Nguyên lý:
Phương pháp này được áp dụng để tinh sạch đoạn ADN quan tâm từ bản điện di trên gel agarose. Trong trường hợp này, đoạn gen seb sau khi được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector GS45350 sẽ được tinh sạch để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu. Trong phương pháp này phân tử ADN quan tâm sẽ được giữ lại trên cột tinh sạch có bản chất là các hạt sepharose, sau đó sử dụng đệm để thu lại các phân tử ADN này. Thông qua phương pháp này mẫu ADN sẽ đủ tinh sạch để tiến hành các phản ứng khác như xử lý enzym hạn chế hay kết nối với vector.
Tiến hành:
- Cắt vùng gel chứa đoạn ADN quan tâm trên bản điện di.
- Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước 1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1 µl thể tích.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Bổ sung dịch kết gắn ADN vào cột tinh sạch GB (Gel Binding), theo tỉ lệ: Vmẫu:VGB = 1:3.
- Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút và cứ 2 phút thì đảo nhẹ 1 lần cho đến khi gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết ADN và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Tiếp tục bổ sung đệm rửa 500µl WB (Washing Buffer), ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút để loại đệm WB.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới 1,5ml. Bổ sung 30-50µl nước khử ion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút để thu mẫu ADN.