R X+ GSH → GS + H
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
II.1. Đối tượng nghiên cứu
- Ruồi đục lá (đối tượng sâu hại của nhiều câyrau và họ cây thập tự, trong đó có cây đậu trạch)
- Vị trí phân loại: Ngành:Động vật chân khớp (Athropoda) Lớp :Côn trùng (Insecta)
Bộ :Hai cánh (Diptera) Họ :Agomyzidae
Chi :Liriomyzae
Loài : Liriomyzae sativae Blanchard II.1.1.Đặc điểm hình thái:
Ruồi đục lá là loài biến thái hoàn toàn, vòng đời trải qua 4 giai đoạn là Trứng, sâu non, nhộng và giai đoạn ruồi trưởng thành.
•Trứng: Hình bầu dục, khi mới đẻ có mầu trắng sữa, sau đó chuyển thành mầu trắng đục. Trứng được nằm gọn trong vết châm của ruồi trên lá.Những vết châm không có trứng thì mép không gọn và hình dạng có thể tròn, hoặc có góc cạnh.Những vết châm có trứng thì luôn có hình bầu dục và mép gọn. Kích thước trung bình của trứng khoảng từ 0,02 đến 0,13mm.
•Ấu trùng: Có ba độ tuổi.Móc miệng hình chữ Y rất linh hoạt. Tuổi 1 màu trắng trong, tuổi 2 mầu vàng nhạt, tuổi 3 màu vàng rơm.Kích thước trung bình các độ tuổi lần lượt là: 0,7;1,3 và 2,3mm.
•Nhộng: Nhộng bọc hình bầu dục, có 10 đốt. Kích thước trung bình khoảng 2,8 đến 3,8mm.
Ảnh 1: Nhộng của ruồi đục lá
•Ruồi trưởng thành: Kích thước nhỏ, ruồi cái thường có thân hình và cành dài hơn ruồi đực. Đầu được bao phủ bởi một lớp lông màu đen bóng, có râu đầu.Mắt kép to màu nâu đỏ, ba mắt đơn nằm ở các khu trán-chân-môi. Miệng kiểu liếm hút có hàm dưới to, bàn chân có 5 đốt, bụng 6 đốt giữa các đốt có màu vàng. Bụng con đực thường nhỏ hơn con cái Con cái có máng đẻ trứng dài và nhọn; bộ phận sinh dục của con đực tù, ngắn và nhỏ.
Ảnh 2: Ruồi đục lá trưởng thành (Liriomyza sativae Blanchard)
II.1.2. Đặc điểm sinh thái
•Nhộng thường vũ hóa thành con trưởng thành vào buổi sáng, nhiều nhất là khoảng từ 6h đến 8h sáng. Sau khi đã vũ hóa khoảng 1h thì màu sắc cơ thể mới ổn định. Ruồi ăn thêm và thường sau 1 ngày mới bắt cặp giao phối. Thời điểm giao phối nhiều nhất là khoảng thời gian từ 6h đến 8h và 14h đến 18h trong ngày. Thời gian giao phối mỗi lần kéo dài khoảng 40 đến 120 phút..Một con cái có thể giao phối từ 1 đến 3 lần, số lần giao phối quyết định
đến lượng trứng đẻ của ruồi cái. Ruồi cái không giao phối vẫn có khả năng đẻ trứng nhưng số trứng đẻ rất ít chỉ bằng 2/3 lần so với ruồi cái được giao phối và trứng không có khả năng nở thành ấu trùng.
•Ruồi cái dùng máng đẻ châm lên mặt lá thành những lỗ nhỏ sau đó bò lùi lại cho miệng vào vết châm hút dịch đồng thời thăm dò vị trí đẻ trứng. Ruồi thường đẻ trứng trên những lá bánh tẻ (không già, không non). Một con ruồi cái có thể đẻ khoảng 250 trứng trong thời gian là 8-10 ngày.
•Vòng đời của ruồi đục lá ở nhiệt độ 25-300 C là khoảng từ 13 đến 19 ngày. Loài này gây hại cho cây trồng quanh năm. Chủ yếu gây hại cây trồng nặng nhất là vào các tháng 4,5 và từ tháng 7 đến tháng 11 trong năm.
•Triệu chứng và mức độ gây hại: Ấu trùng ruồi đục lá nằm dưới biểu bì lá ăn lớp nhu mô để lại hai lớp biểu bì, tạo thành các đường đục ngoằn nghèo. Giữa các đường đục có vệt phân do ấu trùng thải ra mầu xanh hoặc mầu nâu đen. Do đường đục lá bị khô héo làm cho diện tích lá bị thu hẹp dẫn đến làm giảm khả năng quang hợp và trao đổi chất của cây trồng hậu quả là cây còi cọc, phát triển chậm ảnh hưởng đến năng xuất.
II.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu II.2.1 Địa điểm
Chúng tôi tiến hành đề tài này tại:
+ Trong phòng thí nghiệm: Phòng khảo nghiệm thuốc trừ sâu - Trung tâm kiểm định thuốc bảo vệ thực vật phía Bắc-Cục bảo vệ thực vật.
+ Ngoài đồng ruộng: Chúng tôi thu thập mẫu và tiến hành các thí nghiêm ngoài đồng ruộng tại ba địa điểm có đặc điểm là vùng chuyên canh trồng các loại rau màu đó là:
- Song phương Hoài Đức Hà Nội: Đây là một địa điểm có diện tích trồng rau quanh năm với nhiều loại rau màu mà trong đó có nhiều loại cây là kí chủ của loài ruồi đục lá, trong đó có cây đậu trạch. Về mặt địa lý đây là
một vùng chuyên canh nằm phía tây và cách trung tâm thành phố Hà Nội khoảng 12km.
- Đình Tổ -Thuận thành - Bắc Ninh: Đây là một xã có diện tích đất trồng mầu chủ yếu trong đó có nhiều loại cây chủ yếu là kí chủ của loại ruồi đục lá này như các họ bầu bí, họ đậu, dưa chuột.... Nằm cách Hà Nội khoảng 30km.
- An Bình Thuận thành - Bắc Ninh: Đây là một xã có diên tích đất chủ yếu trồng mầu cây trồng chủ yếu như dưa chuột, các cây bầu bí và đậu trạch. Nằm cách Hà Nội khoảng 50km.
Những địa điểm mà chúng tôi lựa chọn đều cách xa nhau nhằm hạn chế tối đa sự di nhập của các cá thể trưởng thành giữa các quần thể. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
II.2.2.Thời gian nghiên cứu:
Chúng tôi bắt đầu tiến hành nghiên cứu từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 10 năm 2009
II.3. Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm
II.3.1. Dụng cụ
Dụng cụ để phục vụ trong quá trình nghiên cứu đề tài này gồm có: Nhà lưới, lồng lưới kích thước 120×60×60cm và lồng 60×60×60cm. Các thiết bị trong phòng thí nghiệm như bô can thủy tinh,đĩa petri,ống nghiệm, kính lúp, ống đong, dụng cụ đo nhiệt độ tủ lạnh...
II.3.2.Vật liệu
- Gồm 5 loại thuốc được dùng trong nghiên cứu là:
+ Sherpa 25EC: Thuộc nhóm Pyrethroid, chứa hoạt chất Cypermethrin với hàm lượng 25g hoạt chất/100ml. Nó tác động vào kênh Na+ trên sợi trục tế bào thần kinh làm cho các kênh này kéo dài thời gian mở dẫn đến hưng phấn kéo dài làm cho côn trùng chết. Thuốc có tác dụng tiếp xúc và vị độc. + Trigard 75 WP: Thuộc nhóm thuốc ức chế điều hòa sinh trưởng côn trùng (IRG); chứa 75g hoạt chất Cycromazine/100g sản phẩm.Thuốc có tác dụng tiếp xúc,ngăn cản quá trình tổng hợp kitin, ngăn cản quá trình lột
xác làm côn trùng chết.
+ Success 120SC: Nguồn gốc sinh học có chứa 120g hoạt chất Spinosad trong một lít thương phẩm, thuốc có tác dụng tiếp xúc và vị độc, tác động vị độc cao hơn tiếp xúc khoảng 5 lần. Chúng ảnh hưởng đến sự hoạt hóa thụ quan Nicotinic acetylcholine (nAch) và chức năng của GABA.
+ Alfatin 1.8.EC: Có nguồn gốc sinh học chứa 1,8g hoạt chất Abamectin trong một lít thương phẩm, thuốc có tác dụng gây độc đường ruột và tiếp xúc, có khả năng thẩm thấu sâu, nhanh vào mô lá nên có tác dụng kéo dài đối với nhiều loại côn trùng trích hút và gây hại ở phần thịt lá. Abamectin gây rối loạn hoạt động sinh lý hệ thần kinh của côn trùng.Tác động chủ yếu là kích thích làm tăng quá trình tạo GAGB, ngăn chặn xung điện thần kinh trong hệ thần kinh vận động của côn trùng. Khi côn trùng tiếp xúc hoặc ăn phải chất độc sẽ bị tê liệt, ngừng ăn rồi chết.
+ Forfox 400EC: chứa 400g hoạt chất Chlopyrifos trong một lít thương phẩm
- Đây là những loại TTS thông dụng được các bà con trồng rau đã và đang dùng hiện nay.
- Ngoài ra cần có dung dịch mật ong để làm thức ăn bổ sung cho ruồi II.4. Phương pháp nghiên cứu
II.4.1 Điều tra tình hình sử dụng thuốc trừ sâu.
Phương pháp tiến hành: Tại những địa điểm nghiên cứu chúng tôi tiến hành điều tra tình hình sử dụng TTS của các hộ nông dân bằng cách phỏng vấn trực tiếp trên đồng ruộng, hay sử dụng phiếu điều tra có các hệ thống câu hỏi cụ thể và rõ ràng.
Nội dung của phiếu điều tra là: + Tình hình canh tác
+ Tình hình sử dụng TTS: như loại thuốc dùng, phương pháp sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, số lần phun/vụ, khoảng cách giữa các lần phun/vụ....
Mỗi địa điểm nghiên cứu chúng tôi tiến hành điều tra khoảng từ 25 đến 30 hộ gia đình.
II.4.2. Nuôi ruồi và xác định độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá
II.4.2.1 Nuôi ruồi
Thu thập mẫu tại các địa điểm nghiên cứu:
+ Thu các lá cây có vết đục của ruồi (lưu ý là thu những lá ở cuối vết đục phải có mầu vàng ươm của nhộng, là những lá có chứa những ấu trùng còn sống) về phòng thí nghiệm.
+ Tại phòng thí nghiệm ủ lá cho tới khi ấu trùng hóa nhộng chui ra ngoài hoàn toàn rồi thu nhộng vào đĩa petri có bông tẩm ướt nhằm giữ độ ẩm thích hợp.
+ Sau khoảng thời gian từ 4-5 ngày chú ý quan sát mầu của nhộng từ màu vàng tươi chuyển sang màu vàng đen là nó chuẩn bị vũ hóa thì cho vào lồng có kích thước 120×60×60cm với số lượng khoảng từ 200 đến 300 cặp ruồi trưởng thành/lồng. Ruồi trưởng thành được nuôi trong lồng ở nhiệt độ khoảng từ 25 đến 300 C và cho ăn thêm thức ăn bổ sung là dung dịch mật ong 10% sau khi các cá thể trưởng thành bắt cặp với nhau thì cứ hằng ngày chúng ta đưa khoảng từ 30 đến 40 cây đậu trạch ở giai đoạn 1 -2 lá thật vào lồng trong khoảng thời gian là 6h đến 8h (khoảng 8h cho cây vào thì 14h đến 16h cho cây ra) để ruồi cái trưởng thành đẻ sau khi đã giao phối với con đực.
+ Các cây đậu sau khi lấy ra, được giữ cách ly hoàn toàn với ruồi trưởng thành và được chăm sóc cho tới khi trứng nở thành ấu trùng ở tuổi 1 (khoảng từ 3 đến 3,5 ngày) sử dụng ấu trùng này để thử với các loại TTS nghiên cứu nhằm xác định độ mẫn cảm của các QT ruồi đục lá tự nhiên.
II.4.2.2 Xác định độ mẫn cảm của ấu trùng ruồi đục lá ở các quần thể tự nhiên.
Chúng tôi dùng phương pháp nhúng lá của Tabashnik và Cushing (1997) [32] để tiến hành xác định độ mẫn cảm với một số loại TTS của ấu
trùng ruồi đục lá ở tuổi 1. Cách tiến hành:.
+ Trước tiên phải làm thí nghiệm thăm dò để tìm ra thang nồng độ của mỗi loại TTS nghiên cứu gồm 5, 6 nồng độ sao cho nồng độ cao nhất gây chết khoảng 90 đến 95% nồng độ thấp nhất gây chết khoảng 5 đến 10% số cá thể ấu trùng thí nghiệm. Sau khi đã chọn được thang nồng độ thích hợp chúng tôi bắt đầu tiến hành thí nghiệm chính thức. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Quá trình tiến hành thí nghiệm:
Thang 5 hoặc 6 nồng độ của mỗi loại TTS thí nghiệm đã được chọn để làm thí nghiệm với ấu trùng tuổi 1, mỗi nồng độ nhắc lại ba lần, số ấu trùng sử dụng cho mỗi lần nhắc lại là từ 15 đến 30 cá thể.
Khi chọn cây làm thí nghiệm các cây phải có mật độ ấu trùng vừa phải không quá nhiều để tránh tình trạng có hiện tượng cạnh tranh thức ăn giữa các ấu trùng trong quá trình thí nghiệm (mỗi lá cây đậu không quá 15 ấu trùng).Đếm và đánh dấu số ấu trùng trên mỗi lá đã được chọn làm thí nghiệm sau đó nhúng toàn bộ phần lá cây thí nghiệm vào dung dịch thuốc với nồng độ tương ứng trong khoảng 20 giây, Khi làm thí nghiệm xong chăm sóc cây bình thường khoảng từ 2-3 ngày quan sát ở lô đối chứng và các lô ở nồng độ khác nhau ấu trùng đã vào nhộng, cắt tất cả các lá đã thí nghiệm để vào đĩa petri tương ứng với từng nồng độ và mỗi lần nhắc lại (lưu ý để tránh cho lá thí nghiệm không bị khô cần dùng bông tẩm ướt quấn vào cuống lá hoặc cho vào đĩa petri bông ẩm). Khoảng 2-3 ngày sau khi ấu trùng đã hóa nhộng hoàn toàn chui ra khỏi mặt lá ta bắt đầu tiến hành xác định được số nhộng hình thành từ đó ta có thể xác định được số cá thể chết sau xử lý với thuốc.Cần ghi chép cụ thể cho từng lần nhắc lại, từng nồng độ thí nghiệm.
+ Cách pha nồng độ thuốc khác nhau cho mỗi loại thuốc:
Mỗi loại thuốc ta sử dụng 5 đến 6 nồng độ. Dung dịch thuốc có nồng độ cao nhất (làm cho số lượng ấu trùng chết nhiều nhất 90-95% ấu trùng
chết) làm dung dịch mẹ (liều 1) muốn chuyển sang nồng độ thấp hơn (liều 2) sử dụng công thức C1V1=C2V2
trong đó C1,V1 là nồng độ thuốc và thể tích nước dùng để pha chế liều 1 C2,V2 là nồng độ thuốc và thể tích nước cần pha chế liều 2. II.4.2.3. Xử lí số liệu
Các số liệu thu được chạy trên chương trình Ploplus trên máy tính để xác định được LC50 và LC95
Tỉ lệ chết của ấu trùng ruồi đục lá thử nghiệm với TTS có tương quan dương với đường thẳng theo phương trình y=bx+a. Các liều lượng của thuốc được tính theo Logarit và tỉ lệ chết tương ứng với từng liều thử được chuyển thành Ploplus, hay probit y=bx+ a; trong đó x là logarit cơ số e của nồng độ. Mức độ tin cạy của giá trị LC50được kiểm định bằng phương pháp χ2
II.4.3. Quá trình tạo dòng kháng.
Để nghiên cứu tính di truyền của tính kháng thì quá trình tạo dòng kháng là một bước rất quan trọng. Chúng tôi tiến hành tạo dòng kháng theo phương pháp chọn lọc quần thể dưới áp lực chọn lọc của TTS Sherpar 25EC có hoạt chất Cypermethrin. Trước hết chúng tôi dựa vào ½ liều khuyến cáo để xác định liều nhằm loại bỏ cá thể mẫn. Những cá thể sống sót được giữ lại nuôi tạo thế hệ tiếp theo. Ở những thế hệ sau xử lý thuốc với liều lượng tăng dần nhằm loại bỏ hết những cá thể mẫn và nâng cao dần tính kháng thuốc của dòng chọn lọc. Với quỹ thời gian có hạn chúng tôi chỉ tạo được dòng kháng Cypermethrin qua 12 thế hệ. Quá trình tạo dòng kháng chúng tôi chia làm 2 giai đoạn:
+ Giai đoạn trưởng thành với cả 12 thế hệ chúng tôi cho ăn dung dịch mật ong có pha trộn thuốc Sherpa 25EC có nồng độ 0.05ml thuốc/100ml nước.
Mỗi ngày, sau khi ruồi trưởng thành ăn dung dịch mật ong lẫn thuốc, số ruồi sống sót được chúng tôi cho cây vào khoảng 4h đến 6h (sáng khoảng
8h cho cây vào đến 14h chiều lấy cây ra). Số cá thể trưởng thành ở thế hệ sau chính là số ấu trùng sống sót qua mỗi lần thử ở thế hệ trước.
+ Giai đoạn ấu trùng: Khi ấu trùng ở tuổi 1 (lấy cây ra khoảng 3 ngày sau trên bề mặt lá có vết đục khoảng 1cm) thì chúng tôi tiến hành xử lí thuốc với những thang nồng độ thích hợp ở mỗi thế hệ
Bảng 2.1: Quá trình tạo dòng kháng ở giai đoạn ấu trùng
Thế hệ Nồng độ xử lí % (tương đương số ml thuốc Sherpar 25EC/100mlH20)
F1 0.05 F2 0.10 F3 0.20 F4 0.30 F5 1.00 F6 2.00 F7 3.00 F8 4.00 F9 5.00 F10 6.00 F11 7.00 F12 8.00 Ở F12. Một nửa số cá thể trưởng thành sống sót ở thế hệ F11dùng để tiến hành thí nghiệm với thang 6 nồng độ, nồng độ cao nhất là 8ml cypermethrin/100mlH2O. Một nửa còn lại nuôi duy trì và cho thử với 4 loại thuốc còn lại mục đích là xác định xem có hiện tượng kháng chéo xảy ra đối với các thuốc đó ở dòng kháng thuốc Cypermethrin.
Chương III