NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN, CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH , CÂY CHÈ, THÁI NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------   ------ BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------   ------ BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. VI THỊ ĐOAN CHÍNH THÁI NGUYÊN - 2008 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS. Vi Thị Đoan Chính đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Phú Hùng và các cán bộ của bộ môn Sinh học thuộc Khoa KHTN & XH - ĐHTN đã nhiệt tình giúp đỡ tôi. Xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Ngô Đình Quang Bính và các cán bộ phòng Di truyền vi sinh học - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Y - Dƣợc Thái Nguyên, Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau Đại học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - ĐHTN đã tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa KHCB, Bộ môn Hóa - sinh đã tạo mọi điều kiện cho tôi đƣợc học tập và hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những ngƣời thân yêu của tôi. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008 Tác giả Bùi Thị Hà MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Những chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 3 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn .5 1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn 6 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI . .8 1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy .8 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 9 1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa .10 1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy) 10 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11 1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN .12 1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh .12 1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 15 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 16 1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 18 1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm 18 1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật .21 Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất .24 2.1.1. Nguyên liệu 24 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị .24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè .27 2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 28 2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 28 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh 28 2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 29 2.2.3. Bảo quản giống 29 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 30 2.2.4.1. Đặc điểm hình thái .30 2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy 31 2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 31 2.2.5. Lên men tạo kháng sinh .32 2.2.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp .32 2.2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon 33 2.2.5.3. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ 33 2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA 33 2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB .33 2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR .34 2.2.6.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 35 2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu .36 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè 37 3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn .38 3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn 38 3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao 41 3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2 42 3.3.1. Đặc điểm hình thái 42 3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy 43 3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa .45 * Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon .45 * Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp .46 * Khả năng chịu muối .46 * Khả năng sinh enzym ngoại bào 47 3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 48 3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 50 3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn .52 3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp .52 3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon .54 3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ 56 3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử 57 3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn 57 3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR 58 Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận .60 4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo .61 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN XK : Xạ khuẩn VSV : Vi sinh vật CKS : Chất kháng sinh HSCC : Hệ sợi cơ chất HSKS : Hệ sợi khí sinh KTKS : Khuẩn ty khí sinh HTKS : Hoạt tính kháng sinh HTKN : Hoạt tính kháng nấm MT : Môi trƣờng KHVQH : Kính hiển vi quang học KHVĐT : Kính hiển vi điện tử DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid ISP : International Streptomyces Project TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid SDS : Sodiumdodecyl sulfat TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm .37 Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39 Bảng 3. 3.Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè .40 Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn 41 Bảng 3.5. Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1 .44 Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 45 Bảng 3.7. Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp của 2 chủng R2 và Đ1 .46 Bảng 3.8. Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1 .47 Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm kiểm định .48 Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis 50 Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu.52 Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng lên men khác nhau .53 Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1 .55 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1 .56 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh .38 Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu .39 Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm .40 Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn .42 Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2 42 Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1 .43 Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng .44 Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn .47 Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2 49 Hình 3.10: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tổng hợp CKS 54 Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS .55 Hình 3.12 : Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS .57 Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn .58 Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu .59 [...]... thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -22 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có... hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng 3 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài * Đối tượng nghiên cứu - Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Thái Nguyên - Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên * Nội dung nghiên cứu 1 Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV kiểm định 2 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có... chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của Thái Nguyên Chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi. .. sinh mạnh Trên các giống chè lá nhỏ (như Đại bạch trà, Gruzia) bệnh cũng phát sinh mạnh 1.4.1.4 Bệnh đốm xám Bệnh đốm xám là bệnh phổ biến ở các vùng trồng chè Bệnh phát sinh vào mùa mưa, nhiệt độ 27 300C Bệnh nặng làm lá chè khô rụng, cây chè còi cọc Tác nhân gây bệnh là do nấm Pestalossia theae Sawada [1],[4] Vết bệnh trên lá có màu nâu sẫm, lúc đầu chỉ có chấm nhỏ màu đen sau đó lan ra khắp lá Bệnh. .. năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6] Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã... hơn ở nương chè hái búp Từ tháng 7 đến tháng 9 thường có mưa kéo dài, bệnh dễ gây hại nặng Nhiệt độ 270C và độ ẩm > 90% là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh Bào tử nấm lan truyền nhờ mưa gió Chè để cành và vườn ươm bón nhiều phân đạm và trên nền thâm canh cao, thường bị bệnh nặng hơn 1.4.2 Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật * Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật Các nhà bệnh học thực vật trên. .. suốt pha sinh trưởng Quá trình sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có cách khuấy đảo và sục khí 1.4 MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 1.4.1 Một số bệnh hại chè do nấm 1.4.1.1 Bệnh phồng lá chè Bệnh được phát hiện năm 1868 ở Ấn Độ, nhưng đến năm 1895 Masse mới nghiên cứu phát hiện nguyên nhân gây bệnh Bệnh do nấm Esobasidium... gây bệnh Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp Trong đó cây chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất. .. đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [48],[49] 1.3 CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 1.3.1 Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -13Theo định nghĩa của Outchinnikov [48] Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các sản... nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như policin chống bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp 201 có khả năng sinh CKS mới là z - methylheptyl iso - nicotinate, chất kháng sinh này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F solani [15] Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ . hiện đề tài: Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên . Số hóa bởi Trung tâm. - Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên. * Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV