Vật liệu và phương pháp nghiên cứu vi khuẩn lao

Vật liệu, phương pháp nghiên cứu vi khuẩn lao

Trang 2

CHUONG 2 VAT LIEU — PHUONG PHAP

2.1 CAC KY THUAT DUNG TRONG NGHIEN CUU

2.1.1 Nuơi cấy giữ giống vi khuẩn lao

2.1.1.1 Nguyên tắc:

Nuơi cấy tế bào vi khuẩn lao trên mơi trường dinh dưỡng đặc trưng nhằm giữ giống nghiên cứu, cũng như tăng sinh khối tế bào trước khi thực hiện tách chiết

Do vị khuân lao cân nguơn dinh dưỡng cao nên mơi trường đê nuơi vị khuân

lao thường chứa nhiêu chât hữu cơ cũng như các amino acid

2.1.1.2 Hố chất và thiết bị:

Mơi trường rắn L] . - cv t2 reret BD Benex

Mơi trường lỏng MGTIÍ - c5 22c cà BD Benex

Mơi trường lỏng 7H9G (xem phụ lục 2) BD Bacto Casitone

Mơi trường giữ giống đơng lạnh (-20°C) 7H9A BD Bacto Casitone

OADC (Oleic acid, Bovine Albumin, Dextrose, Catalase) BD Benex

Máy ly tâm mẫu (cĩ bình chứa an tồn) ALC

Tủ cây cấp độ l 5c 2t 222 errrrrrrree Walker

2.1.1.3 Tiến hành:

- Nuơi trên mơi trường răn L]:

Hút 0,5 ml dd đàm đã xử lý (xem phụ lục 1) nhỏ vào mơi trường LÍ, đậy nắp kín,

đem ủ ở 37C

Đọc kết quả sau một tháng hoặc hơn

Mẫu cấy cho két qua chan đốn dương tính khi trên mặt thạch xuất hiện khuẩn lạc

đặc trưng của vi khuân lao Khuân lạc lao cĩ màu trăng ngà, khơ, xu xì, cĩ khi gơ cao trên mặt thạch

Trang 3

-45-CHUONG 2: VAT LIEU — PHUONG PHAP

- Nuơi trên mơi trường lỏng (MGTT, 7H9G):

Hut 0,5 ml dd đàm đã xử lý (xem phụ lục 1) nhỏ vào mơi trường lỏng MGTIT, đậy

nắp kín, đem ủ ở 37°C

Đọc kết quả sau hai tuần hoặc hơn

Mẫu cấy cho kết quả sàng lọc dương tính khi mơi trường sáng lên dưới đèn cực tím

Cần phết lam từ mẫu cay MGIT để xác định vi khuẩn kháng cơn, kháng acid Nếu tiếp tục ủ sẽ thấy vi khuẩn kết thành cụm trên thành ống hay dưới đáy ống

2.1.2 Tach chiét DNA bộ gene vi khuẩn lao bằng phương pháp Lysosome/ CTAB

Vì vi khuẩn lao lây nhiễm qua đường hơ hấp và tương đối nhạy với nhiệt độ

nên trước tiên cần tiêu diệt chúng ở nhiệt độ 80°C trong 20 phút Bước này đơn giản

mà khơng làm ảnh hưởng đến kết quả cũng như chất lượng sản phẩm DNA tách chiết [13]

Vi khuẩn lao cĩ vách tế bào rất dày nên cần phải cĩ tác động phá mang băng

những hố chất biến tính protein mạnh và các enzyme phá màng như lysozyme, proteinase K Các protein cũng như các enzyme sẽ bị biến tính một lần nữa bằng chloroform, tách protein ra khỏi pha nước cĩ chứa DNA bộ gene

Trang 4

-CHUONG 2: VAT LIEU — PHUONG PHAP

Hexadecyltrimethylmamonium (CTAB) Sigma

TSOpropanl 0.0.00 ceccesseseccsseesccssesseserecsseveressesnrevsesess Merck Sodium dodecyl sulphate (SDS) Merck Ethanol ccct cv v2 12x S HH HH HH ngư Merck

Nước cất khử ion -2ccc¿22222vscrstrrrkeered ELGA

Máy VOTẨ€X LH HH nH HT ng Hưng Hới Genie2

Máy ly tam lamh ooo cee ceccecscsseesecnsecsesesesseseseeseeeees Eppendorf

2.1.2.3 Tién hanh:

Tién hanh tach chiét DNA bộ gene vi khuẩn lao theo thứ tự các bước sau:

Cho 0,6m] dung dịch đệm TE vào mỗi tube cĩ nắp vặn

Lấy tồn bộ vi khuẩn băng vịng cấy vi khuẩn bỏ vào tube cĩ dung dịch

TE

U & 80°C trong 20 phut Đề nguội về nhiệt độ phịng

Pha dung dich lysozyme moi (10mg/ml) Thém 50u] dung dich lysozyme vao mdi tube, vortex U & 37° qua dém

Thêm 10pl proteinase K (10mg/ml) va 351 dung dich SDS 20% (W/V),

vortex Ú ở 55°C trong 30 phút

Thêm 100u1l dung dịch NaCl 5M, vortex Thêm 100H] dung dịch CTAB

5% và vortex cho đến khi dung dịch cĩ màu trắng đục Ủ ở 65°C trong 15

phút

Đề nguội về nhiệt độ phịng rồi thêm 700u1 dung địch chloroform:isoamy] alcohol (24:1), vortex Ly tam 13000g trong 5 phút

Hút cần thận 600u] lớp nước trên cùng cho vào các eppendorf mới

Thêm 360ul (tương ứng với 0,6 thể tích) isopropanol để tủa DNA Trộn đều dung dịch bằng cách cách đảo tube vài lần, giữ ở -20°C ít nhất 30

phút

Trang 5

_47-CHUONG 2: VAT LIEU— PHUONG PHAP

- Ly tam 13000g trong 15 phut

- Bo dich néi Thém 1,0ml cén 70% lanh vào

- Ly tém 13000g trong 7 phút

- _ Cần thận loại bỏ dịch nỗi

- _ Ly tâm lại 13000g trong 2 phút Dùng tip nhỏ hút bỏ dịch nỗi cịn lại

- Dé tube mở nắp ở nhiệt độ phịng hoặc hút chân khơng cho đến khi khơ

hồn tồn

- Thêm lượng TE phù hợp vào từng tube (25-100u1 TE) Dé mẫu tan ở

nhiệt độ phịng trong 2 giờ, hay để qua đêm ở 4°C - - Mẫu DNA sau khi ly trích này được giữ ở -20°C

2.1.3 Định lượng DNA bằng Picogreen

Quant-ïIT Picogreen dsDNA là kit định lượng DNA mạch đơi dựa vào phản ứng phát huỳnh quang của hố chat Picogreen (PG) khi gan vao DNA mach

đơi dưới một ánh sáng kích thích Phương pháp này nhạy hơn 10000 lần so với phương pháp ước lượng nồng độ DNA bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sĩng 260nm

(DNA tối thiểu cần để đo chính xác là 25pg/ml theo phương pháp Picogreen, so với 0,5ug/ml theo phương pháp hấp thụ ở bước sĩng 260nm - theo protocol của Invitrogen)

Do picogreen gắn đặc hiệu với DNA mạch đơi nên sẽ ít bi ảnh hưởng nêu

trong mẫu cĩ nhiễm các RNA hay hố chât khác (muơi, cơn, chloroform, protein, agarose)

Trang 6

2.1.3.2 Hoa chat va thiét bi:

Kit Quant-iT™ Picogreen dsÙDNA Invitrogen Dung dich TE (phu luc 3)

Lambda DNA standard (100ug/ml) Biolab

Đĩa polystyrene 96 giếng con nen Corning Incorporated Máy đo Tecan c c St SH ng nen GENIos

Gồm bốn bước sau:

4) Pha lỗng mẫu cân đo nơng độ

Thực hiện pha lỗng mẫu trên đĩa 96 giếng, trộn đều bằng pipet Tất cả

các mẫu được pha lỗng bằng dung dịch TE

- Nếu pha lỗng 400 lần: hút Iul DNA đã tách chiết cần đo nồng độ pha

trong 199u] TE Khi do, hut SOul dd pha lỗng này trộn với SOul dd picogreen (PG)

- Nếu pha lỗng 500 lần: hút Iul DNA đã tách chiết cần đo nồng độ pha trong 249ul TE Khi do, hut 50u] dd pha lỗng này trộn với 50HL dd picogreen (PG)

- Néu pha loang 600 lan: hut lu] DNA da tach chiét cần đo nồng độ pha

trong 299ul TE Khi đo, hút 50HÌ dd pha lỗng này trộn vớis 50Hl dd picogreen (PG)

b) Pha DNA dựng đường chuẩn

Để dựng đường chuẩn, trước tiên cần tiến hành pha lỗng DNA lambda

(100ug/ml) thành các nơng độ 800ng/ml, 400ng/ml, 200ng/ml, 100ng/ml,

50ng/mI], 25ng/ml va 12,5ng/ml Tất cả đều được pha lỗng bang dung dịch

(dd) TE

Trang 7

-CHUONG 2: VAT LIEU — PHƯƠNG PHÁP

c) Chuan bi dung dich picogreen

Hố chất của kit PG phải được giữ ở -20°C, tránh ánh sáng và tránh giải

đơng nhiều lần Vì vậy, ngay lần giải đơng đầu tiên, cần chia nhỏ hố chất ra

các tube nhỏ cĩ bọc giấy bạc

Dung dịch PG được pha lỗng 200 lần với dung dịch TE (hoặc nước cất) trước khi dùng Với đĩa 96 giếng, hút 25ul dd PG pha trong 4975ul TE Pha trong falecon cĩ bọc giấy bạc

Dung dịch PG chỉ được pha trước khi dùng nhăm tránh thời gian phơi

sáng cũng như các yếu tố cĩ thể làm ảnh hưởng đến tính phát quang của PG

d) Chuyển lên đĩa đo nơng độ

Dùng đĩa đen polystyrene 96 giếng cho phương pháp định lượng băng PG giúp việc đọc kết quả chính xác hơn

Cho vào mỗi giếng mỗi 50ul dung dịch pha lỗng DNA Gồm DNA đựng

đường chuẩn cũng như DNA cần đo nơng độ (như bảng 2 l)

Bảng 2.1: Cách nạp mẫu trên đĩa 96 giếng, mỗi lần đo được 40 mẫu với độ lặp lại hai lần, cùng với thang chuẩn Std O(TE) | Std O(TE) | 1 1 9 9 17 | 17 | 25 | 25 |33 133 Std 12.5 | Std 12.5 2 2 10 |10 | 18 | 18 | 26 | 26 | 34 | 34 Std 25 Std 25 3 3 11 711 [19 | 19 127 | 27 | 35 135 Std 50 Std 50 4 4 12 112 | 20 | 20 | 28 | 28 | 36 | 36 Std 100 Std 100 5 5 13 |13 | 21 | 21 | 29 | 29 | 37 | 37 Std 200 Std 200 6 6 14 | 14 | 22 | 22 | 30 | 30 | 38 | 38 Std 400 Std 400 7 7 1S | 15 | 23 123 [31 [31 | 39 | 39 Std 800 Std 800 8 8 16 16 | 24 | 24 | 32 | 32 | 40 | 40

Mỗi mẫu được cho vào hai giêng nên mơi mâu đo cĩ độ lặp lại hai lân

Mot lan đo bằng đĩa 96 giếng như vậy ta đo được 40 mẫu DNA

Trang 8

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

Thêm vào mỗi giếng 50ul dung dịch PG Dùng pipet trộn đều hai dung

dịch trong các giếng Ủ 5 phút trong tối trước khi đo bằng máy Tecan

2.1.4 Phản ứng khếch đại - PCR 2.1.4.1 Nguyên tac:

PCR là phương pháp khuyếch đại trình tự gene đích đã biết nhờ hoạt động

tong hợp mạch DNA mới dựa trên DNA mạch khuơn dưới sự hién dién Taq polymerase và cặp mỗi chuyên biệt, bắt cặp bổ sung với trình tự đĩ Năng lượng để hình thành phản ứng mạch mới được lẫy từ bốn loại deoxynucleotid (dATP, đTTP, dGTP, dCTP) Cac nucleotid nay cting 1a don vi để hình thành chuỗi DNA mới

Phản ứng khuyếch đại được thực hiện từ 25-40 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm ba bước

- _ Bước biến tinh tach mach: 94-96°C

- _ Bước bắt cặp của mơi lên trình tự đích: nhiệt độ tuỳ từng cặp

mồi (dao động 40-70°C)

- - Bước kéo đài: được đặt ở nhiệt độ tối ưu của Taq polymerase

(thường là 72°C)

Đề thực hiện phản ứng PCR, chúng ta phải cĩ một cặp mơi đặc hiệu Phản

ứng PCR của chúng tơi dùng các cặp mỗi được đăng tải trên các tạp chí khác nhau (bảng 2.2)

dNTPs (dATP, đTTP, dGTP, dCTP) Roche MgC]; 50mM - - cs-csằcséneééhhhhhtrerree Bioline

Buffer NH¿ 10X -cccScSnhhhhhhherree Bioline

Biotaq DNA polymerase 5U/HÌ : -: - Bioline

1011-2207 Proligo

Trang 9

S]-CHUONG 2: VAT LIEU — PHƯƠNG PHAP

Nước cắt khử ion 5c 5s 2n E2 E1 ng ELGA Eppendorf thành mỏng chịu nhiệt 0,2m1 Alpha Labs

Máy luân nhiỆt 5: cv cty, Eppendorf, Bio-Rad

May VOMteX oo eccecescesscecssecssecsscccssecnecenseseaeeesteestens Genie2

2.1.4.3 Tién hanh:

Thực hiện Blast kiểm tra các cặp mơi trên NCBI để kiểm tra độ đặc hiệu cũng như độ dài của sản phẩm tạo thành

kháng

Với mục tiêu là giải trinh tu cdc doan gene katG, inhA, ahpC (đối với chủng

H) hay các đoạn khác nhau trên gene rpoð (đối với chủng kháng R) Trước hết chúng tơi phải tìm được cặp mơi thích hợp nhằm khuyếch đại đoạn gene đích cĩ trình tự cân khảo sát Bang 2.2: Các đoạn mỗi dùng trong PCR Tên mỗi Trinh tu mdi (5'-3') Tm Vung Sản phẩm (°C) khuyéch dai (bp)

katGweFl GTC CTC TAT ACC GGA CTA CGC 60 Tồn bd gene 2 899

katGweR] TCG CAC ATC CAG CAC ATT TC kaiG

katGPS GGT CGA CAT TCG CGA GACGTT 60 Vùng codon 519

katGP6 [25] CGG TGG ATC AGC TTG TAC CAG kaiG315

TB92 CCT CGC TGCCCAGAAAGGGA 66 promoter 248 TB93 [41] ATC CCC CGG TTT CCT CCG GT inhA

AhpCl GCC TGG GTG TTCGTCACTGGT 58 Vùng giữa 359

AhpC2 [39] CGC AAC GTC GAC TGG CTC ATA oxyR-ahpC

RPOBF | GGGAGC GGA TGA CCA CCC A 56 Vùng RRDR 350 trên rpo RPOBR [17] GCG GTA CGG CGT TTC GAT GAA C TBI14 TB14 RpoB RpoB 6F CITCTCCGGGTCGATGTCGTTG 62 rpoB N- 365 6R [12] CGC GCT TGT CGA CGT CAA ACT C terminal

-'C3F_ GAGTACGTGCCC TCGTCTGA 62 rpoBcluster3 319 -C3R_ ACT TGC GCA TCC GGT AGG TA

Trang 10

-52-CHUONG 2: VAT LIEU — PHƯƠNG PHÁP

Các PCR được thực hiện với thành phần như sau cho mỗi phản ứng:

Nơng do trong phan img Nước cât khử Ion Buffer 10X (Bioline) 1X Mơi xuơi 2,5 uM 0,1— 0,3 uM Mỗi ngược 2,5 uM 0,1—0,3 uM dNTPs 2,5mM 200 nM MgCl, 50mM 1-3mM

Taq polymerase (Bioline) 0,75 U DNA ban mau 15 ng

Phản ứng được thực hiện với tổng thé tich 25 ul

Đối với chủng kháng H chúng tơi thực hiện phản ứng PCR nhằm khuyếch đại đoạn 2899bp bao gồm toan bộ gene &z/Ớ với cặp mỗi katGwgFI — katGwgRI, đoạn 519bp trên gene katG véi cap mdi katGP5 — katGP6, đoạn 248bp trên promoter gene inhA véi cap mỗi TB92 — TB93, doan 359bp trén vung giita hai gene oxyR-ahpC với cặp mỗi AhpC] - AhpC2

Đối với chủng kháng R chúng tơi thực hiện phản ứng PCR nhằm khuyếch đại đoạn 350bp trên ving RRDR cua gene rpoB véi cap moi RPOBF va RPOBR, doan 365bp trén dau N-terminal gene rpoB véi cap méi TB146F — TB146R, doan

319bp trên vùng cluster3 gene rpoB voi cap méi RpoB-C3F — RpoB-C3R

Sau khi đã chuẩn bị tồn bộ các thành phần phản ứng trên, phản ứng

khuyếch đại sẽ được thực hiện trong máy luân nhiệt với chương trình: đầu tiên biến

tính ở 95°C trong vịng 3 phút; sau đĩ là 30 chu kỳ luân nhiệt với 95”C trong vịng

15 giây, nhiệt độ bắt cặp tuỳ từng cặp mỗi (Tm) trong 15 giây, 72°C trong l5 giây: cuối cùng là kéo đài ở nhiệt độ 72”C trong 2 phút Riêng với phản ứng khuyếch đại

tồn bộ gene &/Œ, bước kéo dài trong 30 chu kỳ được thực hiện ở 72”C trong 2,5 phút và bước kéo đài cuối cùng ở 72°C trong vịng 7 phút Các sản phẩm PCR sau

đĩ đều được bảo quản ở 4°C

Trang 11

_53-CHUONG 2: VAT LIEU —- PHƯƠNG PHAP

2.1.5 Téiwu hoa phan img PCR 2.1.5.1 Nguyên the:

Phan tmg PCR chi khuéch đại đúng trình tự đích khi cĩ sự bắt cặp bơ sung

chuyên biệt của cặp mơi với trình tự DNA mạch khuơn Vi vậy, để tối ưu hố, chúng ta phải thay đơi các điêu kiện nhằm đảm bảo cặp mỗi bắt cặp tốt và đặc hiệu

⁄ oA A a ˆ Ae ax A RYN Ầ A ae + 2 ` a x

(nhiệt độ, nơng độ mơi, nơng độ NTPs, nơng độ các tọn K”, Mg”” ) mà khơng làm

ảnh hưởng nhiêu đên hoạt tính của DNA polymerase (pH, các ion )

dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) oo Roche

i50 m0: 8= Bioline

Buffer NHÀ TÚX Le Bioline

Biotaq DNA polymerase SƯ/HỈ eo Bioline

CÁC mỖI .Q Q12 221 re Proligo Nước cất khử 10n ác nhe ELGA Eppendorf thành mỏng chịu nhiệt Ơ,2ml Alpha Labs "50/0511 <4 Genie2 Máy luận nhiệt cĩ gradient nhiệt độ Eppendorf, Bio-Rad 2.1.5.3 Tién hanh Thay đổi nhiệt độ bắt cap cua cap mơi, Từ đĩ chọn ra nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho cặp mài Thay doi néng d6 MgCh

Thay đơi nồng độ mồi

Trang 12

CHUONG 2: VAT LIEU — PHUONG PHAP

2.1.6 Điện di

Do đặc điểm tích điện âm của nhĩm phosphate trên DNA, dưới tác động của điện trường, các đoạn DNA khác nhau sẽ di chuyển về phía cực dương với vận tốc khác nhau tuỳ vào cầu trúc và kích thước của chúng

Gel agarose khi nấu chảy để đặc lại sẽ hình thành cấu trúc mạng lưới, giúp ngăn cản dịng di chuyển của DNA trong điện trường, nhờ đĩ các DNA cĩ độ dài khác nhau sẽ được phân tách rõ trên bảng gel

Kết quả điện đi sẽ được xem trực tiếp trên bản gel cĩ nhuộm ethidium bromide dưới đèn cực tím; do ethidium bromide cĩ khả năng găn chèn giữa các

base của DNA và phát huỳnh quang màu cam khi kích thích băng tia UV

2.1.6.2 Hố chất và thiết bị: 400 bp DNA Ladder

bp

1517

Dung dich dién di SBA (phu luc 3)

Dung dich nap mau (phu luc 3) -

Ethidium bromide (EtBr) 5s cscsxeexerreeve Sigma s0

TOO

2.0.0 BioRad 602

50U0⁄51?

Thang 100bp che BioLabs 40) Hệ thống bồn điện di 5252 2cccczcczrcce2 BioRad 309

Hệ thống máy chụp hình gel : - -sc Bio Rad ø

10)

Tạo bản gel 1,5%: cân I,5g agarose hồ trong 100ml dung dịch SBA, đun sơi

và lắc đều dung dịch để agarose tan hồn tồn Để nguội đến khoảng 50°C, thêm

vào 5ul dung dịch EtBr rồi lắc đều dung dịch Để yên khoảng 30 giây cho bớt bọt

khí rồi đỗ vào khay đã gắn lược tạo giếng Gel sẽ đặc lại sau 30 phút Lúc này ta cĩ

thé tháo lược ra, đặt vào bơn điện di đê nap mau

Trang 13

-55-CHUONG 2: VAT LIEU — PHUONG PHAP

Nạp mẫu và chạy điện di: hut Sul sản phâm điện di trộn đều với II dd nạp mẫu 6X Sau đĩ nạp các mẫu này vào từng giếng riêng biệt của bản gel 1,5% Chạy điện di các mẫu trên cùng với 6H] thang 100bp ở điện thế 120V trong 40 phút

Xem kết quả: Vì bản gel đã được nhuộm với EtBr nên cĩ thể xem kết quả

ngay bằng cách đặt gel trên bàn đèn ỦV Các vạch cĩ chứa sản phẩm khuyếch đại

DNA sẽ phát sáng màu cam Kích thước của sản phẩm PCR đích sẽ được kiểm tra bằng cách so sánh với kích thước của thang chuẩn 100bp Nhờ đĩ ta phát hiện được

các vạch ký sinh, hay các sản phẩm khuyếch đại khơng đặc hiệu

2.1.7 Giải trình tự

Sản phâm khuyêch đại đoạn gene mục tiêu của các mâu khác nhau được đem

tinh sạch bằng kit QIAgen

2.1.7.1 Tình sạch và định lượng sản phẩm PCR: a Nguyên tắc:

Mục đích của bước tỉnh sạch này nhăm loại đi các thành phần trong phản

ứng PCR trước đĩ (như muối, mỗi, DNA polymerase v.v.) Các thành phân này được loại đi nhằm khơng làm ảnh hưởng đến phản ứng khuyéch dai tao ra cac doan trình tự cĩ tín hiệu huỳnh quang (tạm gọi phản ứng PCR giải trình tự)

Sản phẩm PCR sẽ được giữ lại trên màng silica-gel khi cĩ độ pH và điểm

đẳng điện phù hợp Những thành phần khác sẽ đi qua màng với dd rửa cĩ cthanol Các đoạn DNA tính sạch sau đĩ sẽ được hồ tan trong nước và thu lại băng cách ly tâm

Để chuẩn bị cho bước PCR giải trình tự, đoạn gene khuyếch đại khơng

những được tinh sạch mà cịn được định lượng Chúng tơi dùng phương pháp định

lượng băng điện di so sánh với thang cĩ nơng đơ xác định biết trước (Mass standard

Trang 14

ladder) Phuong pháp này tuy độ chính xác khơng cao nhưng cĩ thuận lợi là nhanh chĩng và tránh tạp nhiễm Do lượng sản phẩm khuyếch đại cần cho vào phản ứng PCR giải trình tự cĩ thể dao động tương đối cao nên phương pháp định lượng trên là một giải pháp tốt b Hố chất và thiết bị: Thang cĩ nồng độ xác định (Mass standard) BioRad 1,000 (100 ng) 700 (70 ng) 500 (50 ng) 200 (20 ng) 100 (10 ng)

Nước cất khử íon :55cc222ccccsrrsrrvrsrrree ELGA

QIA quick PCR purification KIt e c5 Qiagen Qiagen kit gém:

- Dung dich PB: dd cé pH thấp, muối và những chất cĩ khả năng biến tính DNA, làm cho chúng được giữ lại trên màng

- Dung dịch PE: đd cĩ chứa ethanol giúp loại bỏ các thành phần khơng mong muốn như muối, moi, DNA polymerase, dNTPs

- _ Cột silica-gel và tube đựng dd rửa

Máy ly tâm .- (cành HH He eppendorf

c Tiến hành:

Sản phẩm PCR được trộn đều trong 5 lần thể tích dd PB Cho tồn bộ vào cột

silica-gel Ly tam 13000 vong/phut trong l phút

Để bỏ dịch ly tâm, rửa lại cột silica-gel với 0,75ml dd PE Ly tâm 13000

vịng/phút trong I phút

Trang 15

-57-CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

Chuyển cột sang một eppendorf sạch, hồ tan DNA với 5Oul nước cất vơ trùng Ly tâm 13000 vịng/phút trong 1 phút Dung dịch cĩ DNA đã tỉnh sạch được p1ữ ở 4°C PCR reaction Solubilized gel slice or Enzymanc reaction Bind tad sị Wash | ) <add +) cat -) cma — Ệ -} calf +f Wÿ

Pure DNA Fragment

Hinh 2.1: Qui trình thực hiện các bước tinh sạch sản pham PCR

San pham PCR sau khi được tính sạch sẽ được điện dị chung với thang cĩ

nơng độ xác định Nơng độ của mẫu PCR được xác định bằng cách điện di, rơi so sánh bằng mắt thường trên bản điện di với thang nơng độ

Trang 16

B8-CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.1.9.2 Khuyéch đại trình tự tín hiệu (PCR giải trình tự): a Nguyên tặc:

vstevele and evele

6 tentpcate strands 6 complementary strands 12 complementan strands t ^' Pg | —ằ : ee i - -S > _> —>——d —>+—_—_# =>=——=——è —— — 0 —*-——? Hình 2.2: Nguyên tắc của chu trình khuyếch đại trình tự tín hiệu phát huỳnh quang

Phương pháp giải trình tự bảng máy tự động CEQ8000 dựa trên việc khuyếch đại chuỗi tạo ra các đoạn trình tự cĩ tín hiệu huỳnh quang Các thành phân trong phan ứng tương tự PCR thơng thường nhưng cĩ thêm các ddNTP (dideoxynucleotide) và phản ứng chỉ dùng một mơi đơn (thay vì một cặp như PCR)

Đặc điểm của ddNTP là bị mất nhĩm -OH ở C3, đo đĩ khơng thê hình thành

nối phosphodiester kéo dài mạch ở đầu 3' Phản ứng kéo dài mạch sẽ dừng lại ở đây Mỗi loại ddNTP cịn được đánh dâu bằng chất phát huỳnh quang cĩ màu khác nhau (4 màu tương ứng 4 loại dđNTP) Màu này sẽ cho biết nucleotide nào đứng ở

cuối mạch và chiều dài của đoạn trình tự này sẽ cho biết khoảng cách từ nucleotide

đĩ đên mơi

Tỷ lệ ddNTPs/dNTPs được nhà sản suất tối ưu hố sao cho các ddNTP sẽ

Trang 17

CHUONG 2: VAT LIEU ~ PHUONG PHAP

Vi phan img khuyéch đại trình tự tín hiệu được thực hiện trong 30-40 chu kỳ

nên sơ sản phầm ngâu nhiên tạo ra đủ lớn dé dai điện cho tật cả cdc nucleotide cĩ

trong đoạn trình tự cân giải mã

an

Khơng như PCR là phản ứng khuyếch đại theo cấp số mũ (C x 2", với € là số

DNA ban mẫu, n là số chu kì luân nhiệt), phản ứng khuyếch đại trình tự tín hiệu chỉ

khuyếch đại các đoạn mạch đơn theo cấp số nhân (C x n) Do đĩ việc xác định nơng độ của sản phẩm PCR sau khi tỉnh sạch là rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến

tín hiệu cũng như kết quả giải trình tự b Hố chất và thiết bị;

DTCS Quick start Kite c aa Beckman Coulter

(Thanh phan master mix bao gém buffer, mudi, dNTPs, ddNTPs cĩ đánh dau chat phat huynh quang va polymerase.)

DNA dùng làm mạch khuơn là sản phẩm DNA PCR đã được tính sạch và biết

nồng độ

Mơi: dùng mơi của phản ứng PCR cho bước khuyếch đại trình tự tín hiệu

Nuc cat Kat 101 cece mers ELGA

Eppendorf thành mỏng chịu nhiệt 0,2ml Alpha Labs

Máy luân nhiét Eppendorf eee Bio-Rad

San phẩm PCR tính sạch của các gene cần giải trình tự được sử dụng làm

mạch khuơn cho bước khuyếch đại trình tự tín hiệu

Cĩ thể dùng kit DTCS Quiek-start với chỉ một nửa (44H) hay một phần tư (24Ù) thành phần phan img (DTCS master mix) Trong nghién cứu nay chung tơi

dùng nửa lượng DFCS master mix để giải trình tự các gene mục tiêu, Thành phần của một phản ứng như 5âaU:

Trang 18

60-CHUONG 2: VAT LIEU — PHUONG PHAP Nước cất khử ion 10,72-13,72 ul DTCS master mix 4 ul Méi (xuơi hoặc ngược) 1,28 HÌ Sản phẩm PCR tính sạch _ 1-4 ul 20 ul

Các thành phần phan ứng trên được cho vào tube thành mỏng 0,2ml và chạy trên máy PCR với chương trình sau:

96°C 20 giây

50°C 20 giây

60°C 4 phút

Lặp lại trong 30 chu kỳ Sau đĩ giữ ở 4°C

2.1.9.3 Chuẩn bị sản phẩm khuyếch đại trình tự tín hiệu trước khi giải trình tực

a Nguyên tắc:

Đề chuẩn bị mẫu DNA dùng cho giải trình tự, chúng ta cần tỉnh sạch sản

phẩm khuyếch đại trình tự tín hiệu trước khi cho vào máy Mục đích để loại đi các thành phần phản ứng cịn sĩt lại Dùng ethanol lạnh tủa để khơng làm ảnh hưởng đến hoạt tính phát quang của các đideoxynueleotide trên mạch

b Hố chất và thiết bị:

Ethanol 959%, 70% chu HH HH ghi he Merk 18715 075 Sigma EDTA 100MM che Sigma

Dung dich dém SLS (Sample Loading Solution) Beckman Coulter

Glycogen 20mg/mÌ cà hhhhhnreeneeene Beckman Coulter Máy ly tâm lạnh cài ehenrrerrrredrreesre Eppendorf

Trang 19

c Tiên hành;

Tồn bộ sản phẩm PCR giải trình tự được chuyển vào eppendorf cĩ chứa sẵn

4Hi dụng dịch dừng phản ứng Dung dich nay được pha ngay trước khi dùng với 2Hl

dd NaOAc 3M + 2ul dd EDTA 100mM +1Hl glyeogen (20mg/m)) Trộn đều hỗn

hop

Thêm vào 60H] cồn lạnh 95° (giữ ở -20°C) Trộn đều hỗn hợp Ly tâm lạnh 4°C trong 15 phút (cần thấy tủa sau khi ly tâm),

Hút bỏ địch nổi Rửa lại hai lần với 200ul cồn 70° lạnh (-20°C) Ly tâm lạnh

trong 2 phút

San pham tủa sau khi khơ (dùng máy hút chân khơng) sẽ cho hồ tan trong

dung dịch SLS cĩ chứa formanderhid Mẫu phải được để hồ tan tự nhiên (khoảng 20 phút) Dung địch này nham ha thap nhiệt độ biến tính cho các đoạn trình tự cĩ chất phát huỳnh quang đạng mạch đơn Giúp cho các đoạn trình tự này luơn ở dạng

thăng trong quá trình chạy điện đi trên máy CEQ8000

Mẫu hồ tan trong formandehid sẽ được chuyên lên đĩa và giải trình tự trên

may Beckman CEQ8000

2.1.9.4 Gidi md trinh tu doan gene muc tiéu: a Nguyễn tặc:

Hệ thơng giải trình tự tự động CEO 8000 là hệ thống dién di mao mạch Với hé thống điện đi mao mạch, chúng ta cĩ thể dùng điện thế cao đề rút ngắn thời gian điện di, cĩ thể điều chính được nhiệt độ của quá trình điện di đoạn gene mục tiêu, va quan trong nhất là cĩ thể tự động hố quá trình điện di, đọc kết quả

Trang 20

CHUONG 2: VAT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

được đến từng nucleotide khác biệt Gel polyacrylamide được hệ thống bơm tự động thay thế sau mỗi lần chạy điện di

Do đặc tính cĩ đánh dấu phát huỳnh quang khác nhau tương ứng với từng loại nucleotide ở đầu đideoxynucleotide, máy cĩ thể tự động đọc và giải mã thành

trinh tu v1 A, T, G, C

b Hố chất và thiết bị:

Dâu khống ch HH ng rag Beckman Coulter

Dung dich dém để điện đi ruae Beckman Coulter

Gel polyacrylamId€ che Beckman Coulter

Đĩa 96 giếng dùng nạp mẫu vào máy Beckman Coulter Hệ thơng giải trình tự động CEQS§000 Beckman Coulter

ec Tiên hành:

Mẫu sau khi cho hồ tan tự nhiên trong SLS (để khoảng 15-20 phút) được chuyển lên đĩa nạp mẫu 96 giếng chuyên dùng của máy Thêm vào mỗi giếng một giọt đầu khống để tránh bay hơi

Cho dụng địch đệm điện đi vào đầy 2/3 các giếng tương ứng trên đĩa chứa dd đệm

Chương trình điện dị được thiết lập trên máy tính với phương pháp LER-a cĩ

cải tiến: nhiệt độ ống mao dẫn là 50°C , nhiệt độ biến tính là 90C trong 120 giây,

thời gian nạp mẫu là 20 giây, với mức điện thể 2,0 KV và giai đoạn điện đi kéo dải

70 phút, voi dién thé 4,0KV

2.1.8 Phân tích đa hình bằng enzyme cat giéi han (Restriction Fragment

Length Polymorphism - RFLP)

Trang 21

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHAP

Đựa vào tính đặc hiệu của enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme - RE) chỉ

cãi đúng trình tự nhận diện, người ta dùng nĩ để phân biệt các vị trí đa hình trên

gcnome hoặc trên một vùng trình tự xác định

Trong thí nghiệm này, phản ứng được thực hiện dựa trên việc khuyếch đại

trình tự một đoạn gene (gene ¿2/Œ) Sau đĩ thực hiện phản ứng cắt và điện di trên gel agarose nhằm phân biệt gene đột biến với gene khơng đột biến

Enzyme cat han ché MspALL voces BioLabs Buffer di KOM oo ccc ccccccceseccssceessesecscseeeeesseenss BioLabs

Bén 0 nhiét (hay may ludn nhiét) co Clifton

2.1.8.3 Tiên hành:

Vì các enzyme chỉ hoạt động tại pH thích hợp, nên cần pha dung dich buffer

cho phán ứng cắt Thường các buffer này đã được nhà sản xuất tối ưu hố và cung cấp kèm theo với enzyme đĩ

Thành phan dung dich phan tng cắt gồm:

Nơng độ trong phản ứng

Nước cất khử ion

Buffer 10X (BioLabs) 1X

RE (MspA1l) 1U

DNA ban mẫu (ở đây là sản phảm PCR)

Trên đều các thành phần phản ứng, ly tâm, rồi ủ tại nhiệt độ hoạt động tối ưu của RE đĩ Với enzyme MspA II, nhiệt độ tối ưu là 37°C Thời gian ủ cân thiết tuỳ

thuộc vào lượng DNA bản mẫu

Sản phẩm cặt sau đĩ được điện di trên gel agarose để phân biệt đoạn bị cắt

và khơng cắt Kết quả được xem đưới đèn UV

Trang 22

-CHUONG 2: VAT LIEU ~ PHƯƠNG PHÁP

2.2 NGHIEN CUU TAN SUAT DOT BIEN GENE TRONG LAO KHANG THUOC

2.2.1 Nguén mau - déi tượng nghiền cứu

Nguồn mẫu là các mẫu cấy từ đàm được thu từ các cơ sở chống lao cấp quận,

huyện và được thử kháng sinh đề tại Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch Từ tháng 1/2005

đến tháng 3/2005, các mẫu cây cho kết quả kháng với ít nhất một trong hai kháng

sinh rifampicin (R) va isoniazid (H) sé duoc mang vé Bệnh viện Bệnh nhiệt đới dé nghiên cứu tần suất đột biến trong cac gene liên quan dén tinh khang bang phuong

pháp giải trình tự

Kháng sinh đồ lao được thực hiện tại BV Phạm Ngọc Thạch, dùng phương pháp chuẩn tỉ lệ thuốc 1% trên mơi trường LÌ; với nồng độ thuốc trong mơi trường la: INH (0,2 ug/m)D, RIF (40 ug/ml), streptomycin (4 ug/ml) va ethambutol (2 ug/ml) 2.2.2 Thiét ké nghién ciru Vị khuẩn lao Ỷ Tách chiết DNA bộ gene Đối với chúng kháng H Đi với chúng kháng R k2 ¥ PCR và giải trình tự PCR và giải trình tự vùng vung gene katG RRDR trén gene rpoB Cĩ đột biến Cĩ đột biến Khơng đột biến Khơng đột biến ý PCR và giải trình tự thêm PCR và giải trình tự thêm hai vung gene: - Promoter inhA va - Vùng giữa oxyR-ahpC hai vùng khác trén rpoB:

- Đầu N của rpo8 và

- Dau cluster 3 của ro

Trang 23

2.2 NGHIÊN CỨU PRA (PCR - Restriction Enzyme Analysis)

Nghiên cứu thử nghiệm phát hiện nhanh chủng lao kháng thuốc izoniazid (H) bằng phương pháp sinh học phân tử, đựa vào đột biến tại codon 315 trên trên gene katG

Thử nghiệm thực hiện dựa trên việc khuyếch đại trình tự một đoạn gene

kafŒ Sau đĩ thực hiện phản ứng cắt và điện di trên gel agarose nhằm phân biệt gene đột biến tại codon 315 (tương ứng amino acid Thr, lle, Asn, Gly) va gene khơng đột biến tại codon 315 (trơng ứng amino acid Ser)

2.2.1 Nguồn mẫu

Thứ nghiệm nhằm thiết lập test PRA và tối ưu hố phản ứng được thực hiện

trên các mẫu DNA đã giải trình tự vùng gene katG (100 mau) Cac mau này được

tách chiết từ vi khuẩn lao kháng isoniazid phân lập từ đàm (mẫu từ Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch) Các mẫu này cũng được dùng đề kiêm tra tín hiệu quả của test PRA

Thứ nghiệm tín hiệu quả cũng như khả năng ứng dụng trong xét nghiệm

được thiết lập với mẫu nuơi cấy từ dịch não tuỷ những bệnh nhân lao màng não

(mẫu từ Bệnh viện Bệnh nhiệt đới)

2.2.2 Chọn enzyme cắt thích hợp

Enzyme cắt giới hạn chế (Restriction enzyme) là những enzyme cĩ trong tế

bào vi khuẩn, cĩ vai trị bảo vệ ví khuẩn khỏi các các nucleotid lạ xâm nhập băng cách cắt bỏ chúng tại các vị trí đặc hiệu

Enzyme cân chọn phải đảm bảo:

- Cit đặc hiệu tại vị trí codon S315 hoặc codon đột biến T315

- Các sản phẩm cất tạo ra phải khác nhau đủ lớn đề dé dàng phân biệt trên gel

Trang 24

-CHUONG 2: VAT LIEU —PHUONG PHAP

2.2.3 Tối ưu hố phản ứng khuyếch đại với cặp mỗi katGP5-katGP6

Dựa trên đặc điểm của phản ứng khuếch đại trình tự đích cần sự bắt cặp

chuyên biệt với trình tự đích trên DNA mạch khuơn dưới sự hiện diện Taq

polymerase Vì vậy, để tối ưu hố, chúng ta phải thay đơi các điều kiện sao cho vẫn giữ được hoạt tính của polymerase (pH, các ion ) và đảm bảo cặp mồi bắt cặp tốt

và đặc hiệu (nhiệt độ, nơng độ mơi, nơng độ các ion K”, Mg”” )

Với mục tiêu là ứng dụng thử nghiệm trong chân đốn lâm sàng nên test

PRA phải đảm bảo tính nhạy cũng như tính đặc hiệu cần thiết của một test chân

đốn

2 2.3.2 Hố chất và thiết bị:

đNTPs (dATP, đLTP, dGTP, dCTP) Roche MpgC]; 50mM c cà ssenhhhhhHrhrerrree Bioline

Buffer NHạ 10 :- 75c S S22 hrerreee Bioline

Biotaq DNA polymerase 5U/ul - Bioline

Các mỗi (katGP5 — katGP6) -cccccsxrrei Proligo

Nước cất khử ion c-cccccccicerrrrrrirerrrree ELGA

Eppendorf thành mỏng chịu nhiệt 0,2ml Alpha Labs Máy VOF{€X che Genie2

Máy luân nhiệt cĩ gradient nhiệt độ - Eppendorf, Bio-Rad

Thực hiện Blast kiểm tra cặp mỗi katGP5 — katGP6 trên NCBI cho thấy cặp

mdi này rất đặc hiệu đối với vi khuẩn lao Hơn nữa, gene katG là một gene đặc thù đối với vi khuẩn lao nên việc khuyếch đại một đoạn trình tu trén gene katG mang

tính đặc hiệu rất cao Các phản ứng tối ưu hố chủ yêu tập trung vào việc tăng độ nhạy của phản ứng ở mức cao nhât

Trang 25

-67-Thay déi néng d6 MgCl

Thay đổi nồng độ mỗi

Thay đơi chương trình của máy luận nhiệt

2.2.4 Tối ưu hố phản ứng cắt 2.2.4.1 Nguyên tặc:

Vì đặc tinh cua enzyme cat giới hạn là cất đặc hiệu tại vị trí nhận biệt nên tính đặc hiệu của phản ứng PRA là rất cao

Vì thê, cũng với mục tiêu ứng dụng chân đốn lâm sàng, các bước tơi ưu hố nhăm tim ra nơng độ enzyme thích hợp, điều kiện để phản ứng cất thực hiện tơi ưu

cũng như thời gian cần thiệt đề phản ứng cắt cho kết quả,

Các enzyme chỉ hoạt động tơi ưu tại một điều kiện nhât định (pH, nhiệt độ) Ngồi việc tìm ra các điêu kiện thích hợp, chúng ta cũng cân cần nhắc lượng enzyme cắt cho vào phản ứng cũng như thời gian cần thiết để cĩ được sản phẩm cắt mong muơn,

2.2.4.2 Hoa chat va thiét br:

San pham PCR véi méi katGP5 — katGP6

Enzyme cat han chế MspA lÏ cao BioLabs

Buffer ổi KÈHH chon kh ket BioLabs Bồn ủ nhiệt (hay máy luân nhiệt) ee Clifton

2.2.4.3 Tién hanh:

Thử nghiệm tương tác của buffer nhằm hạn chế ảnh hưởng của chúng đến hoạt tính của enzyme MspA lÌ

Thay đổi lượng enzyme cắt hạn chế cho vào phản ứng Thử nghiệm thời gian cat cla enzyme MspAll

Trang 26

2.2.5 Tach chiét nhanh bang chloroform

Vi khuẩn lao cĩ lớp vỏ dày nên việc tách chiết bộ gene V1 khuẩn lao thường

phức tạp và tốn nhiều thời gian cũng như hố chất Do đĩ làm chậm trễ quá trình chân đốn sinh học phân tử đối với các test chân đốn lao

Chloroform cĩ tác dụng biến tính protein mạnh (các protein trên vách tế bào), cĩ thể hồ tan một số chất hữu cơ khơng tan trong nước (vỏ tế bào vi khuẩn lao) Khi được nung nĩng khả năng biến tính protein của chloroform tăng lên

Trong thí nghiệm này chúng tơi tách chiết khuẩn lạc vi khuẩn lao bằng chloroform với tỉ lệ chloroform: nước cất là 1:1

ChlorOÍOrm - .- 1 SE nh nhu Merck

Nước cắt khử ion cccccctieiiererierriei ELGA

Máy nung nhiệt (hoặc bổn ủ) ccccesee Techne Máy VOFf€X TT ng HH HH ưng Genie2

Máy ly tâm - nen nhhhnHHhheiee Eppendorf

- - Bật máy ủ ở nhiệt độ 80C

- _ Đánh dấu các tube cĩ nắp vặn tương ứng

- Luơn luơn tiến hành với ba mẫu chứng trong mỗi lần thực hiện, bao

gom :

ø_ chứng âm: dùng nước cất thay cho mẫu cây

ò chứng dương: lấy từ chủng cĩ kiểu gene hoang dại

ø chứng dương: lấy từ chủng đột biến - Hút 50ul nước cất cho vào mỗi tube

- Lay mét khuẩn lạc từ mơi trường nuơi cấy của từng mẫu cho vào tube

tương ứng (thực hiện trong tủ cấy an tồn cấp dé III)

Trang 27

-CHUONG 2: VAT LIEU— PHUONG PHAP

- Thém SOul chloroform vao méi tube, vortex

- U6 80°C trong 20 phut, vortex

- Ly tam 13200g trong 5 phút,

- _ Nếu khơng thực hiện ngay thì giữ mẫu ở 4°C Khi làm bước tiếp theo

phải ly tâm 13200g trong 5 phúi

2.2.6 Thứ nghiệm tín hiệu quả của thử nghiệm PRA

Nhằm xem xét khả năng ứng dụng thực tế của thử nghiệm Xác định sơ bộ

độ nhạy, độ đặc hiệu của thử nghiệm PRA băng cách so sánh với kết quả kháng

sinh đỗ nuơi cấy và kết quá giải trình tự 2.2.6.2 Hố chất và thiết bị: dNTPs (dATP, đ† TP, dGTP, dCTP) Roche 50 m1 0 -‹- ai Bioline 5110205157152 aai Bioline Biotaq DNA polymerase 5S CHỈ cuc che Bioline CÁC tỖI 0 0202210122211 Proligo Nước cất khứ iOn caro ELGA 001900 1-4 Merck Eppendorf thành mĩng chịu nhiệt 0,2ml Alpha Labs

May VOLO ooo eee Genie2

May nung nhiét (hoac bỒn Ủ) voces Techne

Máy VOTTCX eee HH HH Hà thà net Genie2 Máy ly tain cee ecceteneee steer rereiernenesieciees Eppendorf

May luân nhiỆt 0.0 cece cert ee restrict Eppendorf, Bio-Rad

Trang 28

-CHUONG 2: VAT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.2.6.3 Tién hành:

Thử nghiệm độ nhạy với DNA đã biết nồng độ pha lỗng Thử nghiệm độ nhạy với huyền phù tế bào nuơi cấy pha lỗng

Thử nghiệm độ đặc hiệu với DNA đã biết nồng độ pha lỗng Từ đĩ so sánh

kết quả với các phương pháp khác

Thử nghiệm khả năng ứng dụng của test PRA băng cách thử trên mẫu 29 mẫu

vị khuẩn kháng INH chưa giải trình tự Những mẫu cho kết quá khơng phù hợp,

nghĩa là cho kết quả kiểu gene với test PRA giống chúng nhạy thuốc sẽ được giải trinh tu ving gene katG

* Các bước thực hiện thử nghiệm PRA:

- Tách chiết nhanh bộ gene vi khuẩn lao băng phương pháp ủ với chioroform ở nhiệt độ §0°C trong 20 phút Ly tâm 13000v/ph trong 5 phút, địch nỗi cĩ DNA vị khuẩn lao được dùng cho phản ứng PCR

- _ Thiết lập phản ứng PCR với cặp mdi katGP5 — katGP6 - _ Cắt sản phẩm PCR bang enzyme cất hạn chế MspA II,

- Điện đi xem kết quả phản ứng cắt để phân biệt thê đột biến kháng và thé

Định dạng
Số trang	28
Dung lượng	0,91 MB