2.1.1. Đối tƣợng nghiờn cứu
Dờ (Capra hircus), là gia sỳc nhỏ cú sừng, bộ Guốc chẵn (Artiodactyla), phõn bộ Nhai lại (Ruminantia), họ Bũ (Bovidae), phõn họ Dờ (Caprovinae), đƣợc thuần hoỏ ở thời kỡ đồ đỏ từ hai loài dờ rừng (Capra aegagerus và Capra falconeri) [83].
2.1.1.1. Dờ Alpine
Hỡnh 2.1. Dờ Alpine [7]
● Nguồn gốc
Giống dờ Alpine đƣợc tạo từ vựng nỳi Alpine (Phỏp). Giống dờ này đƣợc nhập từ Phỏp năm 1998, từ Mỹ năm 2002 [7].
● Phõn bố
Hiện nay dờ Alpnie đƣợc nuụi ở Trung tõm Nghiờn cứu Dờ và Thỏ - Sơn Tõy - Hà Nội và Ninh Thuận [7].
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 35 -
Hỡnh 2.2. Bản đồ phõn bố dờ Alpine [7]
● Hỡnh thỏi
Màu lụng đa dạng nhƣng chủ yếu nõu hoặc đen cú loang trắng hoặc kết hợp cỏc màu lụng trờn, lụng ngắn. Con đực thƣờng cú lụng dài dọc hai xƣơng sống, tai nhỏ cuộn trũn và dựng đứng.
Khối lƣợng dờ sơ sinh khoảng 2,7-3,0 kg/con. Lỳc trƣởng thành con cỏi cao khoảng 0,75m và nặng khoảng 50 kg; con đực cao khoảng 0,85-1m và nặng khoảng 75kg [7].
● Năng suất và sản phẩm
Dờ Alpine là giống kiờm dụng sữa - thịt. Dờ Alpine Bắt đầu phối giống lỳc 9-10 thỏng tuổi. Mỗi năm dờ Alpine đẻ 1,3 lứa; mỗi lứa đẻ 1,4 con. Mỗi
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 36 -
ngày dờ cho khoảng 2,0 -2,5 kg sữa; chu kỳ cho sữa 265 ngày; sản lƣợng sữa/chu kỳ là khoảng 645 kg. Tỉ lệ mỡ sữa khoảng 3,6% [7].
2.1.1.2. Dờ Saanen
Hỡnh 2.3. Dờ Saanen
● Nguồn gốc
Saanen là giống dờ Thụy Sỹ đƣợc nhập từ Phỏp năm 1998, từ Mỹ năm 2002 [7].
● Phõn bố
Hiện nay dờ Saanen đƣợc nuụi ở Trung tõm Nghiờn cứu Dờ và Thỏ - Sơn Tõy - Hà Nội [7].
● Hỡnh thỏi
Đặc diểm hỡnh thỏi của dờ Saanen: Lụng ngắn màu trắng hoặc màu sữa. Da cú đốm đen hoặc màu nõu vàng nhạt ở tai, mũi, vỳ. Tai đứng, cuộn trũn và hƣớng ra phớa trƣớc. Đầu thon, lƣng thẳng, thõn hỡnh nờm, ngực nở. Khối lƣợng dờ sơ sinh khoảng 3,0-3,3 kg/con. Lỳc trƣởng thành con cỏi cao khoảng 0,80m và nặng khoảng 60 kg; con đực cao khoảng 0,94m và nặng khoảng 80kg [7].
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 37 -
Hỡnh 2.4. Bản đồ phõn bố dờ Saanen [7].
● Năng suất và sản phẩm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dờ Saanen là giống chuyờn dụng sữa. Bắt đầu phối giống lỳc 235 thỏng tuổi. Mỗi ngày dờ cho khoảng 2,8 kg sữa; chu kỳ cho sữa 264 ngày; sản lƣợng sữa/chu kỳ là khoảng 756 kg. Tỉ lệ mỡ sữa khoảng 3-4% [7].
2.1.2. Mẫu nghiờn cứu
Nguyờn liệu dựng để tỏch ADN tổng số là 64 mẫu mỏu đƣợc chống đụng bằng EDTA của 64 dờ sữa tại Trung tõm Nghiờn cứu Dờ và Thỏ - Sơn Tõy - Hà Nội.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 38 -
Mẫu sữa của 14 dờ sữa Saanen và 15 dờ sữa Alpine trong số 64 dờ sữa nghiờn cứu đƣợc lấy ngay tại cỏc chuồng nuụi sau đú đƣợc bảo quản lạnh dƣới +4oC trƣớc khi đem phõn tớch.
2.1.3. Cỏc húa chất và bộ kit
Cỏc húa chất và bộ kit dựng trong nghiờn cứu đều đặt mua từ cỏc cụng ty húa chất đạt tiờu chuẩn quốc tế:
Kit tỏch ADN: DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen - Mỹ) và Genomic ADN Purification Kit (Fermentas - Đức).
2X PCR mastermix (Fermentas - Đức).
Nuclease-free water (Fermentas - Đức).
XmnI Restriction Enzyme (Fermentas - Đức).
GeneRuler™ 50 bp ADN Ladder, ready-to-use (Fermentas - Đức).
Primer đặt mua của hóng Bioneer - Hàn Quốc.
Ngoài ra cũn cú cỏc húa chất thớ nghiệm thụng thƣờng khỏc.
2.1.4. Dụng cụ và trang thiết bị
Cỏc mỏy múc và thiết bị chuyờn dụng của Viện Cụng nghệ sinh học:
Mỏy gia nhiệt MJ Research PTC-200 Thermo Cycler (Mỹ).
Mỏy soi gel và chụp ảnh tự động (Dolphin- Doc, WEALTEC - Mỹ).
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 39 -
Mỏy khuấy trộn Vortex (Bio- Rad).
Bộ điện di ADN và bộ nguồn điện di (Bio- Rad).
Mỏy khuấy từ gia nhiệt RH basic (IKA - Đức).
Tủ lạnh sõu -200 C và -700C Sanyo (Nhật Bản). Tủ lạnh thƣờng Sanyo (Nhật Bản). Lũ vi súng (Samsung - Hàn Quốc). Pipet tự động cỏc loại. Cỏc dụng cụ thớ nghiệm thụng thƣờng khỏc.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.2.1. Xỏc định kiểu gen cỏc cỏ thể 2.2.1. Xỏc định kiểu gen cỏc cỏ thể 2.2.1.1. Tỏch chiết ADN tổng số
Tỏch chiết ADN tổng số bằng 2 bộ kit: DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) và Genomic ADN Purification Kit (Fermentas).
Quy trỡnh tỏch tinh sạch ADN tổng số bằng bộ húa chất DNeasy Blood & Tissue Kit của hóng Qiagen:
Bƣớc 1: Lấy 100 àl mỏu dờ đó đƣợc chống đụng bằng EDTA vào ống eppendorf 1,5 ml.
Bƣớc 2: Thờm 180l dung dịch ATL vào ống. Thờm tiếp 20l dung dịch Proteinase K và 4l dung dịch RNase-A. Ủ ống eppendorf ở nhiệt độ 550C trong 2 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bƣớc 3: Thờm tiếp 200l dung dịch AL. Ủ ống eppendorf ở nhiệt độ 700C trong 30 phỳt.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 40 -
Bƣớc 4: Thờm tiếp 200l cồn tuyệt đối, vortex trong 15 giõy. Chuyển chất lỏng trong ống sang cột DNeasy. Ly tõm 13000 rpm trong thời gian 01 phỳt sau đú đổ bỏ dung dịch trong ống eppendorf.
Bƣớc 5: Thờm 500l dung dịch AW1 vào ống eppendorf. Ly tõm 13000 rpm trong thời gian 01 phỳt sau đú đổ bỏ dung dịch trong ống eppendorf.
Bƣớc 6: Thờm 500l dung dịch AW2 vào ống eppendorf. Ly tõm 13000 rpm trong thời gian 01 phỳt sau đú đổ bỏ dung dịch trong ống eppendorf. Chuyển cột sang ống eppendorf mới.
Bƣớc 7: Thờm 60l dung dịch AE, để ở nhiệt độ phũng (250C) trong 2 phỳt. Ly tõm 13000 rpm trong thời gian 01 phỳt.
Kết quả là sẽ thu được ADN tổng số trong ống eppendorf. Bảo quản lõu dài ở nhiệt độ -200C đến khi sử dụng.
2.2.1.2. Thiết kế mồi và thực hiện phản ứng AS - PCR phõn biệt alen E và alen non-E alen non-E
* Thiết kế mồi
Phản ứng PCR tiến hành với 3 mồi:
CEX19F: 5′-TCAGGAGCAGTGGGTATGTG-3′
CEX19R: 5′- CCTCCCAATGGAATAATGACA-3′
CEX19L: 5′-TGTTTGGGAACGCATGTAAG-3′
Cặp mồi đầu tiờn (CEX19F - CEX19R) cho phộp khuếch đại vựng kộo dài của exon thứ 19 và vựng lõn cận. Mồi thứ 3 (CEX19L) là trỡnh tự đặc trƣng của alen E vỡ nú bổ sung với vựng phớa trong của đoạn chốn LINE. Cặp mồi
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 41 -
(CEX19F - CEX19L) cho phộp khuếch đại một phần exon 18, đoạn kộo dài của exon 19 và 144 bp của trỡnh tự LINE.
Hỡnh 2.5. Trỡnh tự phõn đoạn của gen CSN1S1 và vị trớ cỏc primer [57].
(A) CSN1S1, alen A (từ GenBank AJ504710): exon thứ 19 đƣợc in đậm và nghiờng. Cỏc primer CEX19F and CEX19R đƣợc in đậm và gạch dƣới. Điểm chốn của yếu tố LINE đƣợc chỉ bằng dấu //.
(B) CSN1S1 alen E (từ GenBank FJ164044): exon thứ 19 đƣợc in đậm và nghiờng.
Primer EX19LINE đƣợc in đậm và gạch dƣới. Đoạn chốn LINE đƣợc in đậm.
* Thực hiện phản ứng
- Thành phần phản ứng PCR đƣợc hỗn hợp trong 1 ống nghiệm PCR (ống plastic chịu nhiệt, cú dung tớch 0,2ml), nhƣ sau: 50 μl hỗn hợp phản ứng chứa 5 μl ADN tổng số, 2 μl mỗi loại mồi (nồng độ 10 pmol), 25 μl PCR mastermix 2X, 11 μl nƣớc.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 42 -
- Chƣơng trỡnh cho chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR bao gồm:
Bƣớc 1: 94oC trong 3 phỳt: 1 chu kỳ
Bƣớc 2: 94oC trong 30 giõy
Bƣớc 3: 59oC trong 30 giõy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bƣớc 4: 72oC trong 30 giõy)
Lặp lại 35 chu kỳ bắt đầu từ bƣớc 2
Bƣớc 5: 72oC trong 10 phỳt: 1 chu kỳ
- Để xỏc định alen E tiến hành phản ứng PCR sau đú điện di trờn gel agarose 2%. Biến thể E đƣợc khuếch đại tạo băng 437 bp, ở alen A*(non-E) đƣợc khuếch đại cho băng 583 bp.
Hỡnh 2.6. Kiểu mẫu của alen E của CSN1S1 locut thực hiện bằng AS-PCR.
Khuếch đại phõn đoạn exon 19 của αS1 casein phõn tỏch trờn 2% agarose gel. M: marker 100 bp; 2 cỏ thể đồng hợp tử alen E (437 bp); 1 cỏ thể dị hợp alen E (437 and 583 bp) và một cỏ thể đồng hợp alen non-E (583 bp) [57]
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 43 -
2.2.1.3. Thực hiện phản ứng PCR-RFLP phõn biệt cỏc alen non-E
- Nếu cú alen non-E sẽ tiếp tục sử dụng PCR-RFLP để phõn biệt cỏc nhúm alen. Sự khỏc biệt giữa cỏc alen F, N, A* (CSN1S1 A, G, H, I, O1, O2) và B* (CSN1S1 B1, B2, B3, B4, C, E, L) theo phƣơng phỏp XmnI PCR-RFLP [54]. Thiết kế mồi theo Ramunno và cộng sự (2000) gồm 2 mồi:
Mồi xuụi (XF): 5’- TTCTAAAAGTCTCAGAGGCAG -3’ gồm 21 nucleotide
Mồi ngược (XR): 5’- GGGTTGATAGCCTTGTATGT -3’ gồm 20 nucleotide
Thành phần phản ứng PCR đƣợc hỗn hợp trong 1 ống nghiệm PCR (ống plastic chịu nhiệt, cú dung tớch 0,2ml), nhƣ sau: 50 μl hỗn hợp phản ứng chứa 5 μl ADN tổng số, 2 μl mỗi loại mồi (nồng độ 10 pmol), 25 μl PCR mastermix 2X, 13 μl nƣớc.
- Chƣơng trỡnh cho chu trỡnh nhiệt của phản ứng PCR bao gồm:
Bƣớc 1: 94oC trong 3 phỳt: 1 chu kỳ
Bƣớc 2: 94oC trong 30 giõy
Bƣớc 3: 55oC trong 30 giõy
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 44 -
Lặp lại 35 chu kỳ bắt đầu từ bƣớc 2
Bƣớc 5: 72oC trong 10 phỳt: 1 chu kỳ
■ Sản phẩm đƣợc cắt bằng enzyme XmnI là enzyme cắt đầu bằng cú trỡnh tự cắt:
5'-G A A N N^N N T T C-3'
3'-C T T N N^N N A A G-5'
20 μl sản phẩm PCR đƣợc cắt với 10 đơn vị XmnI endonuclease ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 4 giờ.
Phõn tớch sản phẩm cắt bằng agarose gel 4%, nhuộm với ethidium bromide.
Hỡnh 2.7. Phõn tớch kiểu gen của cỏc đối tƣợng quan sỏt bằng phƣơng phỏp
XmnI PCR-RFLP. Chỳ thớch: M: marker 50bp; 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13: mẫu mỏu; 2, 4, 6, 8, 10, 12: mẫu sữa. Alen F cho băng 223 bp, A* (CSN1S1 A, O1, N) cho băng 63 và 150 bp, B* (CSN1S1 B, E) cho băng 63 và 161 bp. Điện di trờn gel agarose 4% [31].
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 45 - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.1.4. Kỹ thuật phỏt hiện sản phẩm của phản ứng PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc phỏt hiện khi cho sản phẩm điện di trờn gel agarose hoặc thạch poly-acrylamide (hay dựng nhất là gel agarose 0,8%).
Bƣớc 1: Đỳc gel agarose 2% (Hỡnh 2.8)
- Lấy 1,0 g agarose nguyờn chất (dạng bột khụ) cho vào cốc đong thủy tinh chịu nhiệt.
- Đổ vào cốc trờn 40 ml dung dịch TAE 1 lần (TAE gồm cú cỏc thành phần: đệm Tris, acid acetic glacial, EDTA)
- Cho cốc vào lũ vi súng trong 3 phỳt để agarose tan chảy hết. - Cho 10 l ethidium bromide (1 mg/ml) vào thạch.
- Gài lƣợc cú nhiều răng cƣa (tựy theo số lƣợng mẫu cần chạy mà bố trớ lƣợc cú 8 hay 17 răng) vào khay của hệ thống điện di.
- Đổ thạch ngập răng lƣợc khoảng 0,5 cm và để nguội ở nhiệt độ phũng (thạch 2% sẽ đụng lại sau 60-90 phỳt)
- Khi nguội tạo thành thạch, cỏc răng lƣợc sẽ tạo thành cỏc lỗ để chỳng ta cho mẫu vào kiểm tra.
- Dỡm ngập khay thạch trong hộp điện di chứa dung dịch đệm TAE 1 lần (đệm TAE cung cấp ion cho điện trƣờng hoạt động).
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 46 -
Hỡnh 2.8. Cỏc bƣớc đỳc gel agarose 2%
1,2. Chuẩn bị khay; 3. Gài lƣợc nhiều răng cƣa vào khay; 4. Đổ thạch vào khay; 5. Dỡm ngập khay thạch trong hộp điện di
Bƣớc 2: Tra mẫu
- Lấy 5-10 l sản phẩm PCR trộn với chỉ thị màu (khoảng 1 l xanh Bromophenol) và một ớt nƣớc.
- Tra riờng biệt vào từng lỗ trong thạch. Chỉ thị phõn tử đƣợc tra vào trong một lỗ riờng biệt khỏc (thƣờng là lỗ ngoài cựng của bản thạch).
Bƣớc 3: Chạy điện di
- Nối hệ thống điện di với nguồn điện một chiều, cực õm ở phớa đầu của bản thạch, cực dƣơng ở phớa cuối, ADN sẽ chuyển dịch từ cực õm sang cực dƣơng.
- Duy trỡ dũng điện một chiều ở hiệu điện thế 100 mV, cƣờng độ 250 mA trong thời gian 30-35 phỳt.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 47 -
- Sau khi chạy điện di xong thỡ cắt nguồn điện, lấy bản thạch rửa sơ bộ bằng nƣớc.
- Đƣa bản thạch vào mỏy soi cú nguồn cực tớm xuyờn qua. ADN đƣợc nhuộm sẽ hiển thị rừ dƣới tia cực tớm.
- Chụp ảnh lƣu giữ mẫu ADN cần kiểm tra.
Hỡnh 2.9. Sơ đồ lắp đặt mỏy chạy điện di ADN
2.2.2. Định lƣợng một số thành phần của sữa dờ
Định lƣợng một số thành phần của sữa dờ tại Trung tõm Kỹ thuật Tiờu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng 1 - Tổng cục Tiờu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng:
- Hàm lƣợng protein tổng số: TCVN 5537-91 - Hàm lƣợng protein: TCVN 4328/1-2007
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- 48 -
- Hàm lƣợng lipid tổng số: TN4/HD/351 - Hàm lƣợng lactose: TN4/HD/352
- Xỏc định hàm lƣợng casein trong sữa dờ theo phƣơng phỏp của Liờn đoàn bơ sữa quốc tế (1964):
Bƣớc 1: Tỏch mỡ bằng cỏch ly tõm 4000 rpm trong 10 phỳt ở 4oC, loại lớp chất bộo nổi ở phớa trờn.
Bƣớc 2: Pha loóng cỏc mẫu sữa đó tỏch bộo 5 lần, 10 lần, 20 lần bằng nƣớc cất 2 lần.
Bƣớc 3: Kết tủa casein trong sữa pha loóng bằng cỏch thờm dung dịch đệm acetat 2M pH 4,6 với tỉ lệ sữa:đệm = 1:20, khuấy từ 10 phỳt ở 40oC. Ly tõm 2 lần 15000 rpm trong 10 phỳt ở 4oC, thu dịch nổi. Dich nổi thu đƣợc chớnh là dung dịch protein sữa khụng casein.
Tớnh lƣợng casein trong sữa theo cụng thức: Hàm lƣợng casein = Hàm lƣợng protein tổng số - Hàm lƣợng protein phi casein
Kết quả thu đƣợc là kết quả trung bỡnh của 3 nồng độ pha loóng.
2.2.3. Thống kờ sinh học
- Phõn tớch đỏnh giỏ tần số alen và tần số kiểu gen và kiểm tra sự khỏc biệt di truyền của cỏc giống dờ.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 49 -
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CSN1S1 CỦA CÁC MẪU NGHIấN CỨU 3.1.1. Tỏch chiết ADN tổng số từ 64 mẫu mỏu dờ sữa. 3.1.1. Tỏch chiết ADN tổng số từ 64 mẫu mỏu dờ sữa.
Cỏc mẫu mỏu lấy tại Trung tõm Nghiờn cứu Dờ và Thỏ - Sơn Tõy - Hà Nội và đƣợc chống đụng bằng EDTA 0,5M; giữ trong ống EDTA và bảo quản lạnh trong ngăn mỏt tủ lạnh trƣớc khi tỏch ADN.
Hỡnh 3.1. Điện di đồ ADN tổng số tỏch từ mẫu mỏu dờ
Chỳ thớch: M: Lambda ADN/HindIII marker
Chỳng tụi đó tỏch thành cụng ADN tổng số từ mẫu mỏu của 64 cỏ thể dờ gồm 30 mẫu của giống Alpine và 34 mẫu của giống Saanen bằng hai bộ kit: DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) và Genomic DNA Purification Kit (Fermentas).
Sản phẩm ADN tổng số đƣợc bảo quản lõu dài ở -20oC để sử dụng cho cỏc phản ứng tiếp theo.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- 50 -
3.1.2. Kết quả AS-PCR với cặp mồi (CEX19F-CEX19R -CEX19L)
Phản ứng PCR với cặp mồi (CEX19F- CEX19R -CEX19L)
Hỡnh 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR của cỏ thể cú kiểu gen A*A*, A*E và EE
Chỳ thớch: M: GenRuler™ 50 bp ADN Ladder, A*: alen non-E. 1, 2, 6: EE; 4,