NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM    ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM    BÙI THỊ HÀ BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS VI THỊ ĐOAN CHÍNH THÁI NGUYÊN - 2008 THÁI NGUYÊN - 2008 LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS Vi Thị Đoan Chính tận tình giúp đỡ trình thực hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Phú Hùng cán môn Sinh học thuộc Khoa KHTN & XH - ĐHTN nhiệt tình giúp đỡ Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Xin chân thành cảm ơn PGS TS Ngô Đình Quang Bính cán phòng Di truyền vi sinh học - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học công nghệ Việt Nam Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Y - Dƣợc Thái Nguyên, Thái nguyên, ngày 15 tháng năm 2008 Tác giả Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau Đại học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - ĐHTN tạo nhiều điều kiện để hoàn thành luận văn Xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa KHCB, Bộ môn Hóa - sinh tạo điều kiện cho đƣợc học tập hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô, bạn bè đồng nghiệp động viên, tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình làm luận văn Lời cảm ơn sâu sắc xin dành cho gia đình ngƣời thân yêu Bùi Thị Hà MỤC LỤC 1.4.1 Một số bệnh hại chè nấm 18 Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Những chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên 1.1.2 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 1.1.3 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn .5 1.1.4 Cấu tạo xạ khuẩn 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI 1.2.1 Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy 1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 1.2.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa .10 1.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy) 10 1.2.5 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 11 1.3 CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN .12 1.3.1 Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh 12 1.3.2 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 15 1.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 16 1.4 MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 18 1.4.2 Các chất kháng sinh bảo vệ thực vật .21 Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu hóa chất .24 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị .24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ mẫu chè 27 2.2.2 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn 28 2.2.2.1 Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 28 2.2.2.2 Xác định hoạt tính kháng sinh 28 2.2.2.3.Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 29 2.2.3 Bảo quản giống 29 2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại xạ khuẩn 30 2.2.4.1 Đặc điểm hình thái 30 2.2.4.2 Đặc điểm nuôi cấy 31 2.2.4.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 31 2.2.5 Lên men tạo kháng sinh .32 2.2.5.1 Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 32 2.2.5.2 Ảnh hƣởng nguồn cacbon 33 2.2.5.3 Ảnh hƣởng nguồn Nitơ 33 2.2.6 Các phƣơng pháp sinh học phân tử phân lập gen 16S - rRNA 33 2.2.6.1 Tách chiết DNA xạ khuẩn đệm CTAB 33 2.2.62 Khuếch đại gen 16S - rRNA phản ứng PCR 34 2.2.6.3 Phƣơng pháp điện di gel agarose 35 2.2.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 36 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập khiết chủng nấm gây bệnh chè 37 3.2 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn 38 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN 3.2.1 Hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn 38 3.2.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có HTKN cao 41 3.3 Đặc điểm sinh học đặc điểm phân loại chủng XK Đ1 R2 42 3.3.1 Đặc điểm hình thái 42 3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy 43 3.3.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa .45 * Khả đồng hóa nguồn cacbon .45 * Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp 46 * Khả chịu muối 46 * Khả sinh enzym ngoại bào 47 3.3.4 Hoạt tính kháng sinh chủng R2 Đ1 48 3.3.5 Vị trí phân loại hai chủng xạ khuẩn R2 Đ1 50 3.4 Khả sinh tổng hợp CKS chủng xạ khuẩn lựa chọn 52 3.4.1 Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp 52 3.4.2 Ảnh hƣởng nguồn cacbon 54 3.4.3 Ảnh hƣởng nguồn nitơ 56 3.5 Phân loại chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử 57 3.5.1 Kết tách chiết DNA tổng số chủng xạ khuẩn 57 3.5.2 Kết nhân gen 16S - rRNA phản ứng PCR 58 Chƣơng - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận .60 Kiến nghị nghiên cứu 61 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 XK : Xạ khuẩn VSV : Vi sinh vật CKS : Chất kháng sinh HSCC : Hệ sợi chất HSKS : Hệ sợi khí sinh KTKS : Khuẩn ty khí sinh HTKS : Hoạt tính kháng sinh HTKN : Hoạt tính kháng nấm MT : Môi trƣờng KHVQH : Kính hiển vi quang học KHVĐT : Kính hiển vi điện tử DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid ISP : International Streptomyces Project TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid SDS : Sodiumdodecyl sulfat TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Đặc điểm số mẫu chè làm nguồn phân lập chủng nấm 37 Bảng 3.2 Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu 39 Bảng 3.Tính đối kháng xạ khuẩn với chủng nấm gây bệnh chè .40 Bảng Hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn 41 Bảng 3.5 Đặc điểm nuôi cấy chủng R2 Đ1 .44 Bảng 3.6 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn Đ1 R2 45 Bảng 3.7 Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp chủng R2 Đ1 46 Bảng 3.8 Khả chịu muối chủng R2 Đ1 47 Bảng 3.9 Hoạt tính kháng sinh chủng R2 Đ1 với chủng nấm kiểm định .48 Bảng 3.10 So sánh đặc điểm phân loại chủng R2 với S misawaensis 50 Bảng 3.11 So sánh đặc điểm phân loại chủng Đ1 với A brunneofungu.52 Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn môi trƣờng lên men khác 53 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng nguồn cacbon lên khả sinh tổng hợp CKS chủng R2 Đ1 55 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng nguồn nitơ lên khả sinh tổng hợp CKS chủng R2 Đ1 .56 Trang Hình 3.1 Ba chủng nấm phân lập từ mẫu chè bị bệnh 38 Hình Tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu .39 Hình 3.3 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm .40 Hình 3.4 Hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn lựa chọn 42 Hình 3.5 Cuống sinh bào tử bề mặt bào tử chủng R2 42 Hình 3.6 Cuống sinh bào tử bề mặt bào tử chủng Đ1 .43 Hình 3.7 Khả hình thành sắc tố melanin chủng 44 Hình 3.8 Hoạt tính enzym chủng xạ khuẩn .47 Hình 3.9 Hoạt tính kháng chủng nấm kiểm định chủng Đ1 R2 49 Hình 3.10: Ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả tổng hợp CKS 54 Hình 3.11: Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả tổng hợp CKS .55 Hình 3.12 : Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả tổng hợp CKS 57 Hình 3.13 Ảnh điện di DNA tổng số chủng xạ khuẩn .58 Hình 3.14 Ảnh điện di sản phẩm PCR chủng xạ khuẩn nghiên cứu 59 -1- -22 Mục tiêu nghiên cứu đề tài MỞ ĐẦU - Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có Đặt vấn đề Việt Nam nước nông nghiệp nằm vùng nhiệt đới nóng ẩm hoạt tính kháng nấm gây bệnh chè Mưa điều kiện thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt VSV gây - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học đặc điểm phân loại bệnh thực vật Vì việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật từ lâu phổ số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng biến Việt Nam Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường độc hại dụng tồn dư đất, nước nông sản ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức Đối tƣợng nội dung nghiên cứu đề tài khoẻ người, gây ô nhiễm môi trường cân sinh thái Chính vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương FAO năm 1992 khẳng định đấu tranh sinh học tảng chương trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế phát triển quần thể ký sinh Một hướng nghiên cứu theo xu hướng sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế quần thể VSV gây bệnh Trong số tác nhân sinh học thường sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn nhóm có nhiều tiềm tỷ lệ loài có khả sinh CKS cao, có nhiều CKS có khả chống nấm mạnh Thái nguyên tỉnh giàu tiềm nông, lâm nghiệp Trong chè loại chủ đạo hàng năm bệnh nấm gây thiệt hại nặng nề, làm giảm suất chất lượng sản phẩm Vì việc tìm kiếm chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng sinh chống * Đối tượng nghiên cứu - Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Thái Nguyên - Các chủng vi nấm gây bệnh chè Thái Nguyên * Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng nấm gây bệnh chè để sử dụng làm VSV kiểm định Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm từ mẫu đất khác Nghiên cứu số đặc điểm sinh học đặc điểm phân loại số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh lựa chọn Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến khả tạo thành CKS chủng lựa chọn nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật xây dựng nông nghiệp an toàn bền vững Xuất phát từ lý trên, từ xu hướng nghiên cứu giới để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô phong phú Thái Nguyên Chúng thực đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên” Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -3- -4amylaza, xenluloza…một số axit amin axit hữu Một số xạ khuẩn Chƣơng gây bệnh cho người, động vật [7] TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.2 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn * Khuẩn lạc 1.1 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN Đặc điểm bật xạ khuẩn có hệ sợi phát triển, phân nhánh 1.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân mạnh vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử hình thành bào tử) Hệ bố rộng rãi tự nhiên Chúng có đất, nước, rác, phân chuồng, sợi xạ khuẩn mảnh nấm mốc với đường kính thay đổi khoảng bùn, chí chất mà vi khuẩn nấm mốc không phát triển 0,2 Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức m đến m, chiều dài đạt tới vài cm [10],[22] Kích thước khối lượng hệ sợi thường không ổn định phụ thuộc vào điều kiện sinh lý nuôi cấy Kích thước hệ sợi xạ khuẩn độ canh tác thảm thực vật Theo Waksman gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 đặc điểm phân biệt khuẩn lạc xạ khuẩn khuẩn lạc nấm mốc hệ sợi nấm mốc có đường kính lớn, thay đổi từ mầm xạ khuẩn, chiếm - 45% tổng số VSV [43] Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, 50 m, dễ quan sát mắt thường chúng có nhiều lớp đất trung tính kiềm yếu axit yếu 6,8 - 7,5 Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng Xạ khuẩn có lớp đất kiềm axit lớp đất nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, kiềm, số lượng xạ khuẩn đất thay đổi theo thời gian năm da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài điều kiện ngoại cảnh Một đặc tính quan trọng xạ khuẩn khả hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả Kích thước hình dạng khuẩn lạc thay đổi tuỳ loài tuỳ vào điều kiện nuôi cấy thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính khuẩn lạc chừng 0,5 sinh chất kháng sinh Cho tới khoảng 8000 chất kháng sinh biết giới có tới 80% xạ khuẩn sinh [6] Trong số có 15% có nguồn gốc từ loại xạ khuẩn Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, mm có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm lớn Khuẩn lạc có lớp, lớp vỏ có dạng sợi bện chặt, lớp tương đối xốp, lớp có cấu trúc tổ ong Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng ý xạ khuẩn Khuẩn ty lớp có chức sinh học khác Các sản cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị dùng y học phẩm trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi hữu cơ…có thể tích luỹ sinh khối tế bào xạ khuẩn hay Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào trình chuyển hoá tiết môi trường nhiều hợp chất đất, nước Dùng để sản xuất nhiều enzym proteaza, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -5- -6- * Khuẩn ty Bào tử xạ khuẩn bao bọc màng muco polysaccharide giàu Trên môi trường đặc, hệ sợi xạ khuẩn phát triển thành loại: protein với độ dày khoảng 300 400 A0 chia lớp Các lớp tránh cho bào loại cắm sâu vào môi trường gọi hệ sợi chất (khuẩn ty chất substrate tử khỏi tác động bất lợi điều kiện ngoại cảnh nhiệt độ, mycelium) với chức chủ yếu dinh dưỡng Một loại phát triển bề pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử cấu trúc màng bào tử mặt thạch gọi hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức tính trạng tương đối ổn định đặc điểm quan trọng dùng phân loại chủ yếu sinh sản xạ khuẩn Tuy nhiên tính trạng có thay đổi Nhiều loại có hệ sợi chất có loại (như chi Sporichthya) lại có hệ sợi khí sinh Khi HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng định nuôi cấy môi trường có nguồn nitơ khác [13] Muốn kích thích hình thành bào tử trước hết phải kích thích sinh trưởng khuẩn ty khí sinh Nếu môi trường giàu dinh dưỡng Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn giai đọan phát triển 11 m/giờ trình sinh bào tử thường bị kìm hãm Trong nhiều trường hợp kích thích [43] chất nhân tế bào xạ khuẩn xếp đặn theo chiều dài sợi hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm Do đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện 1.1.4 Cấu tạo xạ khuẩn thuận lợi trương lên, sau - xuất trình tổng hợp ARN, Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn Gram dương, toàn nhân gene cần thiết từ genom tiến hành tổng hợp protein, thể tế bào bao gồm thành phần chính: thành tế bào, màng sợi hình thành phát triển Một số xạ khuẩn có sinh nang bào tử bên sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân thể ẩn nhập chứa bào tử nang [7] Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác 1.1.3 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn dụng trì hình dáng khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm lớp: Bào tử xạ khuẩn hình thành nhánh phân hóa khuẩn ty Lớp dày khoảng 60 120A0, già đạt tới 150 khí sinh - gọi cuống sinh bào tử Đó quan sinh sản đặc trưng cho xạ 200A0, lớp rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp dày khoảng 50A0 Các khuẩn Hình thái, cuống sinh bào tử bào tử đặc điểm quan trọng lớp chủ yếu cấu tạo từ lớp glucopeptide bao gồm gốc N - axetyl phân loại xạ khuẩn glucozamin liên kết với N - axetyl muramic liên kết 1,4 - Cuống sinh bào tử xạ khuẩn có dạng thẳng lượn sóng (RF), Khi xử lý lyzozym, liên kết 1,4 - glucozit glucozit bị cắt đứt, thành tế bào dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển xoắn đơn giản có bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi bị phá huỷ hình móc câu (RA) Bào tử hình thành đồng thời tất chiều dài xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom dung môi hoà tan lipit cuống sinh bào tử theo cách: kết đoạn hay cắt khúc thường có hình trụ, khác Nguyên nhân lớp có cấu tạo chủ yếu lipit (thành ovan, cầu, que với mép nhẵn xù xì, có gai gai phát triển dài thành HSKS có nhiều lipit so với HSCC) khác với nấm Thành tế bào xạ khuẩn dạng lông [9] không chứa xenllulose kitin chứa nhiều enzym tham gia vào Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -7- -8- trình trao đổi chất trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [25],[30], chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với kháng sinh, chuyển [32], [35] [36] gene, sản xuất chất kháng sinh đất môi trường tuyển chọn [3] Căn vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn chia thành Xạ khuẩn thuộc loại thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng đường, tinh bột, rượu nhiều chất hữu khác Nguồn nitơ hữu nhóm [6], [8] Nhóm I: Thành phần thành tế bào axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm Nhóm II: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 - protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô nitrat, muối amôn…Khả đồng hoá chất loài hay chủng xạ khuẩn khác khác 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI diaminopimelic (m - ADP) glyxin Nhóm III: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 - Cùng với phát triển mạnh sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học nên việc định tên chủng xạ khuẩn tiến hành tương đối nhanh diaminopimelic Nhóm IV: Thành phần thành tế bào axit meso - 2,6 - chóng xác với nhiều phương pháp phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh Song người ta chủ yếu dựa vào đặc điểm hình diaminopimelic, arabinose galactose Dưới lớp thành tế bào màng sinh chất dày khoảng 50 nm cấu tạo chủ yếu thành phần photpholipit protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trình trao đổi chất trình hình thành bào tử xạ khuẩn thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học sinh học phân tử 1.2.1 Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho chủng xạ khuẩn cần định Nguyên sinh chất nhân tế bào xạ khuẩn khác biệt lớn so loại biểu đầy đủ đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng với tế bào vi khuẩn Trong nguyên sinh chất xạ khuẩn chứa mezoxom môi trường dinh dưỡng khác điều kiện nhiệt độ thời gian thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm định Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh ghi lại đặc điểm hình sudan III hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol) thái nuôi cấy xạ khuẩn, đặc biệt quan mang bào tử, hình dạng Tuy nhiên, điểm khác biệt xạ khuẩn so với sinh vật prokaryote chỗ chúng có tỷ lệ G + C cao DNA, thường lớn 55%, vi khuẩn tỷ lệ 25 bề mặt bào tử Theo Pridham cộng [38], cuống sinh bào tử chia thành nhóm: RF cho cuống sinh bào tử thẳng lượn sóng RA cho cuống 45% [11] Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên yếu tố di truyền nhiễm sắc thể có yếu tố di truyền nhiễm sắc thể, chúng có sinh bào tử xoắn, thô sơ ngắn S cho cuống sinh bào tử phát triển mạnh xoắn thể tự nhân lên mà Lederberg gọi plasmid Các plasmid đem lại cho tế Việc sử dụng đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy coi bào nhiều đặc tính chọn lọc quý có thêm khả phân giải số hợp liệu dùng phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên ta biết Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn -9- -10- xạ khuẩn không bền vững mặt di truyền, thường xuyên xảy Trong phân loại xạ khuẩn typ thành tế bào đặc điểm quan trọng xếp lại phân tử DNA Trong loài biểu khác Khi muốn đưa loài mô tả loài có ý nghĩa đó, hình thái hay loài khác giống mặt hình thái Vì người ta không xác định thành tế bào để phân loại xác, ngày người ta phải dùng thêm 1.2.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa tiêu khác bổ sung đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt đặc học phân tử [45] điểm sinh lý, sinh hóa khác khả đồng hóa nguồn cacbon nitơ, 1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) nhu cầu chất kích thích sinh trưởng, khả biến đổi chất khác Đặc điểm hóa phân loại sử dụng rộng rãi hiệu vòng nhờ hệ thống enzym Nhu cầu oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả 20 năm trở lại Đây phương pháp có hiệu thông qua việc chịu muối yếu tố khác môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm định tính định lượng thành phần hóa học tế bào VSV sinh trưởng phát triển khác nhau, tính chất đối kháng nhạy cảm với chất Hóa phân loại chủ yếu dựa vào đặc điểm sau: kháng sinh, khả tạo thành chất kháng sinh sản phẩm trao đổi chất - Typ thành tế bào dựa sở phân tích axit amin thành phần peptit đường thành tế bào hay polysaccarit gắn vào thành tế bào đặc trưng khác xạ khuẩn Hopwood (1975) khẳng định phần lớn đặc điểm sinh lý - sinh - Typ peptidoglycan (PG) dựa vào thông tin thành phần cấu hóa đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động có giá trị thấp mặt phân trúc mạch tetrapeptit PG cầu nối peptit liên kết mắt loại Do tính không ổn định biến dị cao xạ khuẩn mà ngày xích PG nguyên tắc sử dụng đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn - Axit mycolic phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium cornebacter Đây đặc điểm phân loại cho chi phải thay đổi [29] 1.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy) Để phát loài sở khác đặc điểm sinh - Axit béo thường sử dụng phân loại axit béo bão hòa lý, sinh hóa người ta sử dụng kết dựa phân loại số mạch thẳng không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso enteiso metyl Phương pháp dựa đánh giá số lượng mức độ giống hóa nguyên tử cacbon thứ 10 Sự có mặt axit 10 - metylloctade canoit VSV theo số lớn đặc điểm chủ yếu đặc điểm hình (axit tubereulostearinoic) đặc điểm để phân loại đến chi [11] thái, sinh lý, sinh hóa - Photpholipit có typ photpholipit (P I, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn Để so sánh chủng xạ khuẩn với đôi một, người ta vào hệ số giống (hệ số S - Similarity) có công thức tính hệ số S hay sử dụng - Công thức Sokal Michener (SSM ) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -39- -40- Bảng 3.2 Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu Nhóm màu xạ khuẩn Kết bảng 3.2 cho thấy: số lượng chủng có hoạt tính nhiều Các chủng có Tỷ lệ chủng có nhóm trắng chiếm 36,7%, sau nhóm xám - 26,7%, nhóm xanh - HTKN HTKN so với tổng 25,3%, nhóm hồng - 6,7% nhóm nâu lục chiếm 3,3% Số lượng Tỷ lệ(%) số (%) Kết phù hợp với nghiên cứu số tác giả trước [14],[18] Trắng (Allbus) 11 36,7 13,7 Xám (Griseus) 26,7 10,0 Xanh (Azeureus) 23,3 8,6 xạ khuẩn với chủng nấm gây bệnh chè có khác (bảng 3.3) Hồng (Roseus) 6,7 2,6 Bảng 3 Tính đối kháng xạ khuẩn với chủng nấm gây bệnh chè Nâu (Chromogenes) 3,3 1,3 Lục (Viridis) 3,3 1,3 Tổng cộng 30 100 37,5 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm phân chia theo nhóm màu Shirling Gottlieb [37] Kết thể bảng 3.2 hình 3.2 Đồng thời nhận thấy khả đối kháng chủng chủng nấm gây bệnh chè Chủng XK Kháng có HTKN CT - 1A CT - 2E CT - 5X Số lượng 16 13 Tỷ lệ (%) 30 53 43 13,3 chủng Trong tổng số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, số chủng kháng nấm CT - 2E cao nhất, có 16 chủng (chiếm 53% ), số chủng kháng nấm CT - 5X, có 13 chủng (chiếm 43%) chủng kháng nấm CT - 1A có chủng (chiếm 30%) Hình Tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.3 Tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -41- -42- Đáng ý số đó, có chủng có khả kháng chủng nấm, chiếm tỷ lệ 13,3%, chủng lại phần lớn kháng đến chủng nấm Tỷ lệ chủng kháng nấm thể hình 3.3 3.2.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có HTKN cao D1 R2 D1 R2 Sau tuyển chọn sơ 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, chọn chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh ký hiệu ĐC ĐC là: Đ1 R2 Ở bước này, chủng nuôi lắc môi trường dịch thể ISP - để thu dịch nuôi cấy Kết kiểm tra hoạt tính dịch nuôi cấy theo phương pháp đục lỗ với chủng nấm thể bảng 3.4 VSV kiểm định: CT - 5X VSV kiểm định: CT - 2E Hình 3.4 Hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn lựa chọn 3.3 Đặc điểm sinh học đặc điểm phân loại chủng XK Đ1 R2 hình 3.4 Bảng Hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn Chủng Hoạt tính kháng nấm (D- d, mm) xạ khuẩn CT - 1A CT - 2E CT - 5X Đ1 12 14 15 R2 12 16 17 3.3.1 Đặc điểm hình thái Chủng R2 có cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử có dạng gai Chủng Đ1 có cuống sinh bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử xù xì Kết bảng 3.4 cho thấy: chủng xạ khuẩn lựa chọn giữ hoạt tính kháng nấm, song mức độ kháng chủng nấm có khác Khả kháng nấm CT - 1A chủng xạ khuẩn yếu khả kháng chủng CT - 5X chủng xạ khuẩn cao Chúng tiếp tục tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn Đ1 R2 Hai chủng xạ khuẩn thuộc hai nhóm màu khác Chủng Đ1 thuộc nhóm màu trắng chủng R2 thuộc nhóm Hình Cuống sinh bào tử bề mặt bào tử chủng R2 màu nâu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -43- -44Bảng 5: Đặc điểm nuôi cấy chủng R2 Đ1 Chủng Đ1 Môi Chủng R2 trƣờng HSCC HSKS Sắc tố HSCC HSKS Sắc tố ISP - Trắng Trắng Không màu Nâu Trắng Không màu ISP - Trắng Trắng Không màu Nâu Xám ghi Không màu ISP - Trắng Trắng Không màu Xám ghi Không màu ISP - Xám Trắng Không màu Trắng Xám Không màu ISP - Trắng Trắng Không màu Trắng Trắng ghi nâu ghi xanh ISP - Trắng Vàng Không màu Nâu ISP - Trắng Trắng Không màu Nâu Hình 3.6 Cuống sinh bào tử bề mặt bào tử chủng Đ1 3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy Xạ khuẩn nuôi cấy môi trường khác để quan sát khả sinh trưởng xạ khuẩn màu sắc hệ khuẩn ty Kết cho thấy xạ khuẩn đa dạng màu sắc nuôi cấy môi trường khác Tùy theo thành phần môi trường nuôi cấy mà màu sắc khuẩn ty chất khuẩn ty khí sinh hay sắc tố hòa tan tiết khác Các đặc điểm nuôi cấy chủng R2 Đ1 trình bày bảng 3.5 cho thấy: Trắng ngà Xám ghi (yếu) Xám ghi Không màu Melanin Nâu * Khả hình thành sắc tố melanin Chủng R2 Đ1 nuôi cấy môi trường ISP - nhiệt độ 300C Sau 14 ngày quan sát nhận thấy: Đối với chủng Đ1: nuôi cấy môi trường ISP - 1, ISP - 2, ISP - 3, ISP - 5, ISP - màu sắc KTKS KTCC có màu trắng Trên môi trường ISP - màu sắc HSCC có màu xám HSKS có màu trắng Ở môi trường ISP - màu sắc HSKS có màu vàng HSCC có màu trắng Đối với chủng R2: màu sắc HSCC HSKS có đa dạng nuôi cấy môi trường ISP khác Chủng R2 Chủng Đ1 Hình 3.7 Khả hình thành sắc tố melanin chủng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -45- -46- Đối với chủng Đ1 màu sắc môi trường biến đổi, tức Kết bảng 3.6 cho thấy: Cả chủng xạ khuẩn nghiên cứu có khả đồng hóa tốt khả hình thành sắc tố melanin Đối với chủng R2 màu sắc môi trường biến đổi từ màu vàng nhạt nguồn cacbon khác Song chủng R2 đồng hóa tốt nguồn cacbon là: sang màu nâu đậm, điều có nghĩa chủng R2 có khả hình thành sắc Glucose, Lactose, Manitol, Dextrin sinh trưởng yếu môi trường tố melanin môi trường có chứa sắt có chứa nguồn cacbon Cellulose 3.3.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa Đối với chủng Đ1 có khả đồng hóa tốt nguồn cacbon Glucose, * Khả đồng hóa nguồn cacbon Saccharose, Fructose, Manitol khả đồng hóa nguồn Để đánh giá khả đồng hóa nguồn cacbon khác nhau, tiến hành nuôi chủng R2 Đ1 môi trường ISP - có bổ sung nguồn cacbon khác với nồng độ 1% Sau - 14 ngày nuôi cấy, kết thể bảng cacbon Lactose, Arabinose * Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp Chủng R2 Đ1 nuôi thang nhiệt độ khác Khả sinh trưởng chủng thể bảng 3.7 Bảng 3.6 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn Đ1 R2 Bảng 7: Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp chủng XK Nhiệt độ Nguồn cacbon Chủng Mức độ sinh trƣởng 250 280 300 320 350 400 Chủng Đ1 Chủng R2 R2 + +++ +++ ++ + + Glucose ++++ ++++ Đ1 ++ +++ +++ + + - Saccharose ++++ ++ Fructose ++++ ++ Lactose - ++++ Manitol ++++ ++++ Dextrin ++ ++++ Cellulose + + Arabinose - +++ Ghi chú: ++++: Sinh trưởng tốt; +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng yếu; +: Sinh trưởng yếu; - :Không sinh trưởng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Ghi chú: +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng Kết bảng 3.6 cho thấy, hai chủng R2 Đ1 có khả sinh trưởng khoảng nhiệt độ từ 250 - 320C, chủng R2 sinh trưởng tốt nhiệt độ 280 - 300C sinh trưởng yếu nhiệt độ 350 - 400C Chủng Đ1 sinh trưởng tốt nhiệt độ 280 - 300C không sinh trưởng nhiệt độ 400C Như nhiệt độ thích hợp cho chủng phát triển tốt 28 - 300C * Khả chịu muối Hai chủng R2 Đ1 nuôi cấy môi trường ISP - có bổ sung NaCl nồng độ 0,5; 3; 7; 9; 11; 12 0% đối chứng Kết thu bảng 3.8 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -47- -48- Bảng 3.8: Khả chịu muối chủng R2 Đ1 Trong trình sống, để phân giải hợp chất hữu phức tạp thành Nồng độ NaCl hợp chất đơn giản hấp thu Xạ khuẩn có khả tiết vào (%) 0,5 12 môi trường enzym ngoại bào Chúng tiến hành kiểm tra khả chủng xạ khuẩn Chủng R2 +++ + ++ + + - - nghiên cứu, kết thể hình 3.8 cho thấy chủng xạ khuẩn Đ1 +++ ++ + + + - - có khả thủy phân mạnh casein, tinh bột CMC Ghi chú: +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; 3.3.4 Hoạt tính kháng sinh chủng R2 Đ1 Hoạt tính kháng sinh xạ khuẩn tiêu phân +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng Nồng độ muối có ảnh hưởng đến khả sinh trưởng xạ khuẩn loại Cùng với việc nghiên cứu khả kháng nấm gây bệnh chè Kết trình bày bảng 3.8 cho thấy: chủng có khả sử dụng Chúng kiểm tra khả kháng số chủng nấm kiểm định gây nồng độ muối tới 9% , nồng độ muối cao thi chủng không phát bệnh thực vật nêu mục 2.1.1.3 Kết thể bảng triển Như nồng độ muối 0,5% chủng xạ khuẩn R2 Đ1 có 3.9 hình 3.9 tác dụng kích thích sinh trưởng Bảng 3.9: Hoạt tính kháng sinh chủng R2 Đ1 với chủng nấm * Khả sinh enzym ngoại bào kiểm định Chủng ĐC R2 D1 Hoạt tính kháng sinh (D - d, mm) xạ khuẩn F oxysporum F moniliforme R solani R2 22 15 17 Đ1 18 19 D1 ĐC R2 Kết bảng 3.9 cho thấy: chủng R2 có phổ ức chế VSV kiểm CMC Casein định rộng, có khả kháng loại nấm Tuy nhiên chủng R2 có khả kháng nấm F oxysporum mạnh với vòng ức chế 22 mm, với nấm R solani 17 mm nấm F moniliforme 15 mm (hình 3.9) Chủng Đ1 có hoạt tính chống nấm F oxysporum F moniliforme R2 D1 mà khả kháng nấm R solani ĐC Tinh bột Hình 3.8 Hoạt tính enzym chủng xạ khuẩn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -49- -50- Khả đối kháng chủng VSV với đặc điểm hình 3.3.5 Vị trí phân loại hai chủng xạ khuẩn R2 Đ1 thái, sinh lý, sinh hóa dùng để tham khảo phân loại chủng xạ * Phân loại chủng R2 khuẩn Bảng 3.10 So sánh đặc điểm phân loại chủng R2 với S misawaensis Từ kết nghiên cứu cho thấy chủng xạ khuẩn Đ1 R2 khả kháng nấm gây bệnh chè mà có khả Đặc điểm phân loại Hình dạng cuống kháng nấm gây bệnh thực vật F oxysporum, F moniliforme, R solani Hình thái F.oxysporum m sinh bào tử Bề mặt bào tử Môi trường Khả sinh ISP - melanin Chủng R2 R2 VSV kiểm định: F oxysporum Xoắn (S) Có gai ngắn Có gai ngắn Có Có ĐC Môi trường tinh Vàng nâu Màu KTKS Xám Sắc tố tan Vàng nhạt KTCC Nâu ghi Nâu ghi KTKS Trắng hồng Trắng hồng Sắc tố tan Melanin Melanin Có Acwaimycin bột F oxysporum F moniliforme Môi trường Czapek Glycerin Sinh kháng sinh D1 Vàng vàng Màu KTCC R2 F monilforme VSV kiểm định: ĐC S misawaensis Xoắn (S) D1 D1 Loài chuẩn nâu Xám xám trắng Vàng đến vàng nâu Đối chiếu với khóa phân loại xạ khuẩn Gause, 1983 [49] Chúng VSV kiểm định: R solani ĐC nhận thấy chủng R2 có nhiều đặc điểm giống với loài S misawaensis Kết R2 so sánh đặc điểm chủng R2 với loài S misawaensis trình bày bảng 10 R solani Chủng R2 có cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử có gai ngắn Hình 3.9 Hoạt tính kháng chủng nấm kiểm định chủng Đ1 R2 Khi nuôi cấy môi trường tinh bột màu sắc KTCC từ màu trắng đến Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn -51- -52- vàng nâu, màu sắc KTKS biến đổi thành màu xám xám trắng Trên Như vậy, chủng Đ1 thuộc loài A brunneofungus, nhóm Albus, môi trường Czapek Glycerin màu sắc KTKS từ màu trắng biến đổi thành seri: albocolorabus Chủng Krasilnikov et al, màu trắng hồng, KTCC biến đổi thành màu nâu ghi Chủng R2 có khả 1971[48] sinh sắc tố melanin môi trường có chứa sắt Bảng 3.11 So sánh đặc điểm phân loại chủng Đ1 với A.brunneofungus Khi so sánh đặc điểm phân loại chủng R2 với loài chuẩn S misawaensis khóa phân loại Gauze, 1983 Chúng nhận thấy Đặc điểm phân loại chủng R2 có nhiều đặc điểm giống với loài hình thái, cuống sinh bào Hình dạng cuống tử, bề mặt bào tử, đặc điểm nuôi cấy, khả hình thành sắc tố melanin Hình thái CKS Như vậy, chủng R2 thuộc loài S misawaensis, nhóm Cinereus, seri: chromogenes Chủng Hamada et Okami, mô tả vào Khi nuôi cấy môi trường Gause - I, màu sắc KTCC từ màu Gauze - II KTCC từ màu trắng biến đổi thành màu nâu vàng, màu KTKS có màu Czapek gluco trắng ánh kem Chủng Đ1 khả hình thành sắc tố melanin Đối chiếu với khóa phân loại Gauze, 1983, nhận thấy sóng Không Màu KTCC Vàng nâu Vàng nâu Màu KTKS Trắng Trắng Sắc tố tan Không Không có Màu KTCC Không màu Không màu Màu KTKS Nâu Nâu Sắc tố tan Không Không Màu KTCC Nâu vàng Màu KTKS Trắng ánh kem Trắng ánh kem Sắc tố tan Yếu Yếu Có Flavofungina môi trường Gause - II, màu sắc KTKS từ màu vàng biến đổi thành màu nâu, KTCC màu Trên môi trường Czapek Glucoza, màu sắc Thẳng lượn Không melanin thấy: chủng Đ1 có cuống sinh bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử xù xì A.brunneofungus Xù xì ISP - Gauze - I Thẳng (RF) Loài chuẩn Xù xì Khả sinh * Phân loại chủng Đ1 vàng nhạt biến đổi thành màu vàng nâu, màu sắc KTKS có màu trắng Trên Bề mặt bào tử Môi trường năm 1968c [28] Đặc điểm phân loại chủng Đ1 thể bảng 3.11 cho sinh bào tử Chủng Đ1 mô tả vào năm Sinh kháng sinh Nâu nâu vàng chủng Đ1 có nhiều đặc điểm giống với loài Actinomyces brunneofungus đặc điểm hình thái, cuống sinh bào tử, khả hình thành sắc tố melanin đặc điểm nuôi cấy, khả hình thành CKS chống nấm 3.4 Khả sinh tổng hợp CKS chủng xạ khuẩn lựa chọn 3.4.1 Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp Trong công nghệ lên men, môi trường lên men đóng vai trò quan trọng Một môi trường lên men tốt phải môi trường vừa thuận lợi cho chủng sinh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -53- -54- trưởng tốt vừa cho hiệu suất kháng sinh cao Để lựa chọn môi trường lên men đáp ứng hai điều kiện trên, sử dụng loại môi trường lên men sở là: A - 4H, A - 4, Gause - I, Gause - II ISP - Quá trình lên men tiến hành bình nón dung tích 250 ml có chứa 25ml môi trường Sau 120 nuôi lắc nhiệt độ 280C - 300C, thu dịch lên men, xác định HTKS phương pháp đục lỗ Kết thể bảng 3.12 hình 12 Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn môi trƣờng lên men khác Chủng XK Môi trƣờng R2 Đ1 Hình 3.10: Ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả tổng hợp CKS Kết bảng 3.12 hình 3.10 cho thấy: Trong môi trường lên Sinh khối (mg/ml) HTKS (D-d,mm) A - 4H 8,34 ± 0,12 22,33 ± 1,42 A-4 4,6 ± 0,15 19,52 ± 0,48 Gauze - I 5,51 ± 0,23 17,65 ± 0,58 (21mm) Từ kết chứng tỏ thành phần môi trường lên Gauze - II 7,52 ± 0,21 13,93 ± 0,13 men có ảnh hưởng nhiều đến khả hình thành CKS xạ khuẩn ISP - 3,19 ± 0,15 12,18 ± 0,15 nhiều nghiên cứu trước khẳng định [14],[17] A - 4H 9,24 ± 0,23 21,34 ± 0,21 A-4 4,43 ± 0,18 18,72 ± 0,17 sinh tổng hợp CKS, vào kết nhận thấy môi trường Gauze - I 6,48 ± 0,33 16,23 ± 0,44 A - 4H thích hợp sử dụng cho nghiên cứu Gauze - II 7,25 ± 0,22 9,14 ± 0,34 3.4.2 Ảnh hƣởng nguồn cacbon ISP - 2,78 ± 0,26 7,25 ± 0,14 men chủng nghiên cứu cho sinh khối lớn môi trường A - 4H Với chủng R2 8,0 mg/ml, chủng Đ1 9,0 mg/ml Đồng thời dịch lên men môi trường A - 4H có hoạt tính kháng sinh mạnh Với mục đích lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho trình Các hợp chất cacbon vừa nguồn dinh dưỡng lại vừa nguồn cung cấp lượng cho thể VSV nói chung xạ khuẩn nói riêng có khả sử dụng nhiều nguồn cacbon khác Để nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả sinh trưởng hình thành CKS, đồng thời xác định nguồn cacbon thích hợp cho chủng R2 Đ1, tiến hành khảo sát số nguồn cacbon thông thường sử dụng để lên men CKS Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -55- -56- Bảng 3.13 Ảnh hƣởng nguồn cacbon lên khả sinh tổng hợp CKS chủng R2 Đ1 Các Ký hiệu tiêu chủng Sinh R2 khối HTKS Nitơ nguồn dinh dưỡng thiếu VSV nói chung xạ khuẩn nói riêng Trong môi trường lên men, nguồn nitơ có ảnh hưởng nhiều Nguồn cacbon Glucose Tinh bột 3.4.3 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến tổng hợp CKS xạ khuẩn [3] Lactose Sacarose 17,44 ± 0,22 16,23 ± 0,42 13,58 ± 0,56 18,93 ± 0,57 Nguồn nitơ sử dụng môi trường lên men xạ khuẩn Đ1 18,53 ± 0,45 15,75 ± 0,33 11,55 ± 0,15 17,26 ± 0,34 dạng vô hữu Vì tiến hành khảo sát ảnh hưởng R2 15,24 ± 0,36 18,21 ± 0,32 20,23 ± 0,61 21,22 ± 0,78 nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp CKS chủng xạ khuẩn Đ1 17,53 ± 0,16 16,82 ± 0,58 16,34 ± 0,74 18,29 ± 0,65 nghiên cứu Bảng 3.14 Ảnh hƣởng nguồn nitơ lên khả sinh tổng hợp CKS chủng R2 Đ1 Kết trình bày bảng 3.13 cho thấy: chủng xạ khuẩn R2 Đ1 có khả sử dụng nguồn đường nghiên cứu Tuy nhiên ảnh hưởng nguồn cacbon lên sinh trưởng khả tạo Nguồn nitơ kháng sinh chủng có khác Đối với chủng R2 nguồn cacbon Nồng Sinh khối Hoạt tính kháng sinh độ (mg/ml) (D-d,mm) (%) R2 Đ1 11,2 ± 0,32 R2 Đ1 sacarose cho sinh khối lớn HTKS mạnh Chủng Đ1 nguồn Bột đậu tương 12,6 ± 0,25 cacbon Glucose cho sinh khối lớn sacarose có HTKS mạnh Cao nấm men 13,52 ± 0,23 13,28 ±0,17 19,78 ± 0,26 19,73 ±0,52 (NH4 )2SO4 9,73 ± 0,18 8,01 ± 0,22 KNO3 7,82 ± 0,52 8,56 ± 0,24 16,92 ±0,32 14,34±0,17 21,63 ± 0,58 20,32 ±0,15 17,65 ± 0,44 16,82 ±0,38 Nguồn nitơ hữu sử dụng cao nấm men bột đậu tương, nguồn nitơ vô nitrat kali (KNO3) muối sunfat amon ((NH4 )2SO4.) Các nguồn nitơ bổ sung vào môi trường A - 4H Quá trình lên men tiến hành bình nón 250 ml có chứa 25 ml môi trường Sau 120 nuôi lắc, thu dịch lên men xác định HTKS Kết trình bày Hình 3.11: Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả tổng hợp CKS Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn bảng 3.14 hình 3.12 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -57- -58- Từ kết cho thấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu sinh trưởng tốt môi trường có nguồn nitơ hữu bột đậu tương cao nấm men Song chưa rõ có khác rõ rệt nguồn nitơ trình bày Kết tách chiết kiểm tra cách điện di gel agarose 0,8% trình bày hình 3.13 Đ1 R2 Hình 3.12 : Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả tổng hợp CKS Hình 3.13 Ảnh điện di DNA tổng số chủng xạ khuẩn Cũng sinh trưởng, HTKS chủng nghiên cứu cao Trên sở kết thu hình 3.13 cho thấy DNA môi trường có bột đậu tương cao nấm men Các kết tách từ chủng xạ khuẩn nêu Tương ứng với chủng, sản phẩm khẳng định ưu nguồn nitơ hữu lên khả sinh trưởng điện di có băng chứng tỏ DNA không bị đứt gãy sinh tổng hợp CKS xạ khuẩn nói chung Điều giải thích trình tách chiết Hàm lượng DNA thu tương đối lớn có độ nguồn nitơ hữu cơ, thành phần protein chứa chất cần thiết cao Như vậy, nói DNA thu trình tách chiết đạt cho trình tổng hợp CKS Kết nghiên cứu phù yêu cầu đề Sản phẩm DNA đáp ứng tốt cho nghiên cứu hợp với số kết công bố trước [14] khuếch đại gen 16S - rRNA phản ứng PCR 3.5 Phân loại chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử 3.5.2 Kết nhân gen 16S - rRNA phản ứng PCR 3.5.1 Kết tách chiết DNA tổng số chủng xạ khuẩn Để tạo tiền đề cho việc định loại chủng xạ khuẩn phân lập nêu Trong nghiên cứu này, tiến hành tách chiết DNA từ trên, nghiên cứu tiến hành khuếch đại gen 16S - rRNA chủng xạ khuẩn Đ1 R2 Trước tiến hành tách chiết DNA, chủng Đây gen thị dùng phổ biến định loại VSV Cặp mồi xạ khuẩn nuôi cấy môi trường tăng sinh để thu sinh khối tế bào thiết kế để khuếch đại cho phản ứng PCR cho phép khuếch đại trình tự DNA tách chiết theo phương pháp Ausubel cs có cải tiến [39] trọn vẹn gen 16S - rRNA, đảm bảo tốt cho nghiên cứu tách dòng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn -59- -60- xác định trình tự đầy đủ gen Kết khuếch đại gen trình bày Chƣơng hình 3.14 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ mẫu đất khác nhau, phân lập khiết 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, số có 30 chủng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh chè mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5% Trong số chủng có hoạt tính kháng nấm, nhóm trắng chiếm 36,7%, xám - 26,7%, xanh - 23,3%, hồng - 6,7%, nâu - 3,3%, lục - 3,3% Đã tuyển chọn chủng xạ khuẩn Đ1 R2 có hoạt tính mạnh số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, kháng chủng nấm gây bệnh chè CT - 2E CT - 5X, đồng thời có khả Hình 3.14 Ảnh điện di sản phẩm PCR chủng xạ khuẩn nghiên cứu M Maker ΦX174 cắt Hind III 3,4 chủng Đ1 5,6 Chủng R2 Dựa kết điện di hình 3.14 cho thấy chủng xạ khuẩn Đ1 kháng nấm kiểm định Đã tiến hành xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khuếch đại gen 16S - rRNA để nhận định: - Chủng R2 loài Streptomyces misawaensis R2 có nhân lên gen 16S - rRNA Sản phẩm PCR có độ đặc hiệu - Chủng Đ1 loài Actinomyces brunneofungus cao, sản phẩm phụ Mặt khác, dựa DNA maker chuẩn cho Đã xác định số điều kiện lên men thích hợp cho sinh thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1,5 kb tương ứng với kích thước theo tính toán lý thuyết trình lựa chọn mồi Như kết luận đoạn DNA nhân lên gen 16S - rRNA Kết sở quan trọng để tiếp tục tách dòng xác định trình tự đầy đủ gen 16S chủng nghiên cứu tổng hợp CKS chủng xạ khuẩn - Môi trường A - 4H thích hợp cho lên men tạo chất kháng sinh cho chủng xạ khuẩn Đ1 R2 - Nguồn cacbon thích hợp để tổng hợp CKS chủng R2 Sacarose chủng Đ1 glucose - Bột đậu tương cao nấm men nguồn nitơ hữu thích hợp cho lên men CKS chủng xạ khuẩn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -61- -62- KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Tiếp tục nghiên cứu để giải trình tự gene 16S hai chủng xạ khuẩn Đ1 R2 Bùi Thị Hà, Vi Thị Đoan Chính (2008), "Khả kháng nấm gây Tiếp tục nghiên cứu khả tổng hợp CKS hai chủng Đ1 R2 bệnh chè số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Thái Nguyên", Tạp Tách chiết xác định chất hóa học CKS chí khoa học công nghệ, số (46), tr 92 - 96 Tìm hiểu khả ứng dụng CKS thô cần khảo nghiệm diện rộng để đánh giá hiệu sử dụng công tác bảo vệ thực vật Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -63- -64- TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội, tr 39 - 41 TIẾNG VIỆT 11 Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn (2006), Kỹ thuật trồng,chăm 12 Nguyễn Thành Đạt (2000), Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp, Viện sinh 13 Nguyễn Thành Đạt, K.A Vinogradva V.A.Poltorac (1974), Tính biến thái tài nguyên sinh vật, Trung tâm khoa học Tự nhiên công nghệ dị bề mặt bào tử Xạ khuẩn sinh choromomycin, Act.A buraviensis, Quốc gia, Hà Nội, tr.53 - 71 microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia cccp Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, 14 chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam", Luận án tiến sĩ sinh học, Chi cục bảo vệ thực vật Phú Thọ, Sử dụng an toàn, hiệu thuốc Hà Nội 15 nấm phân lập từ đất Quảng Nam-Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ sinh học, Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo Hà Nội 16 chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces Việt Nam", Luận án Tiến sĩ, Hà Nội 17 Lê Gia Hy, Nguyễn Quỳnh Châu, Phạm Kim Duy, "Ảnh hưởng canxi coban lên khả sinh tổng hợp clotetraxyclin vitamin Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội B12 phương pháp lên men bề mặt", Tạp chí sinh học, số 4, 1992 18 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến (1977), Vi sinh vật học - tập II, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Lê Gia Hy cộng (1992), "Tính đối kháng xạ khuẩn phân lập từ đất Việt Nam bệnh đạo ôn", Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4, 11 - 12 19 vi sinh vật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 328 - 345 Lê Gia Hy (1994), "Nghiên cứu Xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội Đỗ Thu Hà (2004) Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống Nguyễn Hoàng Chiến (2000), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án TS Bùi Thị Việt Hà (2006), "Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội xanh cà chua, Luận văn thạc sĩ sinh học, Hà Nội yếu, Vietsciences, 15/02/2006 sóc chế biến chè, NXB Nông nghiệp, tr 72 - 77 bảo vệ thực vật chè, 07/2003, tr 24 - 30 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ Lê Mai Hương (1993), Nghiên cứu Xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập Hà Nội vùng phụ cận, luận án tiến sĩ, Hà Nội 20 Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -6521 -66- Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Xây dựng, Hà 32 Nội, tr.47-49 22 Center for Academic Scieties Japan Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất 33 xây dựng, Hà Nội, tr.47 - 49 34 Berdy,J (1974), "Recent development in antibiotic research and classification of antibiotic according to the chemical structure", Adv Demain A.L.A (1974), 35 "How antibiotic - producing science, 235, 601-602 26 Robert D Nolan, Thomas C (1988), "Isolation and Screeming of Actinomycetes" In Actinomycetes in Biotechnology, Academic Press, london 36 microorganism avoid suicide" Annuals of the New York academy of 25 Porter N, (1995), "Culture conditional for antibiotic - producing icroorganisms", Methods in enzymol, XVIII, - 23 Appl.Microbiol, 18 309 - 406 24 Newman D.J, Cragg G.M, Snader K.M, (2003), Natural products as ourees of new drugs over the period", J Nat Prod, 66, 1022 - 1037 TIẾNG ANH 23 Miyadoh S (2001), Identification manual of Actinomycetes, Business Sezaki M, Miyadoh S, (2001), "Practically used Antibiotics and their related substances", In Indentification Manual of Actinomycetes, Japan 37 Shirling E.B, Gotilieb D (1966), " Methods for characterization of Demain A.L.A - Fang (1995) "Emerging concept of secondary Streptomyces metabolism in actinomycetes", J Actinomycetologica, 9, 98 - 117 Bacteriology, Vol 16, No 3, 313 - 340 Furimai,T,K.Saitoh, M.Kakushima, S.Yamamuto, K.Suzuki, 38 spectes", International Journal of Systematic Shirling E.B, Gotilieb D, "Cooperative deription of type cultures of C.Ikeda,S Kobaru, M.Hatori and T.Oki, BSM - 181184, A new Streptomyces" V.Additional descriptions, International journual of pradimicins deverative, J Antibiotics 1993, N046 (2), p - 265 - 274 systematic Bacteriology Vol 22, 1972, p.265 - 394 27 Goldat S iu., 1958, Antibiotiki, N4, p.14-18 28 Hamada M., Okami Y 1968c In: Sazaki M., Hara T., Takeuchi T et A, Hopwood (2000), Practical Streptomyces genetics, The John al J Antibiot., A 21, p 37-44 Innes Foundation Norwich, p.170 - 171 29 39 Hopwood D.A and MJ Merrick, (1997), "Genetics of antibiotic 40 production" , J Bacteriol, pp 596 - 636 30 31 Tobias Kieser, Mervyn Bibb, Mark J Buttner Keith F Chater, David Tong chai K, Phuripun.L, Charan, C (1995), Antibiotic Production of Actinomycetes in Forest Termite Soil, 20 - 40 Jongsik Chun, Seung B.K, youn Kyung Oh, Goodfellow M (1999), 41 Tresner H D, M C Davies, and E Jackus, (1961), "Electron "Amycolatopsis thermoflava sp.nov, anovel soil actinomycete from icroscopy of Streptomyces spore morphology and its role in species Hainan Island, China", Int J, Syst Bacteriol - 49, 1369 - 1373 ifferentiation" J Bacteriol 81, 70 - 80 Martin, J F, A.L Demain, (1980), "Control of antibiotics synthesis", Microbiol Rev, 44 (2): 230 - 252 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Trerner, H.D, Buckus E.J (1963), "System of color wheels for Streptomyces taxonomy" Appl Microbiol, 11, 335 - 338 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn -6743 Waksman, S A (1961) The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA 44 Williams and Wilkin, Bergey's maunual of systematic Bacteriology, Vol 4, 1989, pp 2451 - 2492 45 Werner Braun (1976), Di truyền học vi khuẩn (Người dịch Lê Đình Lương), NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội 46 Weinberrg E.D (1973), Secondary metabolism Control by temperature and inorganic photphate, Ind Microbiol 15, - 14 47 Yoo JC, Kim JH, Ha JW, Park NS, Sohng JK, Production and biological activity of laidlomycin, anti - MRSA/ VRE antibiotic from streptomyces sp, CS684, J Microbiol, 2007/ 2, 45 (1): - 16 TIẾNG NGA 48 Н.А Красилников (1971) Лучитые Грибки Издательство «Наука», Москва 49 Г Ф Гаузе, Т.П.Преображенская, М А Свешникова, Л.П.Терехова,Т.С.Максимова,(1983),Определитель Актиномицетов Издательство «Наука», Москва 50 http://www.vietnamgateway.org Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... tác nhân gây bệnh lại kháng lại 0 trên nền thâm canh cao, thường bị bệnh nặng hơn Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh 1.4.2 Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt * Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật côn trùng và cỏ dại kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất So với thuốc Các nhà bệnh học... 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn 2.1.1 Nguyên liệu Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp 201 có khả năng sinh CKS mới là z - methylheptyl iso - nicotinate, chất kháng sinh 2.1.1.1 Mẫu cây Mẫu nghiên cứu là các lá chè, búp chè bị bệnh thu thập từ các địa điểm này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium khác nhau của Thái Nguyên, ... - +++ Ghi chú: ++++: Sinh trưởng rất tốt; +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng yếu; +: Sinh trưởng rất yếu; - :Không sinh trưởng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Ghi chú: +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng Kết quả trên bảng 3.6 cho thấy, hai chủng R2 và Đ1 có khả năng sinh trưởng trong khoảng nhiệt... nghiêng trên môi trường Czapek và được sử dụng làm VSV kiểm định để chủng xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh đạo ôn đã công bố trước đây cùa Lê tuyển chọn xạ khuẩn sau này Gia Hy và cộng sự [18], tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên chè của chúng tôi có phần cao hơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên. .. Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh Đường nhau [48],[49] kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường 1.3 CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN kính khoảng 1 - 5 mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất Bề 1.3.1 Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn... chủng (chi m 53% ), tiếp theo là số chủng kháng nấm CT - 5X, có 13 chủng (chi m 43%) và ít nhất là chủng kháng nấm CT - 1A có 9 chủng (chi m 30%) Hình 3 2 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.3 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên. .. sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất phòng chống bệnh cây Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm của cây và khử trùng đất [15] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái. .. 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, trong số đó có 30 chủng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên chè ở các mức độ khác nhau, chi m tỷ lệ 37,5% Trong số các chủng có hoạt tính kháng nấm, nhóm trắng chi m 36,7%, xám - 26,7%, xanh - 23,3%, hồng - 6,7%, nâu - 3,3%, lục - 3,3% 2 Đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn là Đ1 và R2 có hoạt tính mạnh nhất trong số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, kháng được... tác nhân gây bệnh có trong đất 1.4.1.5 Bệnh thối búp chè Không phải tất cả các xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm invitro đều thể Bệnh thối búp chè thường thấy ở hiện trong đất (khoảng 4 - 5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc các nước trồng chè của vùng Châu Á ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây Đây là Bệnh này được phát hiện ở Phú Hộ từ quy luật cân bằng sinh học... chủng xạ khuẩn Chủng R2 +++ + ++ + + - - nghiên cứu, kết quả được thể hiện trên hình 3.8 cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn Đ1 +++ ++ + + + - - đều có khả năng thủy phân mạnh casein, tinh bột và CMC Ghi chú: +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; 3.3.4 Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn cũng là một trong các chỉ tiêu phân +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh