Nguyên lý:
T4 ligase xúc tác tạo liên kết phosphatdieste bằng cách liên kết đầu 5’ phosphat trong phân tử ADN hoặc ARN này với đầu 3’ hydroxyl của phân tử ADN hoặc ARN kia do vậy mà có thể nối 2 sợi ADN hoặc ARN khác nhau. Vector biểu hiện tái tổ hợp được thiết kế bằng cách ghép đoạn gen seb và plasmid pET21a+ sau khi đã xử lý bởi hai enzym giới hạn là EcoRI và HindIII.
Tiến hành:
- Tính nồng độ vector và nồng độ mẫu ADN trong trường hợp nối đầu so le (tỉ lệ về số mol giữa vector : đoạn seb chèn là 1:4)
- Tính các thành phần còn lại cho 1 phản ứng và mix phản ứng.
Phản ứng kết nối đoạn ADN vừa tinh sạch vào vector tách dòng được thực hiện trong hỗn hợp sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nước khử ion Đệm T4 ligase (10X) Gen seb (100ng) Plasmid pET21+ (20ng) Enzym T4 ligase (1u/1µl) Tổng thể tích 2 2 12 2 2 20
Phản ứng kết nối được thực hiện trong 2 giờ ở nhiệt độ 22oC. Sau khi kết thúc, hỗn hợp được dùng để biến nạp hoặc lưu giữ ở tủ -20oC.
2.2.2.6. Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α
Nguyên lý:
Biến nạp là quá trình chuyển ADN trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có khả năng tiếp nhận ADN được gọi là tế bào khả biến. Quá trình này gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.
Tiến hành:
- Bổ sung 1µl ADN plasmid vào ống tế bào khả biến (50 - 100µl). - Để ổn định trong đá trong vòng 15 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút.
- Bổ sung 400µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 220 v/p trong vòng 1giờ, 37oC.
- Cấy trải 100 - 150µl trên môi trường thạch LB chứa ampicillin. - Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm.