Sau khi thu đƣợc kết quả giải trình tự ở 8 giống lúa, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự nucleotide của các exon và các intron sử dụng phần mềm trên trang:
http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/
Chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:Các trình tự nucleotide của exon 3 ở 8 giống có sự sai khác nhiều so với trình tự nucleotide của exon 1 và exon 2
Exon 1 có kích thƣớc là 1167 bp, có 12 vị trí có sự sai khác trong trình tự nucleotide. Ở vị trí 50, kết quả giải trình tự của giống Hom râu cho thấy giống Hom râu đã có sự thay thế nucleotide G bằng nucleotide T so với các giống lúa còn lại và so với dữ liệu ngân hàng gen lúa. Tƣơng tự, đối với vị trí 360 và 645 có sự thay thế nucleotide A bằng nucleotide G của giống
38
Nếp nõn tre, Chiêm cũ, Nếp ốc, Dâu Ấn Độ. Tuy nhiên, tới vị trí 708 giống Nếp vải, Ngoi, Ré nƣớc có sự sai khác thay thế G bằng nucletid A. Đến vị trí 744 của giống Nếp vải, Ngoi, Ré nƣớc có sự thay thế nucleotide A=G. Ở vị trí 1209 của giống Hom râu có sự thay thế nucleotide T=A.
Exon 2 có kích thƣớc là 219bp chỉ có 3 vị trí sai khác là vị trí 1390 có sự thay thế nucleotide T thành G của giống Nếp vải. Ở vị trí 1440 có hai vị trí sai khác, sự thay thế nucleotide G thành A của giốn Nếp vải, Nếp nõn tre, còn lại các giống lúa khác cũng nhƣ dữ liệu gen lúa không thay đổi. Điều này cho thấy trình tự vùng mã hóa exon 2 ở các giống có độ tƣơng đồng khá cao.
Exon thứ 3 có các vị trí sai khác: vị trí 1524 có sự thay thế của nucleotid C = G , vị trí 1527 và vị trí 1550 thì sự thay thế nucleotide T thay bằng A của giống Dâu Ấn độ các giống lúa khác cũng nhƣ dữ liệu gen lúa không thay đổi(Hình 28.).
39
40
Hình 29. So sánh trình tự vùng không mã hóa của gen giữa các giống lúa
Trình tự nucleotide của intron ở 8 giống đƣợc so sánh với trình tự dữ liệu gen lúa thấy có độ tƣơng đồng cao, sự sai khác giữa các nucleotide ít hơn sự sai khác giữa các nucleotide của exon: Có 9 vị trí sai khác đó là các vị trí 160, 220, 250, 276, 290, 330, 360, 370 có sự thay thế nucleotide C bằng T, hoặc A=C. Có 1 vị trí trong vùng trình tự là vị trí 338: trình tự là chƣa nhận đƣợc hoàn toàn giữa các giống (Hình 29.).
41
3.7. Phân tích trình tự acid amin suy diễn của protein mã hóa bởi gen OsHKT1 từ 8 giống lúa
Hình 30. So sánh trình tự acid amin suy diễn từ trình tự nucleotide thu đƣợc giữa các giống lúa
Từ sự sai khác nhiều ở exon thứ 3 của 8 giống lúa so với dữ liệu gen lúa thu đƣợc sự sai khác nhiều giữa các acid amin suy diễn trên đoạn exon 3. Đối với đoạn exon 1: do có sự thay thế nucleotide G thành nucleotide V ở vị trí 17 nên có sự thay thế acid amin trên trình tự prot ein từ Glysine(G) thành Valine( V) ở Hom râu. Ở vị trí thứ 463 acid amin đƣợc thay thế là: S thành Arginine (R) ở Nếp vải. Ở vị trí thứ 509 thì acid amin đƣợc thay thế là F thành L, Vị trí 516 thì thay thế L thành F. Các sự thay thế xảy ra không ảnh hƣởng tới trình tự acid amin của protein trong đoạn exon 1 và 2 này.
42
Bảng 3.1. Vị trí sai khác acid amin Vị trí nucleotid 50 360 645 708 744 1209 1389 1440 1524 1527 1547 Tên giống Vị trí acid amin G17V S463R F509L L516H - - - A G - - - - - - Ngoi - - - A G - G A - - - Nếp vải - G - - - - - - G A A Dấu Ấn độ - - - A G - - - - - - Ré nƣớc - G - - - - - A - - - Nếp nõn tre T - - - - A - - - - - Hom râu - G G - - - - - - - - Chiêm cũ - G - - - - - - - - - Nếp ốc
Vị trí acid amin nằm ở trong màng bao gồm: từ acid amin thứ 44-64, 70-93, 103-128, 187-214, 263-283, 306-324, 358-374, 405-421, 434-449, 490-495. Ngoài những vị trí nêu trên còn lại các acid amin đều nằm bên ngoài màng. Ba vị trí đa hình 20, 24, 35.
43
Tiếp theo dùng công cụ tin sinh để phỏng đoán cấu trúc protein và vị trí acid amin sai khác trên cấu trúc của protein, kết quả cho thấy trong số các acid amin bị thay đổi có một acid amin nằm ở vùng xuyên màng 1(S1), 1 nằm ở ngoài giữa (S9) và (S10), 1 nằm ngoài vùng (S10)(Bảng 3.1), (Hình 31.).
Các vị trí đa hình là 17, 463, 509, 516.
Các vị trí đa hình từ 518 đến 530. ( giữa 2 sao đỏ đều là đa hình)
Hình 31.Cấu trúc protein xuyên màng
44 93 70 103 128 214 187 263 285 324 306 358 374 421 405 434 449 495 490 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 N-Terminal C-Terminal Outside inside
44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1.Đánh giá đƣợc tính chịu mặn ở 13 giống lúa. Giống chịu mặn tốt gồm: Pokkali, Nếp nõn tre, Nếp ốc, Hom râu, Ré nƣớc, giống chịu mặn trung bình gồm: Mặn, Ngoi, Chiêm cũ, các giống chịu mặn kém: Nếp vải, Dâu Ấn độ, Nipponbare, IR28, IR29.
2.Đã tách chiết thành công DNA tổng số 9 giống lúa và nhân bản gen
OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở 8 giống lúa thành công. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.Đã xác định đƣợc trình tự gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở 8 giống lúa và phát hiện đƣợc sự sai khác giữa trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn giữa 8 giống lúa nghiên cứu: Hom râu, Chiêm cũ, Nếp nõn tre, Nếp ốc, Dâu Ấn độ, Ré nƣớc, Nếp vải, Ngoi với nhau. Đối với giống Hom râu trong trình tự có sự thay thế của acid amin Glysine (G) thành Valine (V), ở Nếp vải có sự thay thế của S thành R. Ở Dấu Ấn độ có sự thay thế của F thành L và L thành H ở hai vị trí acid amin khác nhau.
Kiến nghị
Từ các kết quả thu đƣợc trong nghiên cứu, chúng tôi có kiến nghị nhƣ sau:
-Phân tích mối liên hệ giữa sự sai khác nucleotide, acid amin với mức độ chịu mặn.
-Nghiên cứu mức độ biểu hiện gen ở điều kiện mặn.
-Đánh giá sự tƣơng quan của đa hình gen OsHKT1 với khả năng chịu mặn ở các giống lúa nghiên cứu
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1.Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003. “Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với thiệt hại do môi trường của cây lúa”. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
2.Đỗ Hữu Ất, Khuất Hữu Trung, Nguyễn Quang Xu, 2004 “Ứng dụng kỹ thuật kỹ thuật hạt nhân để tạo giống lúa chịu mặn cho vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ”.Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 2/ 2004: Tr. 1204-1205
3.Lê Văn Căn, 1978. Giáo trình Nông hóa. Nhà xuất bản Vụ đào tạo, Bộ đại học và trung học chuyên nghiệp.
4. Nguyễn Thị Quỳnh (1998), “ Đánh giá sự đa dạng di truyền tài nguyên lúa của vùng Tây Bắc Việt Nam”, Luận án Thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam.
5.Nguyễn Văn Bo, 2010. “Ảnh hưởng của Calcium lên sinh trưởng và dinh dưỡng của cây lúa trên đất nhiễm mặn”. Luận án thạc sĩ trồng trọt. Trƣờng Đại học Cần Thơ
6.Trần Danh Sửu (2008), “ Đánh giá đa dạng di truyền tài nguyên lúa Tám đặc sản miền Bắc Việt Nam”. Luận án Tiến sỹ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
7.Trần Danh Sửu, Lƣu Ngọc Trình (2001), “Sử dụng chỉ thị ADN để nghiên cứu quan hệ di truyền tiến hoá của lúa địa phƣơng các vùng Tây Bắc và Tây Nam nƣớc ta”, Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng,số1/2001. Tr. 25-29, Viện Di truyền nông nghiệp.
8.Trần Danh Sửu, Nguyễn Thị Lan Hoa và cộng sự (2010). “Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa nếp địa phƣơng ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ bằng chỉ thị SSR”. Kết quả nghiên cứu Khoa học và Công nghệ 2006 – 2010. Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
46
Tài liệu Tiếng Anh
9.Apse, M.P., Aharon, G.S., Snedden, W.A. & Blumwald, E. 1999. “Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+antiport in Arabidopsis”. Venice 285, 1256-1258.
10.Amtmann, A. & Sanders, D. 1999. “ Mechanisms of Na+ uptake by plant cells”. Advance botanical research 29, 75-112.
11.Babourina, O., Shabala, S. & Newman, I. 2000. “Verapamil-induced kinetics of ion flux in oat seedlings”. Australian journal of plant physiology 27, 1031–1040.
12.Berthomieu, P., Conejero, G., Nublat, A., Brackenbury, W.J., Lambert, C., Savio, C., Uozumi, N., Oiki, S., Yamada, K., Cellier, F., Gosti, F., Simonneau, T., Essah, P.A., Tester, M., Very, A.A., Sentenac, H., & Casse, F. 2003. “Functional analysis of AtHKT1 in Arabidopsis shows that Na+recirculation by the phloem is crucial for salt tolerance”. EMBO journal 22, 2004-2014.
13.Berthomieu, P. et al. (2003) “Functional analysis of OsHKT1 in Arabidopsisshows that Na+ recirculation by the phloem is crucialfor salt tolerance”. EMBO J.22, 2004–2014
14.Bhandal, I.S. & Malik, C.P. 1988. “Potassium estimation, uptake, and its role in the physiology and metabolism of flowering plants”.
International review of cytology110, 205-254.
15.Bittisnich, D., Robinson, D. & Whitecross, M. 1989. “Membrane- associated and intracellular free calcium levels in root cells under NaCl stress. In Plant membrane transport: The current position”.
Proceedings of the eighth international workshop on plant membrane transport, Venice, Italy, 25-30
16.June 1989 (eds J Dainty, MI de Michelis, E Marre and F Rasi-Caldogno). “Elesevier Science Publishing Company”, Inc., New York. 681-682 pp.Blatt, M.R. & Grabov, A. 1997. “ Signal redundancy gates and
47 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
integration in the control of ion channels for stomatal movement”.
Journal of experimental botany48, 529-537.
17.Blumwald, E. 2000. “ Sodium transport and salt tolerance in plants”.Current opinion in cell biology12, 431-434.
18.Bush, D.R. 1993. “ Proton-coupled sugar and amino-acid transporters in plants”. Annual review of plant physiology and plant molecular biology 44, 513–542.
19. Calliste Jérémie Diédhiou. 2006. “ Adaptive response mechanism salt stress in plants”. Plant physiology131, 676-683.
20.Chauhan, S., Forsthoefel, N., Ran, Y., Quigley, F.,Nelson, D.E. & Bohnert, H.J. 2000. “ Na+/myo-inositol symporters and Na+/H+-antiport in Mesembryanthemum crystallium”. The plant journal24, 511-522.
21.Colmer, T.D., Flowers, T.J. & Munns, R. 2006. “Use of wild relatives to improve salt tolerance in wheat”.Journal of experimental botany 57, 1059- 1078.
22.Cramer, G.R. & Jones, R.L. 1996. “ Osmotic stress and abscisic acid reduce cytosolic calcium activities in roots of Arabidopsis thaliana”.
Plant, cell and environment 19, 1291-1298.
23.Davenport, R.J. & Tester, M. 2000. “ A weakly voltage-dependent, nonselective cation channel mediates toxic sodium influx in wheat”. Plant physiology 122, 823-834.
24.Demidchik, V., Davenport, R.J. & Tester, M. 2002. “ Nonselective cation channels in plants”. Annual review of plant physiology and plant molecular biology 53, 67-107.
25.Demidchik, V. & Tester, M. 2002. “ Sodium fluxes through nonselective cation channels in the plasma membrane of protoplasts from Arabidopsis roots”. Plant physiology128, 379-387.
26.Epimashko, S., Meckel, T., Fischer-Schliebs, E., Lüttge, U. & Thiel, G. 2004. “Two functionally different vacuoles for static and dynamic purposes in one plant mesophyll leaf cell”. The plant journal 37, 294-300.
48
27.Felle, H.H. 2001. “ pH: signal and messenger in plant cells”. Plants biology 3, 577-591.
28.Flowers, T.J. & Läuchli, A. 1983. “ Sodium versus potassium: substitution and compartmentation”. In: Läuchli, A., Bieleski, R.L. eds. Inorganic plant nutrition, Vol. 15B. Berlin: Springer-Verlag. 651– 681 pp.
29.Flowers, T.J. & Yeo, A.R. 1995. “ Breeding for salinity resistance in crop plants: where next?” Australian journal of plant physiology 22, 875- 884.
30.Fukuda, A., Nakamura, A., Tagiri, A., Tanaka, H., Miyao, A., Hirochika, H. & Tanaka, Y. 2004. “ Function, intracellular localization and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na+/H+ antiporter from rice”. Plant and cell physiology45, 146-159.
31.Fukuda, A., Yazaki, Y., Ishikawa, T., Koike, S. & Tanaka, Y. 1998. “Na+/H+antiporter in tonoplast vesicles from rice roots”. Plant and cell physiology39, 196-201.
32.Gao, D., Knight, M.R., Trewavas, A.J., Sattelmacher, B. & Plieth, C. 2004. “Selfreporting Arabidopsis expressing pH and [Ca2+] indicators unveil ion dynamics in the cytoplasm and in the apoplast under abiotic stress”. Plant physiology134, 898-908.
33.Gárbarino, J. & Dupon, F.M. 1988. “NaCl Induces a Na+/H+Antiport in Tonoplast Vesicles from Barley Roots”. Plant physiology86, 231-236. 34.Garciadeblás, B., Senn, M.E., Banuelos, M.A. & Rodriguez-Navarro,
A. 2003. “ Sodium transport and HKT transporters: the rice model”. The plant journal 34, 788–801.
35.Gelli, A. & Blumwald, E. 1993. “ Calcium retrieval from vacuolar pools (characterisation of a vacuolar calcium channel)”. Plant physiology 102, 1139–1146.
49
36.Gelli, A., Higgins, V.J. & Blumwald, E. 1997. “ Activation of plant plasma membrane Ca2+ permeable channels by race-specific fungal elicitors”. Plant physiology 113, 269–279.
37.Gillaspy, G.E., Keddie, J.S., Oda, K. & Gruissem, W. 1995. “ Plant inositol monophospatase is a lithium-sensitive enzyme encoded by a multigene family”. The plant cell7, 2175–2185.
38.Gilroy, S. & Trewavas, A. 1994. “A decade of plant signals”. BioEssays 16, 677-682.
39.Glenn, E.P., Brown, J.J. & Khan, M.J. 1997. “ Mechanisms of salt tolerance in higher plants”. In: Mechanisms of Environmental Stress Resistance in Plants.
40.Edn. Basra, A.S. & Basra, R.K. Harwood academic publishers, the Netherlands. 83-110 pp. Golldack, D. & Dietz, K.J. 2001. “Salt- induced expression of the vacuolar H+-ATPase in the common ice plant is developmentally controlled and tissue specific”. Plant physiology 125, 1643–1654.
41.Golldack, D., Quigley, F., Michalowski, C.B., Kamasani, U.R. & Bohnert, H.J. 2003. “ Salinity stress-tolerant and -sensitive rice (Oryza sativa L.) regulate AKT1-type potassium channel transcripts differently”. Plant molecular biology 51, 71-81. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
42.Golldack, D., Su, H., Quigley, F., Kamasani, U.R., Munoz-Garay, C., Balderas, E., Popova, O.V., Bennett, J., Bohnert, H.J. & Pantoja, O. 2002. “Characterization of a HKT-type transporter in rice as a general alkali cation transporter”. The plant journal31, 529-542.
43.Greenway, H. & Munns, R. 1980. “Mechanisms of salt tolerance in non halophytes”.Annual review of plant physiology 31, 149–190.
44.Greenway, H. & Osmond, C.B. 1972. “ Salt responses of enzymes from species differing in salt tolerance”. Plant physiology 49, 256–259.
50
45.Gruwel, M.L.H., Rauw, V.L., Loewen, M. & Abrams, S.R. 2001. “Effects of sodium chloride on plant cells; a 31P and 23Na NMR system to study salt tolerance”. Plant science 160, 785-794.
46.Halfter, U., Ishitani, M. & Zhu, J.K. 2000. “The ArabidopsisSOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calcium- binding protein 36SOS3”. Proceedings of the national academy of sciences, USA 97, 3730–3734.
47.Halperin, S.J., Gilroy, S. & Lynch, J.P. 2003. “Sodium chloride reduces growth and cytosolic calcium, but does not affect cytosolic pH, in root hairs of Arabidopsis thaliana L”. Journal of experimental botany 54, 1269-1280.
48.Hamada, A., Shono, M., Xia, T., Ohta, M., Hayashi, Y., Tanaka, A. & Hayakawa, T. 2001. “Isolation and characterization of a Na+/H+ antiporter gene from the halophyte Atriplex gmelini”. Plant molecular biology 46, 35-42.
49.Hamilton, C.A., Taylor, G.J. & Good, A.G. 2002. “Vacuolar H+- ATPase, but not mitochondrial F1F0-ATPase, is required for NaCl tolerance in Saccharomyces cerevisiae”. FEMS microbiology letters 208, 227-232.
50.Hamilton, D.W.A., Hills, A., Kohler, B. & Blatt, M.R. 2000. “Ca2+channels at the plasma membrane of stomatal guard cells are activated by hyperpolarization and abscisic acid”. Proceedings of the national academy of sciences, USA 97, 4967–4972.
51.Hasegawa, P.M., Bressan, R.A., Zhu, J.K. & Bohnert,H.J. 2000. “Plant cellular and molecular responses to high salinity”.Annual review of plant physiology and plant molecular biology 51, 463-499.
52.Henriksson, E. & Henriksson, K.N. 2005. “ Salt-stress signalling and the role of calcium in the regulation of the ArabidopsisATHB7 gene”.
51
53.Hillel, D. 2000. “Salinity Management for Sustainable Irrigation”.The World Bank. Washington, D. C.
54.Horie, T., Yoshida, K., Nakayama, H., Yamada, K., Oiki, S. & Shinmyo, A. 2001. “ Two types of HKT transporters with different properties of Na+ and K+ transport in Oryza sativa”. The plant journal 27, 129-138. 54.Knight, H., Trewavas, A.J. & Knight, M.R. 1997. “Calcium
signalling in Arabidopsis thalianaresponding to drought and salinity”.
The plant journal 12, 1067–1078.
55..Mäser, P., Gierth, M. & Schroeder, J.I. 2002. “Molecular mechanisms of potassium and sodium uptake in plants”. Plant and soil 247, 43–54.
56.Plant physiology 134, 1514-1526. Pardo, J.M., Cubero, B., Leidi, E.O. & Quintero, F.J. 2006. “Alkali cation exchangers: roles in cellular homeostasis and stress tolerance”. Journal of experimental botany 57, 1181-1199.
57.Peterson, C.A. & Enstone, D.E. 1996. “Functions of passage cells in the endodermis and exodermis of roots”. Physiologia plantarum 97, 592-598. 58.Pilot, G., Gaymard, F., Mouline, K., Cherel, I. & Sentenac, H. 2003.
“Regulated expression of Arabidopsis shaker K+ channel genes involved in K+ uptake and distribution in the plant”. Plant molecular biology 51, 773–787.
59.Ren, Z.H., Gao, J.P., Li, L.G., Cai, X.L., Huang, W., Chao, D.Y.,