Vector pET21a+ sau khi mở vòng và tinh sạch được ghép nối với gen seb nhờ xúc tác của T4 ADN ligase (mục 2.2.2.5). Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5, sau đó chọn lọc khuẩn lạc biến nạp trên môi trường có chứa kháng sinh chọn lọc ampicilline. Kết quả biến nạp được trình bày trên hình 3.7.
Hình 3.7.Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB vào tế bào khả biến E. coli DH5α
Kết quả thu được cho thấy trên đĩa thạch có nhiều khuẩn lạc phát triển, nhưng không biết khuẩn lạc nào mang vector tái tổ hợp. Bởi vì tế bào E.coli DH5α không có khả năng kháng kháng sinh ampicillin nên sau khi biến nạp và nuôi cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin 100mg/l sẽ có các trường hợp sau xảy ra:
+ Các tế bào không chứa vector tái tổ hợp sẽ không mọc được trên môi trường có chứa kháng sinh ampicillin.
+ Các tế bào chứa vector biểu hiện tự đóng vòng (do một trong 2 enzym cắt không hoàn toàn), có gen kháng kháng sinh nên vẫn tồn tại, và tạo khuẩn lạc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Các tế bào có chứa vector tái tổ hợp pET21a+/SEB mang gen mã hóa cho SEB có gen kháng kháng sinh nên mọc được trên môi trường chọn lọc.
Do đó, chúng tôi phải tiến hành chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp bằng phương pháp colony - PCR
3.2.3. Kết quả chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony - PCR
Để kiểm tra khuẩn lạc của dòng tế bào nào mang vector tái tổ hợp pET21a+/SEB, chúng tôi tiến hành PCR trực tiếp từ các dòng khuẩn lạc khác nhau (colony-PCR) với cặp mồi của vector: T7-promoter và T7-terminater. Các bước tiến hành, thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt như mô tả ở mục 2.2.2.2. Kết quả sau khi tiến hành colony-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và thể hiện trên hình 3.8.
Hình 3.8. Kết quả điện di colony-PCR để chọn dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB. M: Thang ADN chuẩn 1kb; 1-20: Sản phẩm colony-PCR của các dòng
khuẩn lạc khác nhau; (-): Đối chứng âm
Dựa vào kết quả trên hình 3.8 cho thấy có 17 dòng khuẩn lạc đã xuất hiện một băng ADN có kích thước khoảng trên 1kb phù hợp với kích thước gen seb như đã
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tính toán lý thuyết. Các giếng 9, 12, 14 còn lại cũng xuất hiện 1 băng với kích thước khoảng 250 bp phù hợp với kích thước đoạn gen giữa 2 mồi vector. Điều này chứng tỏ các khuẩn lạc số 9, 12, 14 chỉ có vector pET21a+ tự đóng vòng mà thôi.
3.2.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế
Để kết quả chắc chắn hơn, chúng tôi quyết định nuôi lỏng khuẩn lạc các dòng số 1, 2, 3, 4, 5 để tách và kiểm tra plasmid của chúng. Các plasmid sau khi tách được xử lý bằng 2 enzym hạn chế E.coRI và HindIII. Theo tính toán trong ảnh điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp pET21a+/SEB phải có hai băng ở hai vị trí tương ứng kích thước của gen seb (khoảng 800bp) và kích thước của vector pET21a+ (khoảng 5400 bp). Kết quả xử lý enzym trên plasmid các dòng đã được kiểm tra trên gel 1% và thể hiện trên hình 3.9.
Hình 3.9. Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21a+/SEB của các dòng khuẩn lạc. M: Thang ADN chuẩn 1kb; 1, 3, 5, 7, 9: Plasmid tách từ các dòng khuẩn lạc 1, 2, 3, 4, 5; 2, 4, 6, 8,
10: Sản phẩm cắt plasmid của các dòng 1, 2, 3, 4, 5.
Dựa vào kết quả trên hình 3.9 cho thấy ở các giếng 2, 4, 6, 8, 10 sản phẩm cắt phân thành hai băng tương ứng với kích thước của vector pET21a+ khoảng 5400 bp và kích thước của đoạn gen seb khoảng 800 bp như đã tính toán trước đó. Plasmid thu từ khuẩn lạc dòng số 1 được chọn để giải trình tự gen.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1000bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.5. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện
Kết quả đọc trình tự mẫu ADN pET21a+/SEB tách chiết từ các vi khuẩn dòng số 1 bằng kít tách plasmid của Bioneer thể hiện trên hình 3.10 dưới đây.
Hình 3.10. So sánh trình tự nucleotide của wtseb và mtseb bằng phần mềm Bioedit
Theo hình 3.10 chúng tôi đã tạo được các đột biến thay thế nucleotide C bằng T ở các bộ ba mã hóa cho histydine và tyrosine như theo lý thuyết. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến theo nguyên lý của phương pháp dideoxy được cải tiến dựa vào các thiết bị tự động cho kết quả đẹp. Như vậy, chúng tôi kết luận đã thiết kế thành công vector biểu hiện pET21a+/SEB mang gen đột biến theo đúng mục đích. Plasmid thu từ khuẩn lạc dòng số 1 sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET 21a+/SEB vào Escherichia coli chủng BL21(DE3)
E. coli BL21(DE3) là chủng vi khuẩn biểu hiện gen thường được sử dụng khi biểu hiện 1 protein lạ và là vật chủ phù hợp cho biểu hiện protein khi dùng vector biểu hiện có chứa promoter T7 hoặc lac promoter T7 như vector pET21a+. Hơn nữa chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) đã được biến đổi để tăng cường khả năng biểu hiện protein ngoại lai. Bởi vậy, đây là chủng phù hợp với đối tượng và mục đích nghiên cứu của đề tài.
Sau khi chọn dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen seb, chúng tôi tiến hành biến nạp sản phẩm tái tổ hợp thu được từ dòng đó vào tế bào khả biến E. coli chủng BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt. Dịch khuẩn được nuôi cấy trải trên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh ampicilline 100 mg/l.
Tế bào E.coli BL21(DE3) không có khả năng kháng kháng sinh ampicillin nên sau khi biến nạp và nuôi cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin 100mg/l sẽ có các trường hợp sau xảy ra:
+ Các tế bào không chứa vector tái tổ hợp sẽ không mọc được trên môi trường có chứa kháng sinh ampicillin.
+ Các tế bào có chứa vector tái tổ hợp pET21a+/SEB mang gen mã hóa cho SEB và có gen kháng kháng sinh nên mọc được trên môi trường chọn lọc.
Để chắc chắn hơn nữa về sự có mặt của plasmid tái tổ hợp trong các dòng khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 8 dòng khuẩn lạc và tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc này với cặp mồi đặc hiệu mSEB - F và mSEB - R. Sản phẩm colony-PCR được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra và kết quả được thể hiện trên hình 3.11.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.11. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F và R. M: thang ADN chuẩn 1 kb; 1 – 8: Sản phẩm PCR từ plasmid của các dòng khuẩn lạc BL21(DE3) từ 1 tới 8; (-): Đối chứng (-); 9: Đối chứng (+) là sản phẩm PCR cùng cặp mồi đặc hiệu và khuôn mẫu là plasmid pET21a+/SEB tách từ dòng số 1 DH5α.
Kết quả thu được trên hình 3.11 cho thấy ở tất cả các giếng kiểm tra (trừ giếng đối chứng âm) đều xuất hiện một băng duy nhất trên đường chạy với kích thước khoảng 800 bp tương ứng với kích thước của gen seb. Như vậy, chúng tôi đã biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB vào chủng E. coli BL21(DE3).Từ kết quả này, chúng tôi quyết định lựa chọn ngẫu nhiên dòng khuẩn lạc số 1 để kiểm tra khả năng biểu hiện của gen seb tái tổ hợp.
3.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen seb
Gen seb trong vector biểu hiện hoạt động dưới sự điều khiển của T7 lac promoter và được kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D- thiogalactoside) có trong môi trường. Do đó, để nghiên cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành công được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có kháng sinh ampicillin và chất cảm ứng IPTG.
Trước khi thực hiện cảm ứng biểu hiện bằng IPTG, các tế bào vi khuẩn E.coli
BL21(DE3) chứa plasmid tái tổ hợp cần phải được hoạt hoá bằng cách nuôi lắc ở nhiệt độ 37oC trong môi trường LB chứa kháng sinh ampicillin 100mg/l cho đến khi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
các tế bào bước vào pha sinh trưởng (OD600 nằm trong khoảng 0,4 đến 0,6). Sau 3 giờ cảm ứng IPTG 1mM ở nhiệt độ 37oC, tiến hành ly tâm 8000 vòng trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. Đối với mẫu đối chứng âm, các tế bào E.coli BL21(DE3) chứa plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB và tế bào E.coli BL21(DE3) không chứa plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB cũng được hoạt hóa trên môi trường chứa kháng sinh ampicillin 100mg/l ở nhiệt độ 37oC cho đến mật độ tế bào thích hợp. Sau đó các tế bào này cũng được biểu hiện ở nhiệt độ 37oC nhưng không bổ sung IPTG ( với đối chứng (-) có vector biểu hiện), và bổ sung 1mM IPTG (với đối chứng (-) không có vector biểu hiện) trước khi thu sinh khối tế bào như trên. Sau đó, chúng tôi tiến hành pha loãng sinh khối tế bào bằng dung dịch đệm PBS 1X và Tween 20 (0,05%), phá vỡ tế bào bằng cách siêu âm khô, thu protein tổng số và chạy điện di protein trên gel polyacrylamide như mục 2.2.2.9 để kiểm tra sự biểu hiện.
Kết quả kiểm tra protein tổng số của các dòng tế bào mang plasmid pET21a+/SEB tái tổ hợp được trình bày ở hình 3.12.
Hình 3.12. Điện di so sánh protein tổng số của các tế bào E.coli BL21(DE3) mang gen seb tái tổ hợp. M: Thang protein chuẩn (Prestained protein molecular weight marker - Fermentas); 1: Đối chứng âm (protein tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc BL21(DE3); 2: Protein tổng số trong dịch chết BL21(DE3)/pET21a+/SEB được cảm ứng IPTG; 3: Protein cặn của dòng khuẩn lạc BL21(DE3)/pET21a+/SEB được cảm ứng IPTG; 4: Đối chứng âm (protein tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc BL21(DE3)/pET21a+/SEB nhưng không được cảm ứng IPTG.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ kết quả trên hình 3.12 cho thấy ở các giếng 2 và 3 vi khuẩn BL21(DE3) mang vector biểu hiện pET21a+/SEB có cảm ứng IPTG xuất hiện một băng protein lạ so với 2 đối chứng âm và có kích thước khoảng 28 kDa tương ứng với kích thước protein SEB theo tính toán lí thuyết. Kết quả này được giải thích là khi có mặt chất cảm ứng IPTG thì lac repressor thay đổi cấu hình và không thể gắn vào lac
operator. Sự loại bỏ lac repressor ra khỏi operator cho phép ARN polymerase bám vào lac promoter và khởi động quá trình phiên mã. Dòng vi khuẩn đối chứng (-) còn lại do không mang vector có gen seb tái tổ hợp nên dù được cảm ứng IPTG giống như với các dòng vi khuẩn mang vector có cảm ứng IPTG cũng không biểu hiện được băng có kích thước như vậy. Năm 2003, Korolev cùng các cs cũng tạo thành công protein SEB không mang đoạn tín hiệu nhưng vẫn hiện diện trong vùng chu chất của tế bào. Trong thí nghiệm đó Korolev và cs, đã sử dụng vector biểu hiện pET22b+ có mang trình tự tín hiệu signal peptide có tác dụng dẫn protein ngoại lai ra vùng khoang chu chất của tế bào biểu hiện [22]. Trong nghiên cứu này, vector pET21a+ không mang trình tự tín hiệu và gen seb tái tổ hợp được thiết kế cũng không có trình tự mã hóa cho đoạn polypeptide đặc biệt này. Do đó, để thu được protein SEB ngoại lai ở dạng tan phù hợp mục tiêu thử hoạt tính kháng nguyên sau này, chúng tôi tiến hành tối ưu các điều kiện biểu hiện gen.
3.3.3. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện gen seb
Sự tổng hợp protein phụ thuộc rất nhiều yếu tố cho nên việc xác định được điều kiện tối ưu cho tổng hợp protein quan tâm là điều quan trọng. Để xác định được điều kiện tối ưu đó chúng tôi tiến hành thử biểu hiện gen ở các điều kiện nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng khác nhau.
Kết quả tối ưu nhiệt độ cảm ứng
Thông thường, nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn E. coli là ở 37oC. Tuy nhiên, đối với protein tái tổ hợp thường bị ức chế bởi các protein vật chủ, hoặc bị phân hủy bởi nhiệt độ cao hoặc gây độc với tế bào vật chủ .v.v thì nhiệt độ này trong nhiều trường hợp là không phù hợp. Về mặt lý thuyết, điều này được
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
giải thích là khi sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu protein tái tổ hợp do được điều khiển bởi promoter mạnh như T7 promoter sẽ được tổng hợp ồ ạt một lượng rất lớn trong một thời gian ngắn. Trong khi đó, các protein chức năng khác tham gia vào quá trình tạo cấu trúc protein bậc cao hơn lại không được tổng hợp với tốc độ tương ứng, do đó ảnh hưởng đến cấu trúc thứ cấp của protein tái tổ hợp và thông thường làm cho protein được tổng hợp dưới dạng không tan, có hoạt tính thấp hoặc thậm chí mất hoạt tính. Thêm vào đó 37oC là nhiệt độ tối thích cho các protease nội bào hoạt động, do đó các protein ngoại lai sẽ bị phân cắt sau khi tổng hợp, ảnh hưởng đến hiệu suất biểu hiện và chất lượng protein [1].
Để thu protein SEB với lượng lớn có hoạt tính mà không lẫn quá nhiều protein của bản thân E.coli, tăng hiệu quả quá trình tinh sạch protein sau này, chúng tôi quyết định tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein SEB tái tổ hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 28oC và 37oC với cùng nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM và thời gian cảm ứng 3 giờ. Sau 3 giờ nuôi cảm ứng tế bào được thu lại để kiểm tra mức độ biểu hiện và tính chất của protein tái tổ hợp. Dịch chiết và phần cặn tế bào được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12%. Kết quả trình bày trên hình 3.13.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.13. Điện di so sánh khả năng biểu hiện protein SEB ở các nhiệt độ khác nhau. M: Thang protein chuẩn; 2: Không cảm ứng ở 37oC; 3: Cảm ứng ở 37oC, dịch; 4: Cảm ứng biểu hiện ở 37o
C, cặn; 5: Cảm ứng ở 28oC C, cặn; 6: Cảm ứng ở 28oC C, dịch; 7: Không cảm ứng ở 28oC.
Kết quả thu được trên hình 3.13 cho thấy ở đường chạy của giếng số 5 xuất hiện băng protein SEB đậm hơn hẳn băng protein ở giếng số 2. Chứng tỏ protein SEB tái tổ hợp trong điều kiện 28oC tan tốt hơn so với điều kiện nhiệt độ 37oC. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ cảm ứng là 28oC cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng trên gen seb
Protein ngoại lai được điều khiển tổng hợp bởi promoter T7 trên vector pET21a+. Promoter này được cảm ứng bởi sự có mặt của IPTG trong môi trường nuôi cấy. Nồng độ chất này ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện protein ngoại lai của tế bào. Ở nồng độ quá cao nó gây độc cho tế bào, trong khi ở nồng độ quá thấp protein ngoại lai thường được tổng hợp kém [1]. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng biểu hiện protein SEB tái tổ hợp ở các nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau từ 0,4 - 1 mM (0,4 mM; 0,6 mM; 0,8 mM và 1 mM) ở 28oC và thu mẫu sau 3 giờ cảm ứng. Kết quả thí nghiệm được thể hiện tổng quát qua hình 3.14. Theo đó, lượng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
protein SEB tái tổ hợp được tổng hợp nhiều nhất tương ứng với nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM cho