NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN.NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊNNGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NĂM HỌC 2016- 2017 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN Sinh viên thực hiện: Thân Thị Kim Phượng Đinh Thị Thùy Người hướng dẫn: T.S Nguyễn Hữu Quân Thái Nguyên, tháng năm 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NĂM HỌC 2016- 2017 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN Xác nhận người hướng dẫn Sinh viên thực T.S Nguyễn Hữu Quân Thân Thị Kim Phượng Đinh Thị Thùy Thái Nguyên, tháng năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Hữu Quân tận tình hướng dẫn thường xuyên giúp đỡ trình thực đề tài nghiên cứu khoa học Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Hồng giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm Chúng em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, thầy cô giáo thuộc môn Sinh học đại Giáo dục Sinh học, toàn thể thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ để chúng em hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học Chúng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Thái Nguyên, ngày 10 tháng năm 2017 Sinh viên Đinh Thị Thùy Thân Thị Kim Phượng ii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục bảng biểu iv Danh mục hình v Danh mục từ viết tắt .v MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzyme chitinase 1.1.1 Khái niệm phân loại 1.1.2 Cơ chế hoạt động chitinase 1.1.3 Nguồn thu nhận chitinase 1.1.4 Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh chitinase nấm sợi 1.1.5 Nghiên cứu chitinase: 1.2 Enzyme protease 10 1.2.1 Khái niệm protease 10 1.2.2 Nguồn gốc protease 10 1.2.3 Phân loại 11 1.2.4 Đặc điểm tính chất protease vi sinh vật 12 1.2.5 Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) protease 13 1.2.6 Cơ chế xúc tác protease .14 1.2.7 Ảnh hưởng môi trường lên khả sinh protease 14 1.2.8 Tình hình nghiên cứu protease 16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 18 2.1.1 Vật liệu 18 iii 2.1.2 Thiết bị 18 2.1.3 Hóa chất 18 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phân lập nấm 19 2.2.2 Nuôi cấy nấm sinh tổng hợp enzyme .19 2.2.3 Định tính enzyme đĩa thạch 20 2.2.4 Xác định hoạt tính protease 20 2.2.5 Tối ưu điều kiện nuôi cấy 21 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Phân lập chủng nấm sợi có khả sinh tổng hợp chitinase protease 23 3.2 Xác định đặc điểm hình thái chủng nấm 24 3.3 Tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm Aspergillus sinh tổng hợp protease 27 3.3.1 Khả sinh protease theo thời gian nuôi cấy .27 3.3.2 Ảnh hưởng pH nuôi cấy 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 KẾT LUẬN 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO .30 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng thí nghiệm .18 Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng thí nghiệm 18 Bảng 3.1 Một số đặc điểm hình thái chủng nấm phân lập 25 Bảng 3.2 Hoạt tính protease theo thời gian từ nấm Aspergillus phân lập đất 27 Bảng 3.3 Hoạt tính protease pH khác từ nấm Aspergillus phân lập đất 28 v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Phản ứng thủy phân liên kết peptide 10 Hình 1.2 Cơ chế hai bước hoạt động serine protease 14 Hình 2.1 Đường chuẩn nồng độ tyrosin 21 Hình 3.1 Hoạt tính protease (A) chitinase (B) chủng nấm phân lập 23 Hình 3.2 Sợi nấm phát triển mơi trường PDA Crapek lỏng 26 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Bp Cặp base DNS 3,5- Dinitrosalicylic acid EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid GlcNAc N-acetylglucosamine (GlcNAc)2 Diacetylchitobiose (GluNAc)3 Chitooligomer kDa Kilo Dalton PDA Potato Dextrose Agar TCA Trichloroacetic acid TTHĐ trung tâm hoạt động MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nấm sợi phân bố rộng rãi tự nhiên, chúng có nhiều ứng dụng nhiều lĩnh vực khác như: y học, nông nghiệp, cơng nghiệp thực phẩm tham gia tích cực vào q trình chuyển hóa vật chất, khép kín vòng tuần hoàn vật chất tự nhiên, làm vật chất ổn định từ bảo vệ cân sinh thái Nấm sợi sử dụng vào trình phân hủy rác thải hữu đất phân hủy chất độc hại thành chất không độc góp phần bảo vệ mơi trường Ngồi ra, nấm sợi ứng dụng sản xuất phân bón thuốc trừ sâu sinh học nhằm mục đích thay thuốc hóa học Nhiều enzyme khai thác từ nấm sợi ứng dụng thời gian qua protease, amylase, cellulase, pectinase,…Đặc biệt, protease chitinase hai loại enzyme có vai trò lớn tự nhiên So với nguồn enzyme từ động vật thực vật, enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm vượt trội như: dễ sản xuất thu nhận, môi trường lên men rẻ tiền, suất sinh học cao Đặc biệt, giá thành enzyme từ vi sinh vật rẻ nhiều lần so với chế phẩm enzyme từ động vật, thực vật sản xuất cóở quy mơ cơng nghiệp Trên giới chế phẩm protease, chitinase tinh khiết thương mại hóa đưa vào ứng dụng lại có giá thành đắt Nhằm mục đích khai thác nguồn enzyme tự nhiên từ nấm sợi, góp phần làm giảm giá thành ứng dụng thực tiễn Xuất phát từ lý trên, tiến hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu khả sinh enzyme ngoại bào từ loài nấm sợi phân lập Thái Nguyên” Mục tiêu nghiên cứu Phân lập loài nấm sợi có khả sinh tổng hợp chitinase protease Thái Nguyên Nội dung nghiên cứu Phân lập số chủng nấm sợi có khả sinh tổng hợp chitinase protease ngoại bào Xác định đặc điểm hình thái số chủng nấm sợi thu Tối ưu thời gian sinh tổng hợp chitinase protease Phương pháp nghiên cứu Phân lập nấm Nuôi cấy nấm sinh tổng hợp enzyme Định tính enzyme đĩa thạch Xác định hoạt tính enzyme Tối ưu điều kiện nuôi cấy Xử lý số liệu phần mềm excel 18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 2.1.1 Vật liệu Các mẫu đất mẫu côn trùng sử dụng để phân lập loài nấm sinh tổng hợp protease chitinase lấy từ khu vực thuộc Thành phố Thái nguyên 2.1.2 Thiết bị Các thiết bị sử dụng làm thí nghiệm mới, đại có độ xác cao thuộc phòng Thí nghiệm Vi sinh, Hóa sinh Cơng nghệ ADN ứng dụng Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng thí nghiệm Thiết bị Hãng sản xuất Bể ổn nhiệt Trung Quốc Box cấy LB-1234 Việt Nam Cân phân tích AB 240 Thụy Sỹ Máy chuẩn pH tự động 718 Stat Titrino Thụy Sỹ Máy lắc nuôi cấy Đức Máy li tâm lạnh Mikro 22R Đức Máy quang phổ UV-2500 Mỹ Nồi khử trùng ES-315 Nhật Bản 2.1.3 Hóa chất Hóa chất sử dụng thí nghiệm dạng tinh khiết cung cấp hãng khác liệt kê bảng 2.2 Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng thí nghiệm Hóa chất Hãng sản xuất (nước) Casein, chitin, N-acetyl glucosamine Đức Glucose, saccarose Trung Quốc NH4NO3, NaNO3, KNO3, ,(NH4)2SO4 Trung Quốc Thuốc nhuộm Lugol, thuốc thử DNS, thuốc nhuộm Đức Coomassie Brilliant Blue 250 NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O Trung Quốc 19 2.1.4 Mơi trường ni cấy Mơi trường khống Crapek: NaNO3 0,2%; K2HPO4 0,1%; MgSO4 0,05%; KCl 0,05%; pH 6,5 Môi trường đặc bổ sung agar 2,0% Môi trường PDA (pha 1lit môi trường): 200g dịch chiết khoai tây; 20g glucose, 20g thạch agar Môi trường sinh tổng hợp protease : môi trường Crapek bổ sung casein 0,5% Môi trường sinh tổng hợp chitinase: môi trường Crapek bổ sung chitin 0,5% 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập nấm 2.2.1.1 Phân lập nấm từ đất Nấm từ đất phân lập phương pháp trải dịch huyền phù lên đĩa thạch: Lấy khoảng 10-15g đất trồng, nơi có nhiều rác thải hữu cho vào cối sứ nghiền nhỏ, trộn sau cân 1g cho vào bình tam giác chứa 99ml nước cất vơ trùng, dùng đũa thủy tinh khuấy cho tan hết đất thu dung dịch đất có độ pha lỗng 10 lần Dịch đất tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10 -4, 10-5 Hút 100µl dịch huyền phù đất pha loãng nồng độ 10-5 vào đĩa môi trường PDA Dùng que chang, trải dịch huyền phù đất đến khơ, sau để vào tủ ấm nhiệt độ 28-30°C Sau 3-5 ngày, đĩa PDA lấy quan sát khuẩn lạc mọc đĩa Cấy khuẩn lạc riêng rẽ vào đĩa có mơi trường PDA mới, để tủ ấm 3-5 ngày sử dụng để nghiên cứu khả sinh tổng hợp enzyme 2.2.1.2 Phân lập từ xác côn trùng Từ trùng chết có nấm mọc thu để phân lập nấm Dùng que cấy vô trùng lấy sợi nấm mọc côn trùng cấy ria đĩa môi trường PDA, để vào tủ ấm 3-4 ngày nhiệt độ 28-30°C Lấy đĩa nấm phát triển sử dụng để nghiên cứu khả sinh tổng hợp enzyme 2.2.2 Nuôi cấy nấm sinh tổng hợp enzyme Hoạt hóa chủng nấm: Chủng nấm từ ống giống nuôi cấy môi trường Crapek lỏng 28°C, pH 7,0; lắc 200 vòng/phút 48 20 Ni cấy nấm sinh enzyme: Nấm sợi sau hoạt hóa ni cấy chìm mơi trường crapek bổ sung casein (đối với protease) bổ sung chitin (đối với chitinase) 28°C, lắc 200 vòng/phút Sau 72 ni cấy, dịch li tâm loại sinh khối tế bào thu dịch enzym thơ 2.2.3 Định tính enzyme đĩa thạch Hoạt tính protease chitinase định tính theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch Đĩa thạch chứa 0,5% chất casein (đối với protease) 0,5% chất chitin(đối với chitinase) nước cất dày khoảng 0,5cm, đục giếng đường kính 0,5cm Hút 50µl dịch enzyme ngoại bào từ mẫu nấm thu cho vào giếng đặt vào tử lạnh 1-2h 4°C để enzyme khuếch tán vào môi trường Sau đó, đĩa thạch ủ qua đêm 37°C lấy nhuộm thuốc nhuộm để quan sát vòng thủy phân Đối với protease nhuộm Coomassie Brilliant Blue 250 chitinase nhuộm lugol Bán kính vòng thủy phân R halo= R-r ( với R bán kính vòng ngồi tính từ tâm lỗ đến mép ngồi vòng thủy phân r bán kính lỗ ), biểu thị hoạt tính tương đối enzyme 2.2.4 Xác định hoạt tính protease Nguyên lí: Thuốc thử Folin có chứa acid phosphomoipdic acid phosphoframic, hai chất phản ứng với gốc tyrosine triptophan phân tử protein tạo thành phức chất màu xanh da trời hấp phụ cực đại bước sóng 750 nm Như xác định khả phân giải polypeptid protease thông qua tyrosine triptophan Tiến hành đo: Ống thí nghiệm hút 0,5ml enzyme hút vào ống nghiệm, để 15 phút 40°C, bổ sung 1,0ml dung dịch casein 1,0% Hỗn hợp lắc ủ 40°C 10 phút bổ sung 2,5ml TCA 5,0% Hỗn hợp lắc đều, khoảng 20 phút cho phản ứng dừng lại hồn tồn, sau ly tâm phút với 10000 vòng/phút 0,5ml dung dịch hút vào ống nghiệm khác, bổ sung 2,0ml dung dịch Na2CO3 6,0% lắc bổ sung 0,5ml thuốc thử Folin Ciocalteau 0,2N lắc đều, sau 30 phút đo bước sóng 750nm Ống đối chứng hút 0,5ml dung dịch enzyme bổ sung với 2,5ml dung dịch TCA 5,0% lắc đều, sau thêm 1,0ml dung dịch casein 0,5% tiếp tục làm 21 Hiệu số hấp thụ đọc máy so màu mẫu thí nghiệm đối chứng đối chiếu đồ thị tyrosine nồng độ chuẩn (Hình 2.1) Hoạt độ 1ml dung dịch enzyme tính theo cơng thức: Trong đó: x số đơn vị hoạt độ 1,0ml dịch enzyme, 4: thể tích hỗn hợp phản ứng acid tricloacetic, a: Số micromol tyrosine tương đương với hiệu số đọc máy ống thí nghiệm ống kiểm tra, b: Nồng độ pha loãng dung dịch enzyme, t: thời gian phản ứng Hình 2.1 Đường chuẩn nồng độ tyrosin Xây dựng đường chuẩn: Tyrosin pha 100mM đệm natri acetate pH 5,0 với nồng độ chuẩn khác từ 10-100 µg/ml 1,0ml dung dịch chuẩn đo bước sóng 750 nm Độ hấp phụ nồng độ tyrosine vẽ theo chương trình Excel Kết cho thấy, đường nồng độ chuẩn tuyến tính dải nồng độ từ 10-100 µg/ml.Đường chuẩn có phương trình y = 0,904x + 0,017 Trong đó, y độ hấp phụ (OD) bước sóng 750 nm, x nồng độ tyrosine (µg/ml) 2.2.5 Tối ưu điều kiện ni cấy 2.2.5.1 Khảo sát thời gian sinh tổng hợp protease Các chủng nấm phân lập từ đất từ trùng có hoạt tính enyzme ni mơi trường khống crapek có bổ sung casein 0,5% làm nguồn chất cảm ứng sinh protease 0,5% chitinase làm nguồn chất cảm ứng sinh chitinase pH 7,0, nhiệt độ nuôi 28°C Dịch enzyme thu khoảng thời gian khác từ 24- 22 144 (cách 24 giờ) để xác định hoạt tính protease để lựa chọn thời gian tối ưu cho trình sinh enzym 2.2.5.2 Khảo sát pH môi trường nuôi cấy Chủng nấm phân lập từ đất từ trùng có hoạt tính enzyme ni cấy 144 mơi trường khống Crapek có bổ sung casein 0,5% làm nguồn chất cảm ứng sinh protease 0,5% chitin làm nguồn chất cảm ứng sinh chitinase có pH thay đổi từ 5,0-8,0 (cách 0,5) 28°C, lắc 200 vòng/phút để xác định pH môi trường tối ưu 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu Kết nghiên cứu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học phần mềm Excel 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng nấm sợi có khả sinh tổng hợp chitinase protease Từ mẫu đất côn trùng thu thập nơi khác nhau, sau cấy trải đĩa thạch có chứa mơi trường PDA thu khuẩn lạc khác màu sắc hình thái Chúng tơi lựa chọn 04 khuẩn lạc cho nấm có hình thành sợi nấm cấy chải môi trường PDA mới, khuẩn lạc cấy lên đĩa Sau ngày ni cấy 30°C, đĩa PDA có loài nấm chủng phát triển Cấy nấm vào 30 ml mơi trường crapek lỏng có bổ sung chất chitin 0,5% để kích thích sinh tổng hợp chitinase bổ sung 0,5% chất casein để kích thích sinh tổng hợp protease 30°C thời gian 72 Các bình ni ly tâm thu dịch enzyme ngoại bào định tính sơ đĩa thạch agar có chứa 0,5% chitin (định tính chitinase) 0,5% casein (định tính protease) A B Hình 3.1 Hoạt tính protease (A) chitinase (B) chủng nấm phân lập Giếng1: Nước; giếng 2: nấm có khuẩn lạc màu đen phân lập từ đất, giếng 3: nấm có khuẩn lạc màu vàng phân lập từ gián, giếng 4: nấm có khuẩn lạc màu trắng phân lập từ xác trùng, giếng 4: nấm có khuẩn lạc màu xanh phân lập từ đất Đĩa thạch agar có chứa casein 0,5% sau bổ sung dịch enzyme ngoại bào từ chủng nấm phân lập để tủ ấm 37°C qua đêm Sau ủ, đĩa thạch nhuộm với Coomassie Brilliant Blue 250, tẩy axit axetic Kết hình 3.1A cho thấy, bốn chủng phân lập xuất vòng phân giải màu trắng (giếng 2-4), giếng bổ sung nước khơng xuất vòng thủy 24 phân Như vậy, bốn chủng nấm thu có hoạt tính protease Đĩa thạch agar có chứa chitin 0,5% sau bổ sung dịch enzyme ngoại bào từ chủng nấm phân lập để tủ ấm 37°C qua đêm Sau ủ, đĩa thạch nhuộm với lugol Kết hình 3.1B cho thấy, bốn chủng phân lập có chủng từ xác chết gián (giếng 4) xuất vòng phân giải màu trắng; chủng lại (giếng 3-5) giếng (bổ sung nước) khơng xuất vòng phân giải Như vậy, số chủng nấm phân lập từ đất xác trùng, có lồi có hoạt tính chitinase Các chủng nấm có hoạt tính protease chitinase lựa chọn để định tên chi sơ phương pháp hình thái tối ưu khả sinh tổng hợp enzyme điều kiện thời gian pH môi trường nuôi cấy 3.2 Xác định đặc điểm hình thái chủng nấm Từ chủng nấm thu trên, tiến hành nghiên cứu đặc điểm hình thái sợi nấm khuẩn lạc mọc đĩa PDA Bảng 3.1 cho thấy: Khi nuôi cấy môi trường PDA, khuẩn lạc mốc đen kí hiệu As-D có sợi nấm màu trắng, phía sợi nấm khí sinh hình thành bào tử trần tạo cho phía phía bề mặt đĩa petri có màu đen Khi ni cấy môi trường lỏng, sợi nấm cuộn lại tạo thành khối tròn, có màu trắng, kích thước lớn, dịch ni Quan sát kính hiển vi quang học, bào tử nấm As-D hình cầu, bào tử nhỏ, tròn, màng ngồi trơn, sợi nấm có vách ngăn (Hình 3.2A) Đối với nấm có kí hiệu Me-S, mơi trường PDA sợi nấm phát triển tạo khuẩn lạc trắng bơng, khuẩn ti khí sinh phát triển cao, khuẩn ti chất vàng nhạt, sợi nấm có màu xanh lục, phía mơi trường PDA có màu vàng, mặt có màu xanh lục, đỉnh sợi nấm phân nhánh, bào tử đỉnh cuống dính liền Khi ni môi trường lỏng, sợi nấm cuộn lại tạo thành khối tròn, xù xì có màu trắng, kích thước lớn, dịch ni Dưới kính hiển vi quang học, bào tử nấm Me-C có hình cầu, đính đầu cành bám nhiều vị trí khác đỉnh sợi nấm Bào tử nhỏ, tròn, màng ngồi trơn, sợi nấm khơng có vách ngăn (Hình 3.2B) Ký Bảng 3.1 Một số đặc điểm hình thái chủng nấm phân lập Dạng Tơ nấm Mặt Mặt Cuống bào tử 25 hiệu bào tử đĩa petri đĩa petri Đỉnh sợi nấm khí sinh As-D Cầu Me-S Cầu Ba-S Cầu Me-G Trứng Trắng Xanh lục Trắng ngà, mịn Trắng Đen Đen Vàng Xanh lục Trắng Trắng ngà Vàng nhạt Vàng hình thành nên bào tử trần Phân nhánh, bào tử đỉnh cuống dính liền Phân nhánh nhiều cuối sợi nấm Đỉnh sợi nấm hình thành trắng bào tử trần Ghi chú: As: Aspergillus; Me: Metarhizium, Ba: Beauveria; D: từ đất; S: sâu; G: gián Nấm có kí hiệu Ba-S, mơi trường PDA sợi nấm phát triển tạo khuẩn lạc trắng ngà mịn, khuẩn ti khí sinh phát sát bề mặt, phân nhánh nhiều cuối sợi nấm tạo bào tử giúp nấm có màu trắng trắng ngà Khi ni môi trường lỏng, sợi nấm cuộn lại tạo thành khối tròn, trơn có màu trắng đục, kích thước nhỏ, dịch ni Quan sát kính hiển vi quang học bào tử nấm Ba-C có hình cầu, bào tử lớn, tròn, sợi nấm có vách ngăn (Hình 3.2D) Nấm có kí hiệu Me-G phân lập từ gián chết, môi trường PDA, sợi nấm phát triển tạo thành sợi nấm màu trắng, phía đĩa petri có màu vàng nhạt, điểm trắng, đỉnh sợi nấm hình thành bào tử trần Khi ni cấy môi trường lỏng, sợi nấm cuộn lại tạo thành hình cầu, to có màu trắng ngà làm mơi trường Dưới kính hiển vi quang học, bào tử nấm As-C có hình trứng hình elip, bào tử nhỏ, sợi nấm khơng có vách ngăn (Hình 3.2C) Qua đặc điểm phân tích lồi nấm, chúng tơi sơ xếp lồi nấm có kí hiệu As, Me, Ba thuộc chi Aspergillus, Metarhizium, Beauveria (Hình 3.2) Mốc đen thuộc chi Aspergillus phân lập từ đất sử dụng để tối ưu sinh tổng hợp protease mốc xanh thuộc chi Metarhizium từ gián lựa chọn để tối ưu sinh tổng hợp chitinase 26 A - Đặc A - Lỏng B - Đặc C - Lỏng C - Đặc B - Lỏng D - Đặc Hình 3.2 Sợi nấm phát triển môi trường PDA Crapek lỏng A: nấm Aspergillus đất, B: Aspergillus từ gián, C: Beauveria, D: Metarhizium 3.3 Tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm Aspergillus sinh tổng hợp protease 3.3.1 Khả sinh protease theo thời gian nuôi cấy Để đánh giá khả sinh tổng hợp protease theo thời gian, chi nấm Aspergillus từ đất ni cấy mơi trường khống Crapek, bổ sung casein 0,5% 30°C, lắc 200 vòng/phút Dịch enzyme thu thời gian khác để xác định hoạt tính protease Kết cho thấy, protease sinh sau 24 ni cấy (hoạt tính đạt 27 0,8U/ml) đạt cực đại 96 nuôi cấy (hoạt tính đạt 2,25 U/ml), sau giảm dần tiếp tục ni, hoạt tính đạt 1,33 U/ml sau 144 ni (Bảng 3.2) Như vậy, thời gian 96 thích hợp cho nấm Aspergillus sinh tổng hợp protease lựa chọn để ni cấy Bảng 3.2 Hoạt tính protease theo thời gian từ nấm Aspergillus phân lập đất Thời OD (750 nm) Hiệu số Hàm lượng Hoạt tính Thí Đối chứng gian (x) (U/ml) nghiệm (giờ) 0,50 0,80 24 0,492 0,385 0,107 48 0,559 0,424 0,135 0,65 1,04 72 0,482 0,342 0,14 0,68 1,09 96 0,563 0,292 0,271 1,40 2,25 120 0,496 0,298 0,198 1,00 1,60 144 0,415 0,243 0,172 0,86 1,37 28 3.3.2 Ảnh hưởng pH nuôi cấy Nấm Aspergillus nuôi cấy môi trường Crapek có 0,5% lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 30C pH khác Sau 96 nuôi cấy, khả sinh tổng hợp protease đạt cao pH 6,5 3,01 U/ml pH 6,5 lựa chọn để nuôi cấy (Bảng 3.3) Bảng 3.3 Hoạt tính protease pH khác từ nấm Aspergillus phân lập đất OD (750 nm) Hàm lượng Hoạt tính Thí pH Hiệu số Đối chứng (x) (U/ml) nghiệm 5,5 0,461 0,197 0,264 1,37 2,19 6,5 0,481 0,124 0,357 1,88 3,01 7,5 0,57 0,242 0,328 1,72 2,75 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã phân lập 04 lồi nấm có khả sinh tổng hợp protease 02 lồi nấm sinh tổng hợp chitinase thơng qua định tính đĩa thạch có chứa chất tương ứng Bước đầu loài nấm As, Me, Ba thuộc vào chi Aspergillus, Metarhizium, Beauveria Đã lựa chọn thời gian 96 pH 6,5 thích hợp cho nấm thuộc chi Aspergillus sinh tổng hợp protease, hoạt tính đạt 3,01 U/ml KIẾN NGHỊ Tiếp tục định danh nấm phân lập phương pháp sinh học phân tử sử dụng gen 28S rRNA Tiếp tục tối ưu nguồn nito, nguồn cacbon nồng độ chất để nâng cao suất sinh tổng hợp protease 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Vũ Ngọc Bội (2003), “Nghiên cứu trình thủy phân protein cá enzym protease từ Bac.subtilis 5S”, Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp Hồ Chí Minh Đỗ Thị Hà (2012), “Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp enzyme chitinase phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ “, Tạp chí Khoa học, tr 26-35 Đinh Minh Hiệp, Phạm Nguyễn Thanh Thảo, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương (2008), "Thu nhận chitinase từ chủng Trichoderma TĐ14 khảo sát khả kháng vi nấm Candida albicans" Lê Thị Huệ (2010), “Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase cuả số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng”, luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh Lưu Thị Nguyệt Minh (2007), "Phân tách Protease Bacillus Subtilis hệ hai pha Polyethylene glycol/ Potassium phosphate", Đồ án tốt nghiệp Trần Xuân Ngạch (2007), "Công nghệ enzyme", Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Nguyễn Ngọc Dũng (2004), "Nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase chủng vi khuẩn đối kháng vi nấm", Báo cáo khoa học, hội nghị toàn quốc, Nxb Khoa học kỹ thuật, tr 125-128 Nguyễn Hữu Quân (2005), “Nghiên cứu đặc tính chitinase tự nhiên biểu chitinsaae tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecani”, Luận án tiến sĩ Vũ Thị Thanh, Vũ Văn Hạnh, Nghiêm Ngọc Minh, Quyền Đình Thi (2013), "Tối ưu hóa điều kiện mơi trường ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Penicillium sp.M4 phân lập từ ruộng mía" 10 Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), ‘Tối ưu số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp QN6 sinh tổng hợp Protease”, viện CNSH 11 Võ Hồng Thi, Nguyễn Hoàng Mỹ, Nguyễn Phạm Huyền (2012), "Hoạt tính protease số chủng Bacillus phân lập từ nước thải chế biến thịt thủy sản", Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, tr 116-124 12 Phan Thị Bích Trâm, Trương Thủy Trang , Dương Thị Hương Giang (2007), “Tinh khảo sát đặc điểm protease từ trùn quắn (pheretima posthuma)”, Tạp chí Khoa học, tr 158-167 31 TIẾNG ANH 13 De Marco J L., Felix C R (2002), "Characterization of a protease produced by a Trichoderma harzianum isolate which controls cocoa plant witches' broom disease", Methodology, 3, pp 1471-2091 14 Degering C., Eggert T., Puls M., Bongaerts J., Stefan E S., Karl H., Maurer K H., Karl E., Jaeger K E (2010), "Optimization of protease secretion in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis by screening of homologous and heterologous signal peptides", Appl Environ Microbiol, 76, pp 6370-6376 15 Esteve C., Birbeck T H (2004), "Secretion of haemolysins and proteases by Aeromonas hydrophila EO63: separation and characterization of the serine protease (caseinase) and the metalloprotease (elastase)", J Appl Microbiol, 96, pp 994-1001 16 Ferid A., Ferid L (2008), "Production of alkaline proteases by Botrytis cinerea using economic raw materials: Assay as biodetergent", Process Biochemistry, 43, pp 1202- 1208 17 Gan Z., Yang J., Tao N., Liang L., Mi Q., Li J., Zhang K Q (2007), "Cloning of the gene Lecanicillium psalliotae chitinase Lpchi1 and identification of its potential role in the biocontrol of root-knot nematode Meloidogyne incognita", Appl Microbiol Biotechnol, 76, pp 1309-17 18 Henrissat B., Bairoch A (1993), "New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities", Biochem J., 293, pp 781-788 19 Ikram U H., Hamid M., Hina U (2006), "Production of protease by Penicillium chrysogenum through optimization of environmental conditions ", journal of agriculture & social sciences, 2, pp 1813–2235 20 Kolla J P., Narayana, Muvva V (2009), "Chitinase production by Streptomyces sp ANU 6277", Braz J Microbiol., 40, pp 725-733 21 Muthu P., Williams B C (2012), "Purification and characterization of neutral protease enzyme from Bacillus Subtilis", Scholars Research Library, pp 612-618 22 Odu N N., Akujobi C O (2012), "Protease production capabilities of Micrococcus luteus and Bacillus species isolated from Abattoir Environment", Journal of Microbiology Research, 2, pp 127-132 32 23 Patil N S., Waghmareb S R., Jadhav J P (2013), "Purification and characterization of an extracellular antifungal chitinase from Penicillium ochrochloron MTCC 517 and its application in protoplast formation", Process Biochemistry, 48, pp 176-183 24 Pei Y J Z., Yang X., Lu X., Xia Y (2000), "Purification and characterization of cuticle-degrading protease from entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae", Wei Sheng Wu Xue Bao., 40, pp 306-311 25 Porto T S., Pessôa-Filho P A., Neto B B., Filho J L., Converti A., Porto A L., Pessoa A J (2007), "Removal of proteases from Clostridium perfringens fermented broth by aqueous two-phase systems (PEG/citrate)", J Ind Microbiol Biotechnol , 34, pp 547-552 26 Shankar S., More S V., Seeta L R (2010), "Recovery of silver from waste x-ray film by alkaline protease from Conidiobolus coronatus", Indian journal of Biotechnology, 6, pp 60-69 27 Tikhonov V E., Lopez-Llorca L V., Salinas J., Jansson H.-B (2002),"Purification and characterization of chitinases from the nematophagous fungi Verticillium chlamydosporium and V suchlasporium", Fungal Genet Biol., 35, pp 67–78 28 Ulhoa C J., Peberdy J F (1991), "Regulation of chitinase synthesis in Trichoderma harzianum", J Gen Microbiol., 137, pp 2163-2169 29 Xia J I., Xiong J., Xu T., Zhang C G., Zhang R I., Zhang Q., Wu S., Qiu G Z (2009), "Purification and characterization of extracellular chitinase from a novel strain Aspergillus fumigatus CS-01", J Cent South Unive Technol., 16, pp 552-557 30 Zeki N H., Muslim S N (2010), "Purification, characterization and antifungal activity from Serratia marcescens isolated from fresh vegetable", J Pure Appl Sci., 23, pp 1-15 INTERNET 31 http://tailieu.vn/doc/de-tai-thu-nhan-enzyme-protease-tu-vi-sinh-vat-va-nhungung-dung-cua-enzyme-protease-138826.html ... HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NĂM HỌC 2016- 2017 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO TỪ CÁC LOÀI NẤM SỢI PHÂN LẬP Ở THÁI NGUYÊN... Thái Nguyên Mục tiêu nghiên cứu Phân lập lồi nấm sợi có khả sinh tổng hợp chitinase protease Thái Nguyên Nội dung nghiên cứu Phân lập số chủng nấm sợi có khả sinh tổng hợp chitinase protease ngoại. .. nguồn enzyme tự nhiên từ nấm sợi, góp phần làm giảm giá thành ứng dụng thực tiễn Xuất phát từ lý trên, tiến hành lựa chọn đề tài: Nghiên cứu khả sinh enzyme ngoại bào từ loài nấm sợi phân lập Thái