Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa việt nam. cơ sở phân tử của tính chống chịu thực vật.Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa việt nam. cơ sở phân tử của tính chống chịu thực vật.Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa việt nam. cơ sở phân tử của tính chống chịu thực vật.
Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn lúa Việt Nam Lê Thị Thu Trang Trường Đại học Khoa hoc Tự nhiên; Khoa Sinh học Chuyên ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70 Người hướng dẫn: TS Lã Tuấn Nghĩa Năm bảo vệ: 2011 Đặt vấn đề Năng suất lúa thấp nguyên nhân mặn bất lợi đất tồn vùng ven biển Việt Nam Hơn thiếu khoáng chất độc tố muối đất ảnh hưởng lớn đến lúa, trồng chủ đạo nên nông nghiệp nước ta (Hoàng Ngọc Giao, 2006; Nguyễn Tuấn Hinh cs, 2006) Bên cạnh đó, tượng xâm thực nước biển vào nước tưới đất trồng lúa làm cho diện tích ngập mặn lên tới 200.000 (Nguyễn Ngọc Anh, 2005) Mặt khác tập quán nhu cầu mở rộng canh tác đổi ngành nghề nuôi trồng thuỷ sản vơ tình làm tăng thêm diện tích ngập mặn tăng thêm diện tích ngập mặn độ mặn tăng lên từ khoảng 0,3- 0,4% chí có nơi cao chục lần Nơng dân thường chờ mưa để trồng lúa Tuy nhiên lượng mưa thất thường, lúa bị mặn gây hại giai đoạn mạ, giai đoạn trỗ đến chín Từ trước đến nay, cơng tác chọn tạo giống lúa nước ta có nhiều thành quả, song phương pháp chọn tạo chủ yếu truyền thống thông qua lai tạo đột biến thực nghiệm nên nhiều hạn chế ảnh hưởng không nhỏ đến kết chọn tạo Với phát triển công nghệ sinh học, nhiều vấn đề tồn trước cơng tác chọn giống truyền thống giải Trong đó, ứng dụng thị phân tử RAPD, SSR, RFLP, AFLP nghiên cứu phát triển trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa dạng di truyền xác định khác biệt mặt di truyền quần thể giống khởi đầu, từ xác định cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp cho ưu lai cao Việc tiếp cận mức độ phân tử cho phép đánh giá giống bố mẹ cách xác, khơng bị tác động điều kiện ngoại cảnh, rút ngắn thời gian nâng cao hiệu công tác lai tạo Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn lúa Việt Nam” với mục tiêu xây dựng sở liệu ADN tính chịu mặn giống/dòng lúa nghiên cứu nhằm góp phần quan trọng cho việc khai thác nguồn gen chịu mặn định hướng cho chọn tạo giống lúa chịu mặn Việt Nam Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu - Bộ giống lúa gồm 40 mẫu giống/dòng lúa thu thập từ ven biển phía Bắc, miền Trung Việt Nam lưu giữ Ngân hàng gen trồng Quốc Gia số giống từ Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) Bảng Danh sách 40 giống lúa nghiên cứu stt Tên giống Nguồn gốc stt Tên giống Nguồn gốc Ỏn Nam Định 21 Mành gié Quảng Bình Nếp cúc Ninh Bình 22 IR28 IRRI Hom râu Thái Bình 23 Hom râu Thái Bình Bầu Hải Phòng Hải Phòng 24 CM6 Viện di truyền NN Nước mặn Huế 25 Q5 Trung Quốc Háu trắng Huế 26 P4 Viện CLT-CTP Lúa ven dạng Quảng Bình 27 P6 Viện CLT-CTP Tẻ chăm Quảng Bình 28 AC5 Viện CLT-CTP Quảng Trắng Quảng Trị 29 Nghi hương 10 Ven đỏ Quảng Trị 30 Tám dự 11 Nước mặn dạng Quảng Trị 31 Khang dân 18 Trung Quốc 12 Chành trụi Thanh Hóa 32 Lúa su dạng Quảng Bình 13 Lúa đỏ Huế 33 Cườm dạng Nam Định 14 Lúa chăm Nam Hà 34 Lúa chăm biển Ninh Bình 15 Pokkali IRRI 35 Ngoi tía Nam Định 16 Cườm dạng Nam Định 36 Ré trắng Hải Phòng 17 Chiêm rong Nam Định 37 IR325 IRRI 18 Tám thơm NamĐịnh 38 Chiêm cũ Quảng Bình 19 Lúa ngoi Thanh Hóa 39 Tẻ tép Nam Định 20 Nếp quắn Hải Phòng 40 Nếp chẩn Nghệ An - Sử dụng 20 cặp mồi SSR để nhận dạng phân tích đa dạng di truyền mẫu lúa Bảng 2: Danh sách cặp mồi SSR sử dụng nghiên cứu stt Locus RM5926 Trình tự (f): ATATACTGTAGGTCCATCCA-5’ (r): AGATAGTATAGCGTAGCAGC-3’ Tm(⁰C) 55 KTSP(bp) 176 RM1233 RM527 RM5963 RM140 RM493 RM3412 RM1074 RM237 10 RM201 11 RM214 12 RM231 13 RM206 14 RM223 15 RM202 16 RM339 17 RM518 18 RM261 19 RM208 20 RM235 (f): GTGTAAATCATGGGCACGTG-5’ (r): AGATTGGCTCCTGAAGAAGG-3’ (f): GGCTCGATCTAGAAAATCCG-5’ (r): TTGCACAGGTTGCGATAGAG-3’ (f): CGAAAAGTGGGAAGCAAATG-5’ (r): GCGTACCCCTAGTGGCTGTA-3’ (f): TGCCTCTTCCCTGGCTCCCCTG-5’ (r):GGCATGCCGAATGAAATGCATG-3’ (f): TAGCTCCAACAGGATCGACC-5’ (r): GTACGTAAACGCGGAAGGTG-3’ (f): AAAGCAGGTTTTCCTCCTCC-5’ (r): CCCATGTGCAATGTGTCTTC-3’ (f):TGACGAATTGACACACCGAGTACG-5’ (r): ACTTCACCGTCGGCAACATGG-3’ (f): CAAATCCCGACTGCTCC-5’ (r): TGGGAAGAGAGCACTACAGC-3’ (f): CTCGTTTATTACCTACAGTACC-5’ (r): CTACCTCCTTTCTAGACCGATA-3’ (f): CTGATGATAGAAACCTCTTCTC-5’ (r): AAGAACAGCTGACTTCACAA-3’ (f): CCAGATTATTTCCTGAGGTC-5’ (r): CACTTGCATAGTTCTGCATTG-3’ (f): CCCATGCGTTTAACTATTCT-5’ (r): CGTTCCATCGATCCGTATGG-3’ (f): GAGTGAGCTTGGGCTGAAAC-5’ (r): GAAGGCAAGTCTTGGCACTG-3’ (f): CAGATTGGAGATGAAGTCCTCC-5’ (r): CCAGCAAGCATGTCAATGTA-3’ (f): GTAATCGATGCTGTGGGAAG-5’ (r): GAGTCATGTGATAGCCGATATG-3’ (f): CTCTTCACTCACTCACCATGG-5’ (r): ATCCATCTGGAGCAAGCAAC-3’ (f): CTACTTCTCCCCTTGTGTCG-5’ (r): TGTACCATCGCCAAATCTCC-3’ (f):TCTGCAAGCCTTGTCTGATG-5’ (r):TAAGTCGATCATTGTGTGGACC-3’ (f): AGAAGCTAGGGCTAACGAAC-5’ (r):TCACCTGGTCAGCCTCTTTC-3’ 55 161 55 233 55 196 55 261 55 211 55 211 55 188 55 130 55 158 55 112 55 182 55 147 55 165 55 189 55 148 55 171 55 125 55 173 55 124 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Đánh giá khả chịu mặn giống/dòng lúa điều kiện phòng thí nghiệm 2.2.2 Đánh giá khả chịu mặn giống/dòng lúa điều kiện nhà lưới 2.2.3 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lúa Tách chiết ADN lúa dung dịch đệm chứa CTAB dựa quy trình chuẩn Saghai Maroof (1994) 2.2.4 Nhận dạng di truyền giống/dòng lúa thị SSR 40 giống/dòng lúa nhận dạng di truyền 20 thị SSR Phản ứng PCR chuẩn bị bao gồm thành phần: 2µl Buffer 10X; 1,2µl MgCl2 (25mM); 1µl dNTP(2,5mM); 0,1µl Taq DNA polymerase (5U); 1µl primer forward (20pmol/µl), µl primer reverse (20pmol/µl)), 2µl ADN khn (20ng/µl) tổng thể tích phản ứng 20µl Chu kỳ nhân gen thiết kế sau: 94ºC phút; (94ºC phút, 56ºC 45 giây, 72ºC phút) lặp lại 35 lần; 72ºC phút; 4ºC 30 phút Sản phẩm PCR điện di gel polyacrylamid 12%, môi trường đệm TAE 1X, 70V 20 phút Sau điện di, gel nhuộm dung dịch Ethidium bromide soi chụp ảnh máy soi UV Transiluminator 1.2.5 Phân tích số liệu Phân tích thống kê số tiêu sinh trưởng tiến hành đánh giá mặn mẫu giống/dòng lúa phần mềm IRRISTAR 5.0 Dữ liệu kiểu gen xử lý, phân tích phần mềm NTSYS pc 2.11X (Applied Biosatistics); số đánh giá đa dạng di truyền, tần số alen quần thể xử lý phần mềm POPGENEv1.32 Kết thảo luận 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số Kết tách chiết ADN phương pháp CTAB cải tiến thu AND nguyên vẹn, độ tinh cao có nồng độ lớn, từ 150- 300ng/µl, đảm bảo đủ điều kiện để tiến hành thí nghiệm tiếp theo( hình 1) Hình Kết tách chiết DNA tổng số lúa Số TT: 1đến 40: giống/dòng lúa theo danh sách mẫu (phụ lục 1) 3.2 Kết phản ứng PCR phân tích đa hình gel polyacrylamide Sản phẩm PCR-SSR điện di gel polyacrylamide 8% để phân tích mối tương quan di truyền liên quan đến tính chịu mặn giống/dòng lúa nghiên cứu Tổng số thu 800 mẫu phản ứng PCR (tổ hợp PCR) Hình Kết nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa thị SSR- RM339 M: ADN 50bp ladder Số 1-40: thứ tự mẫu giống/dòng lúa (phụ lục 1) Hình 3: Kết nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa thị SSR- RM261 M: ADN 50bp ladder Số 1-40: thứ tự mẫu giống/dòng lúa (phụ lục 1) Thống kê 20 locut SSR, sản phẩm PCR băng có kích thước nằm khoảng từ 110-300bp, kích thước phổ biến alen thu giống lúa nghiên cứu biến thiên khoảng 120- 250bp Hình 4: Biến động kích thước alen locut SSR khảo sát Thống kê kết nhân gen 40 giống/dòng lúa 20 thị SSR thể hình Tổng số alen phát 20 locut 144 Số alen đa hình locut biến động từ đến 11, đạt trung bình 7,2 alen/locut Số lượng alen nhiều 11 (RM235), đạt 10 alen (RM140, RM201, RM493, RM1233) alen 9(RM202) Locut cho đa hình (3alen) RM5963 Bằng phần mềm POPGENE 3.1, tần số alen locut tính tốn dựa số liệu nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa sở để xác định số đa dạng di truyền Trong số 20 thị SSR, có 12 thị cho nhận dạng đặc biệt (unique allele) Các băng kích thước nằm khoảng 100-250bp Tần số allen phổ biến dao động từ 15.79 % đến 85%, trung bình 40.07% (bảng 2) Hệ số đa dạng di truyền PIC (Polymorphism Information Content) coi thước đo tính đa hình alen locut SSR Số liệu bảng cho thấy giống/dòng lúa nghiên cứu đa dạng thành phần alen locut nghiên cứu Hệ số PIC thu locut SSR biến động từ 0,265 (locut RM5926) đến 0.889 (locut RM235) với giá trị trung bình 0.713, cho thấy mức độ đa dạng gen tồn 40 mẫu lúa nghiên cứu mức cao Hình 5: Kết phản ứng PCR 40 giống/dòng lúa với 20 cặp mồi SSR (ơ đen- có alen ghi nhận; trắng – khơng có alen ghi nhận) Bảng 3: Đa hình locut SSR giống lúa nghiên cứu 3.3 Quan hệ di truyền liên quan đến tính chịu mặn giống/dòng lúa Quan hệ di truyền 40giống/dòng lúa với 20 locut tương ứng với mồi SSR phân tích UPGMA phần mềm NTSYS pc 2.11X Sơ đồ hình giống nghiên cứu cho thấy hệ số tương đồng di truyền nhóm biến động từ 0,68 đến 0,91 (theo phương pháp SM, NTSYS) Tại giá trị tương đồng 0,825; 40 giống/dòng lúa chia thành 10 nhóm lớn với khả chịu mặn khác nhau: Nhóm I: Mức độ tương đồng di truyền thấp 0,836; gồm giống/dòng lúa Ỏn, Nếp cúc, Hom râu 1có khả chịu mặn tốt dung dịch Yoshida có NaCl với nồng độ 0.8% (EC= 16dS/m) đất có NaCl với nồng độ 0.6% (EC=12dS/m) Nhóm II: Mức độ tương đồng di truyền thấp 0,826; gồm giống/dòng lúa Bầu Hải Phòng, Háu trắng, Lúa đỏ, Nước mặn, Lúa chăm Nhóm giống/dòng lúa địa phương, có giống/dòng lúa Lúa đỏ, Nước mặn, Lúa chăm có nguồn gốc Thừa Thiên Huế Đặc biệt có giống Bầu Hải Phòng có khả chịu mặn , giống Háu trắng Nước mặn có khả chịu mặn trung bình thực nghiệm Nhóm III: Gồm giống/dòng lúa Lúa Ven dạng 1, Quảng trắng, Nước mặn dạng 1, Tẻ chăm, Ven đỏ có nguồn gốc từ ven biển miền Trung Việt Nam Nhóm có mức độ tương đồng thấp 0,852 Phần lớn giống/dòng lúa nhóm có khả chịu mặn cao Nhóm IV: Có mức độ tương đồng di truyền thấp 0,842, gồm giống/dòng lúa, đó, giống có nguồn gốc từ Nam Định Chiêm rong giống có nguồn gốc từ Thanh Hố Chành trụi có khả chịu mặn tốt điều kiện mơi trường có muối với nồng độ 0,8% Nhóm V: Có mức độ tương đồng thấp 0,825; gồm giống/dòng lúa Việt Nam (Cườm dạng 2, Tám thơm, CM6, Mành gié) IRRI (Pokkali IR28) Trong nhóm này, với giống chuẩn kháng mặn Pokkali, giống/dòng lúa Cườm dạng CM6 có khả chịu mặn mơi trường có muối với EC=16dS/m Nhóm VI: Mức độ tương đồng thấp 0,835; gồm giống/dòng lúa Q5, Tám dự , Nghi hương Nhóm có giống nhập nội có nguồn gốc từ Trung Quốc Q5 có khả chịu mặn kém, giống/dòng Tám dự Nghi hương chịu mặn tốt mơi trường có muối với nồng độ 12dS/m Nhóm VII: Gồm giống chịu mặn P4, P6, AC5 Nhóm có mức độ tương đồng di truyền thấp 0,862 có nguồn gốc từ Việt Nam Nhóm VIII: có mức tương đồng thấp 0,847; gồm giống/dòng lúa Việt Nam IRRI Lúa chăm biển, Ngoi tía, Ré trắng, IR352, Chiêm cũ, Tẻ tép, Nếp chẩn , có giống/dòng lúa có khả chịu mặn mức trung bình có nguồn gốc từ Nam Định Ngoi tía Tẻ tép Nhóm IX: có mức tương đồng di truyền thấp 0,829; gồm giống/dòng lúa Lúa ngoi, Nếp quắn , Hom râu giống địa phương Việt Nam, có Hom râu nguồn gốc từ Thái Bình có khả chịu mặn Nhóm X: Gồm giống/dòng lúa, có giống nhập nội có nguồn gốc từ Trung Quốc Khang dân; giống địa phương Việt Nam Cườm dạng Lúa su dạng có khả chịu mặn tốt theo thực nghiệm Hình : Sơ đồ phân loại 40 giống/dòng lúa phương pháp UPGMA Trong công tác tạo giống lúa lai, người ta nhận thấy cặp bố mẹ xa phương diện di truyền cho ưu lai cao Nếu khoảng cách di truyền cặp giống bố mẹ lớn (tương đồng di truyền nhỏ 0,4), lai thường khó sống sót bất thụ Nếu khoảng cách di truyền cặp giống bố mẹ nhỏ (tương đồng di truyền lớn 0,7) lai thường có ưu lai thấp không cho ưu lai Như mức độ tương đồng di truyền từ 0,4 đến 0,7 làm chuẩn để chọn bố mẹ tạo dòng lúa lai có khả cho ưu lai Trên sở phân tích di truyền dựa vào thị phân tử SSR, kết phân nhóm di truyền hệ số tương đồng di truyền giống/dòng lúa nghiên cứu, đề xuất số tổ hợp lai dự kiến có triển vọng sau: Hom râu Pokkali, Chành trụi P6, Pokkali Q5, Cườm dạng Khang dân Kết luận - Đã nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa liên quan đến tính chịu mặn 20 thị SSR Ghi nhận tính đa alen cao 20 locut SSR nghiên cứu (từ 3-11 alen/locut) Tần số alen phổ biến dao động từ 15,79% đến 85%, trung bình đạt 40,07% Hệ số đa dạng di truyền PIC locut nghiên cứu cao với giá trị - trung bình 0,713 Đánh giá đa dạng di truyền giống/dòng lúa liên quan đến tính chịu mặn thị SSR cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao giống/dòng lúa; hệ số tương đồng di truyền ghi nhận từ 0,68 đến 0,91 Tại giá trị tương đồng 0,825 phân - 40 giống/dòng lúa thành 10 nhóm Trên sở khoảng cách di truyền khả chịu mặn giống/dòng lúa nghiên cứu, đề suất số tổ hợp lai cơng tác chọn tạo giống lúa chịu mặn có triển vọng cho ưu lai cao sau: Hom râu Pokkali, Chành trụi P6, Pokkali Q5, Cườm dạng Khang dân18 ... số đa dạng di truyền PIC locut nghiên cứu cao với giá trị - trung bình 0,713 Đánh giá đa dạng di truyền giống/dòng lúa liên quan đến tính chịu mặn thị SSR cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao.. .mặn lúa Việt Nam với mục tiêu xây dựng sở liệu ADN tính chịu mặn giống/dòng lúa nghiên cứu nhằm góp phần quan trọng cho việc khai thác nguồn gen chịu mặn định hướng cho chọn tạo giống lúa chịu. .. phân tích mối tương quan di truyền liên quan đến tính chịu mặn giống/dòng lúa nghiên cứu Tổng số thu 800 mẫu phản ứng PCR (tổ hợp PCR) Hình Kết nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa thị SSR- RM339