- Nếu cú alen non-E sẽ tiếp tục sử dụng PCR-RFLP để phõn biệt cỏc nhúm alen. Sự khỏc biệt giữa cỏc alen F, N, A* (CSN1S1 A, G, H, I, O1, O2) và B* (CSN1S1 B1, B2, B3, B4, C, E, L) theo phƣơng phỏp XmnI PCR-RFLP [54]. Thiết kế mồi theo Ramunno và cộng sự (2000) gồm 2 mồi:
Mồi xuụi (XF): 5’- TTCTAAAAGTCTCAGAGGCAG -3’ gồm 21 nucleotide
Mồi ngược (XR): 5’- GGGTTGATAGCCTTGTATGT -3’ gồm 20 nucleotide
Thành phần phản ứng PCR đƣợc hỗn hợp trong 1 ống nghiệm PCR (ống plastic chịu nhiệt, cú dung tớch 0,2ml), nhƣ sau: 50 μl hỗn hợp phản ứng chứa 5 μl ADN tổng số, 2 μl mỗi loại mồi (nồng độ 10 pmol), 25 μl PCR mastermix 2X, 13 μl nƣớc.
- Chƣơng trỡnh cho chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR bao gồm:
Bƣớc 1: 94oC trong 3 phỳt: 1 chu kỳ
Bƣớc 2: 94oC trong 30 giõy
Bƣớc 3: 55oC trong 30 giõy
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 44 -
Lặp lại 35 chu kỳ bắt đầu từ bƣớc 2
Bƣớc 5: 72oC trong 10 phỳt: 1 chu kỳ
■ Sản phẩm đƣợc cắt bằng enzyme XmnI là enzyme cắt đầu bằng cú trỡnh tự cắt:
5'-G A A N N^N N T T C-3'
3'-C T T N N^N N A A G-5'
20 μl sản phẩm PCR đƣợc cắt với 10 đơn vị XmnI endonuclease ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 4 giờ.
Phõn tớch sản phẩm cắt bằng agarose gel 4%, nhuộm với ethidium bromide.
Hỡnh 2.7. Phõn tớch kiểu gen của cỏc đối tƣợng quan sỏt bằng phƣơng phỏp
XmnI PCR-RFLP. Chỳ thớch: M: marker 50bp; 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13: mẫu mỏu; 2, 4, 6, 8, 10, 12: mẫu sữa. Alen F cho băng 223 bp, A* (CSN1S1 A, O1, N) cho băng 63 và 150 bp, B* (CSN1S1 B, E) cho băng 63 và 161 bp. Điện di trờn gel agarose 4% [31].
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 45 -