Để thu DNA tổng số phục vụ cho nhân bản và giải trình tự gen, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp CTAB: là phƣơng pháp sử dụng chất có hoạt tính bề mặt là cation CTAB. Đây là phƣơng pháp đơn giản nhất thƣờng đƣợc sử dụng để tách chiết DNA từ thực vật dựa trên nguyên lý chung sau:
- Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân.
Nghiền các mô, tế bào bằng biện pháp cơ học: nghiền trong đá khô, nitơ lỏng bằng cối, chày sứ để phá vỡ thành cellulose, giải phóng các thành phần trong tế bào. Sử dụng đệm có chất tẩy (CTAB) để phá vỡ màng bào, giải phóng DNA. Sử dụng các loại hóa chất (phổ biến là EDTA) để bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của các enzyme nuclease nội bào .
- Bƣớc 2: Loại tạp.
Các hóa chất nhƣ: chloroform, isoamyl alcohol, phenol… đƣợc sử dụng để biến tính protein. Protein bị biến tính sau khi ly tâm tủa thành 1 lớp nằm giữa pha nƣớc và pha hóa chất. Pha nƣớc chứa acid nucleic đƣợc thu nhận lại.
22 - Bƣớc 3: Tủa acid nucleic.
Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận acid nucleic dƣới dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và có thể hòa tan chúng lại theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol nhƣng isopropanol phổ biến hơn. Acid nucleic sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại muối hoặc isopropanol còn dính lại trên mẫu .
Các bƣớc tiến hành:
1. Cho 50mg mẫu lá lúa đã nghiền vào ống eppendorf 2ml có chứa 500µl dung dịch đệm CTAB buffer 2X, vortex
2. Ủ ở 650C khoảng 15 phút
3. Lấy ra để nhiệt độ hạ xuống, bổ sung 500µl chloroform/ isoamylalcohol (24:1), vortex 15 giây
4. Ly tâm (10000rpm/10 min), 40C
5. Thu dịch pha trên (300µl) chuyển sang ống eppendorf 1,5ml mới có chứa 300µl isopropanol để tủa DNA để 10 phút trong đá lạnh.
6. Ly tâm (14000rpm/5min) , 40C
7. Rửa tủa bằng 500µl EtOH 700 , ly tâm 14000rpm/5min, để khô 8. Bổ sung 50µl TE buffer và bảo quản ở -200C
Sau khi tách chiết DNA tổng số, DNA tổng số đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE (Tris base, acid acetic, EDTA) ở 90V trong 30 phút. DNA tổng số đƣợc so sánh với maker 1kb và có thể quan sát đƣợc dƣới tia UV khi nhuộm Ethidium Bromide
2.2.3.Phƣơng pháp PCR
PCR đƣợc thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở một số giống lúa.
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành theo chu trình nhiệt và thành phần phản ứng đƣợc trình bày trong bảng 2.7 và 2.8
23
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose, dung dich đệm TAE, ở 90V trong 30 phút. Kích thƣớc tƣơng đối của sản phẩm đƣợc so sánh với maker 100bp và quan sát dƣới tia UV khi nhuộm ethidium bromide.
Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ cuối cùng Thể tích (50µl) ADN tổng số 570ng/nl 1,5 dNTPs 2mM 5 Buffer (+Mg2+ ) 10X 5 Mồi Fw 10µM 1,5 Mồi Rv 10µM 1,5 Taq 5U 0.3 H2O 35.2 Bảng 2.8.Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ
95 5’ 94 30s 35Cycles 55 30s 72 1’ 72 7’ 4 ∞
24
I.
2.2.4.Tinh sạch
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng Kit tinh sạch của hãng Thermo. Quy trình tinh sạch đƣợc thực hiện theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất.