Khi thiết kế mồi, chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzym cắt hạn chế EcoRI và HindIII vào hai đầu đoạn gen seb. Do đó, chúng tôi sử dụng chính hai enzym này để tạo đầu cắt so le phù hợp cho đoạn gen thu được sau khi tinh sạch sản phẩm của phản ứng. Thành phần phản ứng cắt seb bằng hai enzym
EcoRI và HindIII như mục 2.2.2.3.
Sản phẩm PCR sau khi được xử bằng hai enzym được tinh sạch theo quy trình của bộ kít “AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer)”. Do trong sản phẩm cắt vẫn có những tạp chất tham gia phản ứng còn dư thừa; vì vậy, để tăng hiệu quả kết nối
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
gen vào vector cần thiết phải tinh sạch sản phẩm c ắt. Tinh sạch ADN là phương pháp thu đoạn ADN tinh khiết dựa trên nguyên lý sử dụng các hạt sepharose để giữ các phân tử ADN đã được gắn với các hạt ion lúc mix sản phẩm cắt trong đệm gắn. Do đó khi chuyển hỗn hợp ADN, enzym, muối chứa trong các đệm .v.v , lên cột phân tách, chỉ có ADN được gắn lên mạng lưới, còn các thành phần khác như protein, muối sẽ bị rửa trôi qua cột. Sau đó, để tách ADN ra khỏi cột người ta sử dụng đệm tách (hoặc nước deion khử trùng để hòa tan ADN). Sau khi tinh sạch tiến hành kiểm tra một lần nữa bằng cách lấy khoảng 5 µl ADN của mẫu đã được tinh sạch ở trên điện di trên gel agarose 1%. Kết quả kiểm tra sản phẩm tinh sạch được thể hiện trong hình 3.4.
Hình 3.4. Điện di sản phẩm seb sau tinh sạch. Giếng M: thang ADN chuẩn: 1 kb; Giếng 1: seb
Trên bảng điện di chỉ xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước trong khoảng 750 đến 1000bp, chứng tỏ quy trình tinh sạch ADN đã thành công, đây sẽ là nguyên liệu sử dụng để tạo vector biểu hiện.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn