Khi cây lúa trồng đƣợc 14 ngày trong môi trƣờng dung dịch Yoshida tiến hành bổ sung 11,7g muối/1l dung dịch thủy canh vào nhóm B nhƣ ở hình 7, sau khi bổ sung NaCl đƣợc 3, 7, 14 ngày tiến hành đánh giá mức độ chịu mặn của cây lúa dựa vào đặc điểm hình thái sinh lý của cây theo tiêu chuẩn đánh giá SES(Standar Evaluating Score) của IRRI, 1997.(Hình 8,9,10).
Hình 7. Lúa trồng trƣớc khi xử lý mặn
Hình 8. Lúa sau 3 ngày xử lý mặn
26
Kết quả ban đầu cho thấy, lúa đƣợc trồng trong môi trƣờng dinh dƣỡng có muối với nồng độ đạt 100mM sau 3 ngày xử lý mặn có các giống chƣa bị ảnh hƣởng nhiều. Giống tốt nhất là giống Pokkali , giống kém nhất là IR29 (Hình 11.).
Hình 11.Đồ thị đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 3 ngày
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị thang điểm theo tiêu chuẩn SES
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ kháng tốt nhất đến kháng kém nhất từ trái qua phải
Sau 7 ngày xử lý mặn có 30,76% giống bị ảnh hƣởng cấp độ 1-3 gồm các giống: Pokkali, Nếp nõn tre, Nếp ốc, Hom râu. Giống bị ảnh hƣởng cấp độ 4- 6 có 30,76% bao gồm : Ré nƣớc, Mặn D2, Ngoi, Chiêm cũ. Có 15,4% giống bị ảnh hƣởng cấp độ 8-9 gồm các giống: chuẩn nhiễm IR28, IR29(Hình 12).
Hình 12.Đồ thị đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 7 ngày
27
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị thang điểm theo tiêu chuẩn SES
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ kháng tốt nhất đến kháng kém nhất từ trái qua phải
Sau 14 ngày xử lý mặn kết quả thu đƣợc : 46,15% các giống: Chiêm cũ, Nếp vải, Dâu Ấn độ, Nipponbare, IR28, IR29 ảnh hƣởng cấp độ 9. Các giống ảnh hƣởng cấp độ 4-6 gồm: Nếp nõn tre, Nếp ốc, Hom râu, Ré nƣớc, Mặn D2, Ngoi. Giống bị chịu ảnh hƣởng ít nhất là Pokkali chiếm 0,76%(Hình 13).
Hình13 .Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 14 ngày
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị thang điểm theo tiêu chuẩn SES
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ kháng tốt nhất đến kháng kém nhất từ trái qua phải
Kết quả cho thấy sau 14 ngày sự khác biệt tính kháng mặn của các giống là tốt nhất. Do đó sự phân biệt tính kháng giữa các giống đƣợc chọn sau 14 ngày.
Sau khi đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái sinh lý của cây lúa, chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên một số đặc điểm sinh lý của cây lúa: Chiều dài thân, chiều dài rễ, khối lƣợng thân, khối lƣợng rễ.
28
3.2Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên một số đặc điểm sinh lý của cây lúa
3.2.1 Kết quả đánh giá về chiều dài thân sau khi xử lý mặn
Kết quả sau khi xử lý mặn 3 ngày cho thấy lúa đƣợc trồng trong môi trƣờng dinh dƣỡng có muối với nồng độ đạt 100mM, kết quả ghi nhận cho thấy có 71,42% giống lúa có chiều cao trong khoảng từ 6-8cm bao gồm 10 giống lúa sau: IR29, Nếp vải, Nipponbare, IR28,Mặn D2, Dấu Ấn độ, Chiêm cũ, Ré nƣớc, Ngoi. Có 4 giống (28,58%) có chiều cao từ 8,5- 9,5cm là các giống: Pokkali, Nếp nõn tre, Hom râu, Nếp ốc (Hình 14.).
Hình 14. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 3 ngày xử lý mặn
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm)
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
Kết quả sau 7 ngày xử lý mặn cho thấy các giống có chiều cao thân so với 3 ngày xử lý mặn không có nhiều vƣợt trội, cụ thể nhƣ sau: Các giống đối chứng có 57,14% các giống có chiều cao từ 7-8cm, có 21,4% giống có chiều cao trên 8cm gồm các giống: Ngoi, Nếp ốc. Giống có chiều cao vƣợt trội nhất là giống chuẩn kháng Pokkali (9,7cm) đạt 7,14%. Các giống có chiều cao ngang với giống chuẩn kháng đạt 14,28% gồm hai giống: Hom râu, Nếp nõn tre. Các giống lúa khi đã xử lý mặn những giống chống chịu kém có chiều cao không thay đổi so với 3 ngày khi xử lý mặn. Có 78,57% các giống có chiều cao từ 6-8cm, còn lại 21,4% các giống có chiều cao từ 8,5-9,5cm(Hình 15.).
29
Qua kết quả đánh giá sau 7 ngày xử lý mặn giữa các giống đối chứng và bên lúa đƣợc cho thêm muối, ta thấy có 28,6% chiều dài thân của các giống có sự chênh lệch cao 2-2,5cm gồm các giống: IR29, Nếp vải, IR28, Nipponbare. Có 42,85% giống có chiều dài thân lớn hơn từ 1-1,5cm gồm các giống: Ré nƣớc, Ngoi, Mặn D2. Có 3 giống (21,4%) các giống có sự chênh lệch chiều dài thân 0,5cm đó là: Pokkaki, Nếp nõn tre, Hom râu, Nếp ốc (hình 15.).
Hình 15. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 7 ngày xử lý mặn
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm)
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
Sa 14 ngày xử lý mặn, chiều dài thân của các giống đã có sự chênh lệch rõ rệt giữa các giống đối chứng và các khay giống xử lý mặn. Chiều dài thân bên nhóm đối chứng cao hơn nhóm xử lý mặn khoảng 3-4cm giữa các giống chiếm 58,15% gồm các giống: IR29, IR28, Nếp vải, Nipponbare, Dấu Ấn độ, Mặn D2, Chiêm cũ. Các giống có sự khác nhau về chiều dài thân từ 0,5-1cm chiếm 42,85% là: Ngoi, Nếp ốc, Pokkali, Nếp nõn tre, Hom râu (Hình 16.).
30
Hình 16. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 14 ngày xử lý mặn
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm)
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
3.2.2 Kết quả đánh giá chiều dài rễ sau khi xử lý mặn
Sau 3 ngày xử lý mặn, các giống lúa có chiều dài rễ từ 7-8,5cm chiếm 71,42%. Còn lại 28,58% là 3 giống có chiều dài rễ lớn hơn 8,5cm bao gồm các giống: Hom râu, Pokkali, Nếp nõn tre (Hình 17.). Sự chênh lệch chiều dài rễ sau 3 ngày xử lý mặn chƣa có sự thay đổi lớn.
Hình 17. Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 3 ngày xử lý mặn
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm)
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
Nhƣng sau 7 ngày bổ sung muối vào môi trƣờng dung dịch dinh dƣỡng chiều dài rễ bên xử lý mặn có sự thay đổi rõ rệt so với bên đối chứng. Ta thấy
31
rằng chiều dài rễ bên đối chứng phát triển bình thƣờng các giống có chiều dài tƣơng đồng nhau với chiều cao trong khoảng từ 9,5cm-10,5cm. Khi so sánh chiều dài rễ giữa các giống với nhau, thấy rằng gần 43% các giống có khoảng cách chiều dài rễ giữa bên đối chứng và bên xử lý mặn là: 2,5- 4cm bao gồm 6 giống lúa sau: IR28, Nếp vải, Nipponbare, IR29, Ngoi, Ré nƣớc. Có 4 giống đạt 28,5% có khoảng cách chiều dài rễ từ 1,5-2cm bao gồm: Mặn D2, Chiêm cũ, Dấu Ấn độ. Còn lại 28% các giống có khoảng cách chiều dài rễ thấp từ 1-1,5cm (Hình 18.).
Hình 18. Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 7 ngày xử lý mặn
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm)
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
Sau 14 ngày xử lý mặn, khoảng cách chiều dài rễ của giống đối chứng và giống xử lý mặn từ 4-5cm chiếm 43% gồm các giống: Ré nƣớc, Ngoi, IR29, Nipponbare, Nếp vải, IR28. Có 28,5% các giống có khoảng cách chiều dài rễ từ 2-3cm gồm có 4 giống: Mặn D2, Chiêm cũ, Dấu Ấn độ, Nếp ốc. Các giống còn lại: Nếp ốc, Pokkali, Nếp nõn tre, Hom râu có khoảng cách chiều dài rễ khoảng 1,5-2cm (Hình 19.).
32
Hình 19. Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 14 ngày xử lý mặn
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm)
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
3.2.3 Kết quả đánh giá khối lƣợng thân sau khi xử lý mặn
Kết quả phân tích ghi nhận trọng lƣợng thân của 14 giống lúa nghiên cứu trong môi trƣờng dung dịch có muối nồng độ đạt 100mM nhƣ sau: Các giống có sự chênh lệch khối lƣợng thân từ 0,012-0,016g chiếm 50% gồm 7 giống: Chiêm cũ, Ré nƣớc, IR29, Dấu Ấn độ, Nipponbare, Nếp vải, IR28. Có 3 giống chiếm 21,42% có khối lƣợng thân chênh lệch từ 0,004-0,006g so với giống đối chứng: A69-1, Ngoi, Mặn D2. Còn lại 28,58% các giống có sự chênh lệch nhau về khối lƣợng thân trong khoảng từ 0,002-0,04g là: Nếp nõn tre, Hom râu, Pokkali, Nếp ốc(Hình 20.).
Hình 20. Đồ thị biểu diễn khối lƣợng thân
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị khối lượng thân (g)
33
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
3.2.4 Kết quả đánh giá khối lƣợng rễ sau khi xử lý mặn
Đối với kết quả khối lƣợng rễ sau khi xử lý mặn ta nhận thấy 14 giống bên nhóm đối chứng trọng lƣợng rễ tƣơng đối đồng đều từ 0,03g-0,039g. Các giống lúa khi xử lý mặn có trọng lƣợng rễ cao chiếm 42,8% gồm các giống: Dấu Ấn độ, Nếp nõn tre, Pokkali, Hom râu, Nếp ốc. Trong đó, giống có trọng lƣợng rễ cao nhất là giống Nếp nõn tre. Các giống có trọng lƣợng rễ ở mức trung bình chiếm 14,28% gồm có 2 giống: Mặn D2, Chiêm cũ. Còn lại 42,85% các giống có khối lƣợng rễ thấp, trong đó giống chuẩn kháng IR28 là giống có khối lƣợng rễ thấp nhất(Hình 21.).
Hình 21. Đồ thị biểu diễn khối lƣợng rễ
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị khối lượng thân (g)
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
Sau khi tiến hành đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái sinh lý và đặc điểm sinh lý của cây lúa chúng tôi tiếp tục các bƣớc tiếp nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa
Lá lúa được thu và nghiền sử dụng máy nghiền mẫu. DNA tổng số đ ược tách chiết từ các mẫu lá đã nghiền sử dụng phương pháp tách chiết
34
CTAB và được điện di kiểm tra. Kết quả điện di cho thấy các băng DNA sáng, chứng tỏ chất lƣợng DNA của các mẫu là khá tốt, . Kết quả điện di và đo OD 260/280 cũng cho thấy DNA có nồng độ tƣơng đối cao, chất lƣợng tốt đủ tiêu chuẩn thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.(Hình 22.)
Hình 22. DNA tổng số tách từ lá lúa
1.Nếp nõn tre; 2.Chiêm cũ; 3.Nếp vải; 4.Ré nước; 5.Hom râu; 6.Nếp ốc; 7.Ngoi;8. Dâu Ấn độ; 9. Nếp đèo đàng M. Maker 1kb, Gel Agarose 1%.
3.4. Nhân bản gen OsHKT1
Gen OsHKT1đƣợc nhân bản bằng phƣơng pháp PCR sử dụng 4 cặp mồi đặc hiệu. Kết quả sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose. Kết quả sản phẩm phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 1 đƣợc trình bày ở hình 23.
35
Hình 23. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 1
1.Nếp nõn tre; 2.Chiêm cũ; 3.Nếp vải; 4.Ré nước; 5.Hom râu; 6.Nếp ốc; 7.Ngoi;8. Dâu Ấn độ; 9. Nếp đèo đàng M. Maker 1kb; Gel Agarose 1%
Kết quả điện di cho thấy các băng thu đƣợc sáng , khá gọn, đồng đều nhau, đúng kích thƣớc là 499bp và không xuất hiện băng phụ. Như vậy, đoạn
đầu của exon 1 gen OsHKT1đã được nhân bản thành công.
Đoạn tiếp theo của exon 1 được nhân bản sử dụng cặp mồi 2. Kết quả
điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình 24.
Hình 24. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 2
1.Nếp nõn tre; 2.Chiêm cũ; 3.Nếp vải; 4.Ré nước; 5.Hom râu; 6.Nếp ốc; 7.Ngoi;8. Dâu Ấn độ; 9. Nếp đèo đàng M. Maker 1kb; Gel Agarose 1%
M 2
36
Kết quả điện di cho thấy các băng thu đƣợc sáng , khá gọn, đồng đều nhau, đúng kích thƣớc là 828bp và không xuất hiện băng phụ. Như vậy, đoạn thứ hai của exon 1 gen OsHKT1 đã đƣợc nhân bản thành công.
Đoạn còn lại của exon 1 và exon 2 được nhân bản bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình 25
Hình 25. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 3
1.Nếp nõn tre; 2.Chiêm cũ; 3.Nếp vải; 4.Ré nước; 5.Hom râu; 6.Nếp ốc; 7.Ngoi;8. Dâu Ấn độ; 9. Nếp đèo đàng M. Maker 1kb;Gel Agarose 1%.
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose thu đƣợc các băng đúng kích thƣớc là 603bp, cũng không xuất hiện băng phụ, các mẫu có băng sáng rõ. Nhƣ vậy đã nhân bản thành công cả 2 đoạn exon 1 và exon 2 gen OsHKT 1.
Đoạn exon thứ 3 đƣợc nhân bản bằng phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình 26
60 3 bp
668 bp
37
Hình 26. Điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4
1.Nếp nõn tre; 2.Chiêm cũ; 3.Nếp vải; 4.Ré nước; 5.Hom râu, 6.Nếp ốc; 7.Ngoi;8. Dâu Ấn độ; 9. Nếp đèo đàng M. Maker 1kb; Gel Agarose 1%.
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose thu đƣợc các băng đúng kích thƣớc là 668bp, cũng không xuất hiện băng phụ, các mẫu có băng sáng rõ. Như vậy, gen OsHKT1đã được nhân bản thành công.
3.5.Giải trình tự gen OsHKT1 ở 8 giống lúa.
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch sử dụng Kit thôi gel Gene JET PCR Purification Kit #0701 của hãng Thermo scientific và đƣợc gửi đi giải trình tự. Một phần kết quả giải trình tự đối với giống Nếp nõn tre đƣợc trình bày ở hình sau:
Hình 27. Hình ảnh cho thấy một phần kết quả giải trình tự đối với mẫu Nếp nõn tre sử dụng cặp mồi 3
3.6. Phân tích trình tự gen ở 8 giống lúa.
Sau khi thu đƣợc kết quả giải trình tự ở 8 giống lúa, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự nucleotide của các exon và các intron sử dụng phần mềm trên trang:
http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/
Chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:Các trình tự nucleotide của exon 3 ở 8 giống có sự sai khác nhiều so với trình tự nucleotide của exon 1 và exon 2
Exon 1 có kích thƣớc là 1167 bp, có 12 vị trí có sự sai khác trong trình tự nucleotide. Ở vị trí 50, kết quả giải trình tự của giống Hom râu cho thấy giống Hom râu đã có sự thay thế nucleotide G bằng nucleotide T so với các giống lúa còn lại và so với dữ liệu ngân hàng gen lúa. Tƣơng tự, đối với vị trí 360 và 645 có sự thay thế nucleotide A bằng nucleotide G của giống
38
Nếp nõn tre, Chiêm cũ, Nếp ốc, Dâu Ấn Độ. Tuy nhiên, tới vị trí 708 giống Nếp vải, Ngoi, Ré nƣớc có sự sai khác thay thế G bằng nucletid A. Đến vị trí 744 của giống Nếp vải, Ngoi, Ré nƣớc có sự thay thế nucleotide A=G. Ở vị trí 1209 của giống Hom râu có sự thay thế nucleotide T=A.
Exon 2 có kích thƣớc là 219bp chỉ có 3 vị trí sai khác là vị trí 1390 có