Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc phỏt hiện khi cho sản phẩm điện di trờn gel agarose hoặc thạch poly-acrylamide (hay dựng nhất là gel agarose 0,8%).
Bƣớc 1: Đỳc gel agarose 2% (Hỡnh 2.8)
- Lấy 1,0 g agarose nguyờn chất (dạng bột khụ) cho vào cốc đong thủy tinh chịu nhiệt.
- Đổ vào cốc trờn 40 ml dung dịch TAE 1 lần (TAE gồm cú cỏc thành phần: đệm Tris, acid acetic glacial, EDTA)
- Cho cốc vào lũ vi súng trong 3 phỳt để agarose tan chảy hết. - Cho 10 l ethidium bromide (1 mg/ml) vào thạch.
- Gài lƣợc cú nhiều răng cƣa (tựy theo số lƣợng mẫu cần chạy mà bố trớ lƣợc cú 8 hay 17 răng) vào khay của hệ thống điện di.
- Đổ thạch ngập răng lƣợc khoảng 0,5 cm và để nguội ở nhiệt độ phũng (thạch 2% sẽ đụng lại sau 60-90 phỳt)
- Khi nguội tạo thành thạch, cỏc răng lƣợc sẽ tạo thành cỏc lỗ để chỳng ta cho mẫu vào kiểm tra.
- Dỡm ngập khay thạch trong hộp điện di chứa dung dịch đệm TAE 1 lần (đệm TAE cung cấp ion cho điện trƣờng hoạt động).
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 46 -
Hỡnh 2.8. Cỏc bƣớc đỳc gel agarose 2%
1,2. Chuẩn bị khay; 3. Gài lƣợc nhiều răng cƣa vào khay; 4. Đổ thạch vào khay; 5. Dỡm ngập khay thạch trong hộp điện di
Bƣớc 2: Tra mẫu
- Lấy 5-10 l sản phẩm PCR trộn với chỉ thị màu (khoảng 1 l xanh Bromophenol) và một ớt nƣớc.
- Tra riờng biệt vào từng lỗ trong thạch. Chỉ thị phõn tử đƣợc tra vào trong một lỗ riờng biệt khỏc (thƣờng là lỗ ngoài cựng của bản thạch).
Bƣớc 3: Chạy điện di
- Nối hệ thống điện di với nguồn điện một chiều, cực õm ở phớa đầu của bản thạch, cực dƣơng ở phớa cuối, ADN sẽ chuyển dịch từ cực õm sang cực dƣơng.
- Duy trỡ dũng điện một chiều ở hiệu điện thế 100 mV, cƣờng độ 250 mA trong thời gian 30-35 phỳt.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 47 -
- Sau khi chạy điện di xong thỡ cắt nguồn điện, lấy bản thạch rửa sơ bộ bằng nƣớc.
- Đƣa bản thạch vào mỏy soi cú nguồn cực tớm xuyờn qua. ADN đƣợc nhuộm sẽ hiển thị rừ dƣới tia cực tớm.
- Chụp ảnh lƣu giữ mẫu ADN cần kiểm tra.
Hỡnh 2.9. Sơ đồ lắp đặt mỏy chạy điện di ADN