodeau đã phân tích cấu trúc tinh thể SEB đột biến và tìm ra vị trí hoạt động gây nên triệu chứng nôn mửa gồm 14 axit amin nằm trong vùng từ axit amin 113 – 126 (rãnh α4) 14 axit amin này nối vùng 1 và 2 của phân tử SEB và trong 14 axit amin có 11 axit amin là giống nhau với mọi SEs [36].Tại rãnh α4 có từ 3 tới 5 vị trí có histidine (H32, H121, và H166) rất quan trọng cho các tế bào T (TCR - T Cell Receptor) bám vào Năm 1982, Stelma và Bergdoll đã khá thành công trong nghiên cứu làm giảm độc tính của SEA và SEB bằng cách methyl hóa nhóm carboxyl ở các phân tử histidin trong cấu trúc protein SEB [33] Vì tyrosine có cấu trúc gần giống histidine nên thay thế histidine

Trang 27

tích điện dương bằng tyrosine ưa nước sẽ không làm thay đổi cấu trúc bề mặt phân tử, do đó có thể thay thế việc methyl hóa nhóm carbonxyl của histidine ở thí nghiệm trên Các phân tử SEA, SEB khi được methyl hóa nhóm carbonxyl của các histidine không những có thể làm giảm độc tính của các kháng nguyên mà còn bảo tồn được khả năng gây miễn dịch của chúng [33, 28] Dựa trên cơ sở đó, năm 2003, Korolev và cs đã nghiên cứu tạo 4 đột biến điểm thay thế các axit amin histidine bởi các tyrosine tại 4 vị trí có codon mã hóa cho histidine (codon 12; 32; 105 và 121) Tác giả Savransky và cs sau đó 1 năm (2004) cũng khẳng định SEB mang 4 đột biến thay thế histidine bằng tyrosine tại vị trí các codon 12; 32; 105 và 121 đã tạo ra một kháng nguyên tái tổ hợp không mang độc tố, và có khả năng kích ứng ở mức độ cao các kháng thể IgG đặc hiệu [22, 31, 32]

Trang 28

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi khuẩn và plasmid

Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng DH5α và BL21(DE3) được

sử dụng cho mục đích tách dòng và biểu hiện protein SEB, vector tách dòng GS45350 mang đoạn gen mã hóa cho protein SEB đã được gây đột biến và vector pET21a+ (Novagen) được sử dụng làm vector biểu hiện protein tái tổ hợp do Phòng

Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp

2.1.2 Các bộ kít

- Kít tinh sạch ADN (AccuPrep® Gel Purification Kit) (Bioneer, Hàn Quốc) - Kít tách chiết plasmid (Plasmid Extraction Kit) (Bioneer, Hàn Quốc)

2.1.3 Hóa chất, máy móc và thiết bị

- Hóa chất: Bacto pepton, yeast extract, NaCl, agarose, glucose, trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol 70%, các dung dịch đệm muối phosphate, nước khử ion Kháng sinh ampicillin và các loại hóa chất

thông dụng khác (ethidium bromide, v.v.), các loại enzym cắt giới hạn (EcoRI, HindIII), Taq ADN polymerase và Pfu turbo ADN polymerase được mua từ các

hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp

- Máy móc và thiết bị: Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi ADN (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học

Trang 29

2.1.4 Môi trường và đệm

Môi trường cho vi khuẩn và các loại đệm sử dụng trong nghiên cứu được chuẩn bị theo Sambrook và cs (1998) hoặc theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất

2.1.5 Cặp mồi sử dụng

Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này để tạo các điểm cắt của hai enzym giới

hạn là EcoRI và HindIII ở hai đầu đoạn gen mã hoá cho protein SEB (đã được gây

đột biến thay thế nucleotide nhằm mục đích loại bỏ tính độc của protein này): mSEB-F và mSEB-R

2.1.6 Phần mềm

Thiết kế mồi, và dữ liệu trình tự ADN được xử lý bằng phần mềm Lasergene version 7 của DNASTAR Inc., Mỹ; BLAST (Basic Local Alignment Search Tool;

Altschul et al., 1990); BioEdit version 7 (Tom Hall, Department of Microbiology ,

North Carolina State University, NC) và Primer3 Input Version 4 [42]

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ như mô tả tại hình 2.1

Trang 30

Hình 2.1 Sơ đồ các bước thí nghiệm

2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Nguyên lý:

Kỹ thuật tổng hợp ADN nhân tạo cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép ADN trong tế bào vi sinh vật như: Đoạn ADN cần được mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi xuôi, ngược, cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzym ADN polymerase Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (94oC) để biến tính chuỗi ADN sợi kép, kết hợp với enzym Taq ADN

Trang 31

polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động Kỹ thuật PCR nhân bản lượng lớn ADN chỉ với một lượng nhỏ ADN ban đầu

Tiến hành:

- Sau khi đo nồng độ ADN khuôn , tính và tạo các nồng độ ADN của các m ẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích ADN khuôn được giống nhau , và đạt khoảng 50ng trong tổng thể tích là 25µl/ 1 phản ứng

- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn ADN

- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như sau:

Phản ứng PCR được thực hiện với chu kì nhiệt như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

Nước khử ion vô trùng 16 Dung dịch đệm (10X) 2.5 dNTPs (10mM) 2 Primer mSEB-F (100ng/µl) 1,25 Primer mSEB-R (100ng/µl) 1,25

Taq ADN polymerase hoặc Pfu

Vector GS45350/SEB (50 ng/µl) 1 Tổng thể tích 25

Trang 32

Tiến hành:

Hòa tan tế bào vi khuẩn trong 25µl nước khử ion Sau đó sử dụng 5µl hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR Phản ứng PCR được thực hiện như mô tả tại mục 2.2.2.1

Trang 33

gồm: i) để tạo đầu cắt so le cho gen seb sau khi đã được nhân bản bằng phản ứng

PCR từ vector tách dòng GS45350; ii) để mở vòng vector biểu hiện pET21a+ để sử

dụng cho phản ứng kết nối với gen seb; iii) để kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E coli chủng BL21(DE3) sau

khi được chuyển vector này Về nguyên tắc thành phần phản ứng cắt enzym hạn chế không khác nhau, điểm khác nhau chỉ có là thể tích của các thành phần sẽ được điều chỉnh thích hợp với mỗi mục đích và ADN mẫu

1 1 7,5

15

Phản ứng tạo đầu cắt so le cho gen seb sau khi đã được nhân bản bằng phản

ứng PCR từ vector tách dòng GS45350 được thực hiện với các thành phần như sau:

12 5 1,5 1,5 30 50