Nguyên lý:
Enzym hạn chế là các nuclease nội bào (endonuclease) có khả năng nhận biết và cắt các đoạn ADN tại các vị trí với trình tự nucleotide nhất định. Trong nghiên cứu này hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII được sử dụng với các mục đích bao Bước Phản ứng Nhiệt độ (o
C) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94 3 phút 2 Biến tính 94 30 giây 3 Gắn mồi 55 30 giây 30 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 45 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
gồm: i) để tạo đầu cắt so le cho gen seb sau khi đã được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng GS45350; ii) để mở vòng vector biểu hiện pET21a+ để sử dụng cho phản ứng kết nối với gen seb; iii) để kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) sau khi được chuyển vector này. Về nguyên tắc thành phần phản ứng cắt enzym hạn chế không khác nhau, điểm khác nhau chỉ có là thể tích của các thành phần sẽ được điều chỉnh thích hợp với mỗi mục đích và ADN mẫu.
Tiến hành:
Phản ứng cắt mở vòng vector pET21a+ được thực hiện với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng Đệm R (10X)
Enzym EcoRI (10u/µl) Enzym HindIII (10u/µl) Plasmid pET 21a+ Tổng thể tích 4 1,5 1 1 7,5 15
Phản ứng tạo đầu cắt so le cho gen seb sau khi đã được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng GS45350 được thực hiện với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng Đệm R (10X)
Enzym EcoRI (10u/µl) Enzym HindIII (10u/µl) Sản phẩm PCR Tổng thể tích 12 5 1,5 1,5 30 50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) thực hiện với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng Đệm R (10X)
Enzym EcoRI (10u/µl) Enzym HindIII (10u/µl) Vector pET 21a+/SEB Tổng thể tích 2 1 1 1 5 10
Thành phần phản ứng được trộn đều và tiến hành trong 2 giờ ở nhiệt độ 37oC, sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.