nghiên cứu xác định tần số alen, tần số kiểu gen của gen mã hóa αs1-casein có liên quan đến chất lượng sữa ở một số giống dê nuôi tại việt nam

S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Bộ giáo dục đào tạo Viện khoa học và công nghệ Việt Nam VIệN SINH THáI Và TàI NGUYÊN SINH VậT o0o Nguyễn Hùng Thanh Nghiên cứu xác định tần số alen, tần số kiểu gen của gen mã hóa S1 -casein có liên quan đến chất l-ợng sữa ở một số giống dê nuôi tại Việt Nam. Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 Luận án thạc sỹ sinh học Ng-ời h-ớng dẫn khoa học TS. Nguyễn Anh H Ni, 2010 NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác tại Việt Nam. Nguyễn Hùng Thanh Luận án thạc sỹ khoá 12 2 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời cảm ơn cú th hon thnh lun vn ny, trc tiờn, tụi mun by t lng bit n sõu sc ti Ch nhim ti TS. Nguyn Anh - Phũng Sinh hc t bo sinh sn Vin Cụng ngh Sinh hc - Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó nh hng nghiờn cu, trc tip hng dn v ch bo tn tỡnh cho tụi trong sut thi gian nghiờn cu. Tụi cng mong mun c gi li cm n chõn thnh nht ti Ban lónh o v cỏn b Vin Cụng ngh Sinh hc - Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó to iu kin thun li v trang thit b v c s vt cht giỳp tụi hon thnh nghiờn cu ny. Tụi mun c by t lũng bit n chõn thnh ti cỏc cỏn b Phũng Sinh hc t bo sinh sn - Vin Cụng ngh Sinh hc - Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó to iu kin tụi thc hin ti. Tụi xin c cm n s giỳp v to iu kin ca Phũng Min dch hc - Vin Cụng ngh Sinh hc - Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam v Trung tõm Nghiờn cu Dờ v Th Sn Tõy - Ba Vỡ - H Ni Tụi xin c by t lũng bit n chõn thnh ti Ban lónh o v Phũng o to Vin Sinh thỏi v Ti nguyờn Sinh vt - Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó giỳp tụi trong sut thi gian hc tp ti vin. Qua õy, tụi mun c by t lũng bit n chõn thnh ti cỏc thy cụ giỏo tham gia ging dy lp cao hc K12 - Vin Sinh thỏi v Ti nguyờn Sinh vt - Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó giỳp v trang b nhng kin thc hu ớch cho tụi trong sut thi gian hc tp ti vin. Nguyễn Hùng Thanh Luận án thạc sỹ khoá 12 2 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn ti lun vn c thc hin vi s h tr kinh phớ t ti Nghiờn cu xỏc nh tn s alen, tn s kiu gen ca gen mó húa S1-casein cú liờn quan n cht lng sa mt s ging dờ nuụi ti Vit Nam. Cui cựng, tụi xin by t lũng bit n sõu sc ti gia ỡnh, bn bố, nhng ngi ó luụn c v, ng viờn tụi vt qua mi khú khn trong quỏ trỡnh hc tp v nghiờn cu. Hà Nội, ngày 01 tháng 01 năm 2011 Học viên Nguyễn Hùng Thanh NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Chƣơng 1 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI DÊ 1 1.1.1. Tình hình chăn nuôi dê trên thế giới 1 1.1.2. Tình hình chăn nuôi dê ở Việt Nam 3 1.2. ĐẶC ĐIỂM SỮA DÊ 4 1.2.1. Thành phần protein 4 1.2.1.1. Whey protein 4 1.2.1.2. Casein 5 1.2.1.3. Các protein hàm lƣợng thấp 8 1.2.2. So sánh sữa dê với các loại sữa khác 8 1.2.3. Giá trị dinh dƣỡng của sữa dê 12 1.3. PHƢƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG CHỌN GIỐNG DÊ SỮA Ở VIỆT NAM 13 1.3.1. Chọn giống dê sữa cái hƣớng sữa 13 1.3.1.1. Ngoại hình 13 1.3.1.2. Khả năng tiết sữa 14 1.3.1.3. Phẩm chất chăn nuôi 14 1.3.1.4. Dòng giống 14 1.3.2. Chọn dê đực giống hƣớng sữa 14 1.3.2.1. Ngoại hình 14 1.3.2.2. Dòng giống 15 1.3.2.3. Phẩm chất chăn nuôi 15 1.3.2.4. Khả năng thụ tinh 15 1.4. PHƢƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG DÊ SỮA DỰA VÀO CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ, HÓA SINH 15 1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHỌN GIỐNG VẬT NUÔI 17 1.5.1. Microsatellite 17 1.5.2. RAPD 18 1.5.3. RFLP 18 1.5.4. AFLP 19 1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH GEN CSN1S1 Ở DÊ 20 1.6.1. Phân tích protein 20 1.6.1.1. Điện di điểm đẳng điện (IEF) 20 1.6.1.2. Điện di mao quản (CZE) 21 1.6.1.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) 23 1.6.2. Phân tích ADN 24 1.6.2.1. AS-PCR 24 1.6.2.2. PCR-RFLP 25 1.6.2.3. Realtime-PCR 26 1.7. NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN CSN1S1 CỦA DÊ 26 1.7.1. Đặc điểm di truyền của gen CSN1S1 của dê 27 1.7.2. Ứng dụng của các nghiên cứu đa hình di truyền gen CSN1S1của dê 29 Chƣơng 2 34 NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 34 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 34 2.1.1.1. Dê Alpine 34 2.1.1.2. Dê Saanen 36 2.1.2. Mẫu nghiên cứu 37 2.1.3. Các hóa chất và bộ kit 38 2.1.4. Dụng cụ và trang thiết bị 38 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.2.1. Xác định kiểu gen các cá thể 39 2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số 39 2.2.1.2. Thiết kế mồi và thực hiện phản ứng AS - PCR phân biệt alen E và alen non-E 40 2.2.1.3. Thực hiện phản ứng PCR-RFLP phân biệt các alen non-E 43 2.2.1.4. Kỹ thuật phát hiện sản phẩm của phản ứng PCR 45 2.2.2. Định lƣợng một số thành phần của sữa dê 47 2.2.3. Thống kê sinh học 48 Chƣơng 3 49 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 49 3.1. XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CSN1S1 CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU 49 3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ 64 mẫu máu dê sữa 49 3.1.2. Kết quả AS-PCR với cặp mồi (CEX19F-CEX19R -CEX19L) 50 3.1.3. Kết quả PCR-RFLP với cặp mồi (XR-XF) 51 3.1.4. Tần số kiểu gen 52 3.1.4.1. Tần số kiểu gen của dê Alpine 52 3.1.4.2. Tần số kiểu gen của dê Saanen 55 3.1.4. Tần số alen 59 3.1.4.1. Tần số alen của dê Alpine 59 3.1.4.2. Tần số alen của dê Saanen 60 3.2. CÁC CHỈ TIÊU HÓA SINH CỦA SỮA DÊ 62 3.2.1. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh của sữa dê 62 3.2.1.1. Hàm lƣợng protein trong sữa 62 3.2.1.2. Hàm lƣợng casein trong sữa 64 3.2.1.3. Hàm lƣợng lipid trong sữa 65 3.2.1.4. Hàm lƣợng lactose trong sữa 66 3.2.2. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh sữa các kiểu gen CSN1S1 68 3.2.3. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh sữa của hai giống dê nghiên cứu 72 KẾT LUẬN 74 KIẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT AE Elution buffer AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism PCR AL Lysis Buffer AS-PCR Allele specific polymerase chain reaction (PCR đặc hiệu alen) ATL Tissue Lysis Buffer AW Wash buffer CZE Capillary zone electrophoresis (Điện di mao quản) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Gen CSN1S1 Gen mã hóa alpha-S1-casein IEF Isoelectric focusing (Điện di điểm đẳng điện) KCal KiloCalo KJ KiloJun LINE Long interspersed nuclear elements (Các yếu tố rãi rác có kích thƣớc dài) RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA RE Restriction Enzyme (Enzyme cắt giới hạn) RFLP Restriction length fragment polymorphism RP-HPLC Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatographic (Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo) Rpm Revolutions per minute (Vòng/phút) SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis Taq Thermus aquaticus NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Chƣơng 1 Bảng 1.1. So sánh thành phần sữa dê, sữa bò, sữa ngƣời 11 Bảng 1.2. Thành phần amino acid của các loại sữa 13 Bảng 1.3. Giá trị phần trăm diện tích pic so với phân đoạn casein tổng số của các kiểu gen đã đƣợc xác định trƣớc 25 Bảng 1.4. Giá trị phần trăm diện tích pic so với phân đoạn casein tổng số của các kiểu gen đã đƣợc xác định trƣớc 25 Bảng 1.5. Thuộc tính của sữa của các kiểu gen và quá trình chế biến pho mát 34 Bảng 1.6. Chỉ số cảm quan của pho mát 34 Chƣơng 3 Bảng 3.1. Kiểu gen các cá thể dê nghiên cứu 54 Bảng 3.2. Thành phần kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine nghiên cứu 56 Bảng 3.3. Kiểu gen của các cá thể dê Alpine nghiên cứu 57 Bảng 3.4. Thành phần kiểu gen của nhóm cá thể dê Saanen nghiên cứu 58 Bảng 3.5. Tần số alen và tần số kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine 60 Bảng 3.6 Tần số alen và tần số kiểu gen của nhóm cá thể dê Saanen 61 Bảng 3.7. Hàm lƣợng protein trong sữa của các kiểu gen nghiên cứu 63 Bảng 3.8. Hàm lƣợng casein trong sữa của các kiểu gen nghiên cứu 65 Bảng 3.9. Hàm lƣợng lipid trong sữa của các kiểu gen nghiên cứu 66 Bảng 3.10. Hàm lƣợng lactose trong sữa của các kiểu gen nghiên cứu 67 Bảng 3.11. Các chỉ tiêu chất lƣợng sữa của các kiểu gen của dê Alpine 69 Bảng 3.12. Các chỉ tiêu chất lƣợng sữa của các kiểu gen của dê Saanen 70 Bảng 3.13. Chỉ tiêu chất lƣợng sữa ở hai giống dê sữa Alpine và Saanen của Italia 71 NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.14. Các chỉ tiêu chất lƣợng sữa có ảnh hƣởng tới sản xuất pho mát 72 DANH MỤC HÌNH Chƣơng 1 Hình 1.1. Điện di đồ SDS-PAGE của casein sữa 9 Hình 1.2. Cấu tạo một micelle casein 10 Hình 1.3. Điện di điểm đẳng điện với gradient pH 2,5-5,0 và 4,0-6,5 các mẫu sữa 23 Hình 1.4. Hình ảnh điện di mao quản của các mẫu sữa 24 Hình 1.5. Sắc ký đồ RP-HPLC của các mẫu casein đã đƣợc phân tích trƣớc đó bằng IEF và PCR 26 Hình 1.6. Đồ thị tín hiệu huỳnh quang và nhiệt độ của phản ứng Realtime-PCR 28 Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc gen CSN1S1 của dê và bò, gen CSN1S1 dài 17,5 kb, bao gồm 19 exon 29 Hình 1.8. Sơ đồ quá trình đột biến tạo thành các alen CSN1S1 34 Chƣơng 2 Hình 2.1. Dê Alpine 36 Hình 2.2. Bản đồ phân bố dê Alpine 37 Hình 2.3. Dê Saanen 38 Hình 2.4. Bản đồ phân bố dê Saanen 39 Hình 2.5. Trình tự phân đoạn của gen CSN1S1 và vị trí các primer 43 Hình 2.6. Kiểu mẫu của alen E của CSN1S1 locut thực hiện bằng AS- PCR 44 Hình 2.7. Phân tích kiểu gen của các đối tƣợng quan sát bằng phƣơng pháp XmnI PCR-RFLP 46 Hình 2.8. Các bƣớc đúc gel agarose 47 NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 2.9. Sơ đồ lắp đặt máy chạy điện di ADN 49 Chƣơng 3 Hình 3.1. Điện di đồ ADN tổng số tách từ mẫu máu dê 51 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR của cá thể có kiểu gen A*A*, A*E và EE 52 Hình 3.3. Điện di đồ các cá thể có alen non-E 53 Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR cắt bằng enzyme XmnI. 54 Hình 3.5. Tần số các kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine 56 Hình 3.6. Tần số các kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine 59 Hình 3.7. Tần số alen của nhóm cá thể dê Alpine nghiên cứu 61 Hình 3.8. Tần số alen nhóm cá thể dê Saanen nghiên cứu 62 Hình 3.9. Biểu đồ tần số alen của 2 giống dê nghiên cứu 63 Hình 3.9. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng protein trong sữa của các kiểu gen 64 Hình 3.11. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng casein trong sữa của các kiểu gen 66 Hình 3.12. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng lipid trong sữa của các kiểu gen 67 Hình 3.13. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng lactose trong sữa của các kiểu gen 68 Hình 3.14. Biểu đồ so sánh các chỉ tiêu chất lƣợng sữa của các kiểu gen CSN1S1 của dê Alpine 69 Hình 3.15. Biểu đồ so sánh các chỉ tiêu chất lƣợng sữa của các kiểu gen CSN1S1 của dê Saanen 70 Hình 3.16. Biểu đồ so sánh các chỉ tiêu chất lƣợng sữa của 2 giống dê 72 [...]... cu thc tin ú, chỳng tụi tin hnh ti nghiờn cu: Nghiờn cu xỏc nh tn s alen, tn s kiu gen ca gen mó húa S1casein cú liờn quan n cht lng sa mt s ging dờ nuụi ti Vit Nam. Trong lun vn ny chỳng tụi trỡnh by kt qu iu tra ban u v xỏc nh tn s alen, tn s kiu gen ca locut CSN1S1 hai ging dờ sa nhp ni Alpine v Saanen v ỏnh giỏ bc u mi liờn quan ca chỳng vi cht lng sa Hy vng nhng kt qu nhn c s úng gúp vo chng... cũn chu s chi phi ca cỏc gen di truyn v mi liờn quan gia cỏc gen, enzyme, protein trong s hỡnh thnh v phỏt trin ca ng vt Nhng tớnh trng y l kt qu tng tỏc ca nhiu quỏ trỡnh phc tp trong s biu hin ca genotype thnh phenotype v ó c cỏc chuyờn gia nm bt cỏc quy lut sinh hc ng dng trong vic tiờn oỏn sm nng sut v lai chn ging ng vt chn nuụi Theo Dubinin, vic tỡm ra c cỏc mi tng quan gia cỏc ch tiờu sinh... trin chn nuụi dờ, cu trong khu vc [4] 1.1.2 Tỡnh hỡnh chn nuụi dờ Vit Nam Vit Nam ngh chn nuụi dờ ó cú t lõu i, nhng theo phng thc qung canh t tỳc t phỏt Qua s liu ca Tng cc thng kờ nm 1999 tng n dờ ca c nc cú 530.000 con, trong ú 72,5% phõn b min Bc, 27,5% min Nam (Tõy Nguyờn chim 12,3%; duyờn hi min Trung chim 8,9%, ụng v Tõy Nam B ch chim 2,1 v 3,8%) n dờ vựng nỳi phớa Bc chim 48% tng n dờ ca... cho phộp xỏc nh chớnh xỏc v sm kiu gen ca cỏc locus gen mó hoỏ protein sa cỏc cỏ th dờ khụng ph thuc la tui v gii tớnh Trong s bn loi casein sa dờ (S1-, S2-, - v -casein) thỡ S1casein l a hỡnh nht Alen A cú tỏc dng ỏng k lờn hm lng protein, hm lng casein, hm lng lipid v cỏc c tớnh sn xut khi so sỏnh vi alen E v F [78] Sn lng pho mỏt ca kiu gen AA cao hn 15% kiu gen FF v cú mựi thm d chu hn [65] [67]... s ca cỏc kiu gen ó c xỏc nh trc [55] Kiu gen % din tớch AA 28,67 22 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Hùng Thanh Luận án thạc sỹ khoá 12 BB 31,67 EE 10,35 FF 4,20 AE 18,74 BE 8,12 BF 5,65 EF 6,77 1.6.1.3 Sc ký lng hiu nng cao pha o (RP-HPLC) Bng 1.4 Giỏ tr phn trm din tớch pic so vi phõn on casein tng s ca cỏc kiu gen ó c xỏc nh trc [58] Kiu gen % din tớch... cỏc phng phỏp chn lc truyn thng [6] Phng phỏp ny cho phộp xỏc nh chớnh xỏc v sm kiu gen ca cỏc locut gen mó hoỏ protein sa cỏc cỏ th dờ khụng ph thuc la tui v gii tớnh 1.5.1 Microsatellite Da trờn trỡnh t ADN microsatellite c bo tn cỏc cỏ th cựng loi cho phộp chỳng ta thit k mi khuch i trỡnh t lp li trong ton b kiu gen, trỡnh t mi s dng trỡnh t c hiu hai u locut microsatellite Kt qu to ra cỏc on... t c s húa sinh ca quỏ trỡnh phỏt trin ging, cỏ th do h s di truyn, h gen thụng qua h thng enzyme iu khin, kim tra hng ca quỏ trỡnh trao i cht Cỏc enzyme aminotransferase (GOT, GPT) v phosphatase (kim, acid) liờn quan n trao i protein, acid nucleic l yu t quyt nh tng trng, cht lng tht, sa, mc tiờu tn thc n v cỏc ch tiờu khỏc liờn quan n phm ging, nng sut v cht lng vt nuụi Trong thc t chn ging, nm... chm xut hin nhng t bo lao, viờm khp, cỏc bnh liờn quan n nhng triu chng ca rut v viờm loột Cỏc nh khoa hc tỡm thy trong cht bộo ca sa dờ acid capric cha 6 n cht cacbon to thnh mng ngn chng li s xõm nhp ca vi trựng, bo v c th khi s tn cụng ca virus, vi khun b lờn men v vi khun gõy bnh rut [19, 21, 41, 67, 70] 1.3 PHNG PHP TRUYN THNG CHN GING Dấ SA VIT NAM 1.3.1 Chn ging dờ sa cỏi hng sa Cht lng dờ sa... http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Hùng Thanh Luận án thạc sỹ khoá 12 Chng 1 TNG QUAN TI LIU 1.1 TèNH HèNH CHN NUễI Dấ 1.1.1 Tỡnh hỡnh chn nuụi dờ trờn th gii Theo s liu ca FAO (1996), hin nay trờn th gii cú khong 592 triu con dờ v c phõn b cỏc vựng nh sau: - Chõu : 359 triu con, chim 60,6% - Chõu Phi: 172 triu con, chim 29,1% - Nam M: 23 triu con, chim 3,9% - Bc M: 16 triu con, chim 2,6% - Chõu u: 14 triu...Nguyễn Hùng Thanh Luận án thạc sỹ khoá 12 M U Hin nay Vit Nam ngh nuụi dờ sa ang c Nh nc quan tõm v phỏt trin mnh m ti cỏc trung tõm chn nuụi v cỏc h nụng dõn Vỡ vy nhu cu v con ging v cụng tỏc chn ging ngy cng cao Cỏc k thut sinh hc phõn t hin nay ó cho phộp chn lc con vt . số kiểu gen của gen mã hóa α S1 - casein có liên quan đến chất lượng sữa ở một số giống dê nuôi tại Việt Nam. ” Trong luận văn này chúng tôi trình bày kết quả điều tra ban đầu về xác định tần. Tần số kiểu gen 52 3.1.4.1. Tần số kiểu gen của dê Alpine 52 3.1.4.2. Tần số kiểu gen của dê Saanen 55 3.1.4. Tần số alen 59 3.1.4.1. Tần số alen của dê Alpine 59 3.1.4.2. Tần số alen của dê. Thành phần kiểu gen của nhóm cá thể dê Saanen nghiên cứu 58 Bảng 3.5. Tần số alen và tần số kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine 60 Bảng 3.6 Tần số alen và tần số kiểu gen của nhóm cá thể dê Saanen