Kết quả phản ứng PCR - Nghiên cứu quy trình chuyển- 123docz.net

Các cây không nhiễm bệnh đƣợc thu mẫu để khẳng định sự có mặt của cấu trúc chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR.

Kết quả phân tích cho thấy, có 18 cây/ 20 cây cho kết quả dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV/Fi- TMV-Ri (hình 3.4). Đối chứng dƣơng là plasmid TMV-RNAi làm khuôn mẫu. Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng khuôn mẫu là ADN tổng số tách chiết từ lá thuốc lá không chuyển gen (2 mẫu) đều cho kết quả âm tính. Điều này đảm bảo đoạn gen chuyển không có sẵn trong cây không chuyển gen. Nhƣ vậy, kết quả dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi/TMV-Ri của 20 cây thuốc lá đã chuyển gen chứng tỏ đây là những cây thuốc lá có mang cấu trúc gen cần chuyển.

Hình 3.4. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong 20 mẫu thuốc lá C9-1.

M: Thang ADN chuẩn 1 kb, (-) Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng khuôn là ADN tách từ cây thuốc lá không chuyển gen; 1- 20: 20 cây thuốc lá chuyển gen; (+) Đối chứng dƣơng là plasmid TMV-RNAi

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1. Đã tái sinh thành công cây thuốc lá C9-1 từ và áp dụng đƣợc quy trình quy trình chuyển gen cho cây thuốc lá C9-1sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumerfacien, cây thuốc lá chuyển gen biểu hiện hoạt tính GUS. Quy trình này có thể ứng dụng trong việc chuyển các gen đích mong muốn.

2. Biến nạp thành công cấu trúc RNAi mang đoạn gen mã hóa vỏ virus TMV vào cây thuốc lá và thu đƣợc 58 cây thuốc lá chuyển gen

3. Lây nhiễm thành công vào cây thuốc lá C9-1 đã chuyển gen nhằm thử tính kháng virus TMV, kết quả thu đƣợc có 20/ 58 cây kháng tốt.

4. Kết quả kiểm tra 20 cây thuốc lá chuyển gen cho thấy, có 18 mẫu cho kết quả dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV- Fi/TMV-Ri, chứng tỏ đây là những cây thuốc lá có mang cấu trúc chuyển gen.

Kiến nghị

1. Cần tiếp tục tiến hành đánh giá tính kháng của các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo vơi virus TMV. Sau khi lây nhiễm nhân tạo, kiểm tra sự có mặt của virus TMV bằng các phản ứng PCR.

2. Tiếp tục theo dõi và đánh giá tính kháng của các mẫu thuốc lá chuyển gen ở thế hệ tiếp theo nhằm tạo đƣợc dòng thuốc lá có khả năng kháng TMV ổn định qua nhiều thế hệ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

[1]: TS. Lê Trần Bình. Công nghệ sinh học thực vật rong cải tiến cây trồng, Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam, 1997, NXB Nông Nghiệp. [2]: Chu Hoàng Hà (2010): Nghiên cứu tạo cây trồng kháng bệnh do virus gây ra bằng công nghệ ức chế RNA (RNAi)

[3]: Trần Văn Hai, Giáo trình Hóa bảo vệ thực vật- Khoa Nông Nghiệp, Đại học Cần Thơ.

[4]: Vũ Triệu Mân (2007), Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội, giáo trinh Bệnh cây chuyên khoa, chuyên ngành Bảo vệ thực vật.

[5]:Đỗ Tiến Phát (2009), Xây dựng quy trình tái sinh và thử nghiện khả năng chuyển gen gus vào cây thông nhựa ( Pinus merkussi Jungh & De Vries),

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội

[6]: Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

[7]: Phạm Thị Vân , Nguyễn M inh Hùng , Hà Viết Cƣờng , Lê Văn Sơn , Lê Trần Bình và Chu Hoàng Hà (2009) Tạo cây thuốc lá kháng virus TMV bằng kỹ thuật RNAi . Hội thảo Quốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam , 25-26/7 tại Viện Nghiên cƣ́u Bông và phát triển NN Nha Hố - Ninh Thuận. Tr. 32-40. [8]: Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình(2008). Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dƣa chuột bằng kỹ thuật RNAi. Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4A): 679-687

[9]: Phạm Thị Vân (2009), Nghiên cứu tạo cây thuốc lá kháng bệnh khảm virus bằng kỹ thuật RNAi, Luận văn thạc sĩ khoa học, Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

[10]: Nguyễn Văn Chín, Nguyễn Ngọc Bích (2008) Theo dõi tình hình sâu bệnh hại thuốc lá làm cơ sở dự báo và nghiên cứu biện pháp phòng trừ phục vụ sản xuất thuốc lá nguyên liệu” Báo cáo khoa học. Công ty TNHH

Một thành viên Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Tổng công ty thuốc lá Việt Nam: http://ww.vinataba.com.vn

Tài liệu tiếng Anh

[11]: Akehurt B.C 1981: Tobacco.longman group Ltd, New York. 764pp. [12]: Banerjee A.K, Part S, Hannapel D.J (2006), “ Eficient production of transgenic potato ( S.tuberosum L.ssp.andigena) plants via Agrobacterium tumerfaciens- mediated transformation.” Plant Science, 170, pp.732-738. [13]: 32Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants. Nature 431(7006) : 356-63

[14]: RN (1999) Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus: discovery mechanisms and exploitation. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 354: 659-664

[15]: Bonfim K, Faria JC, Nogueira EO, Mendes EA, Aragão FJ (2007)

RNAi-mediated resistance to Bean golden mosaic virus in genetically engineered common bean (Phaseolus vulgaris). Mol Plant Microbe Interact. 20(6) : 717-26

[16]: Chicas and Macino, 2001. Charateristics of post- transcriptionnal gene silencing EMBO 2 (11): 992-6

[17]: Colliins W.K; Hawks S.N.Jr: Principles of the flue cured Tobacco production. N.C. Stale Univercity 2nd E.d.1993.300

[18]di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res. 14(6): 989- 94

[19]Gottula J, Fuchs M (2009) Toward a quarter century of pathogen- derived resistance and practical approaches to plant virus disease control.

[20]: Hersbers, K, Meuwly P, Frommer WB, Metraux JP, Sonnewald U (1996a), Systemic Acquired. Resistance. Mediated by the Ectopic Expression of Invertase. Posible Hexose sensing in the secretory Pathway. Plant Cell 8: 793- 803

[21]: Hull R, Davies JW (1992) Approaches to nonconventional control of plant virus diseases. Crit Rev Plant Sci 11: 17-33

[22]: Ilardi V., Mazzei M., Loreti S., Tomassoli L., barba M., 1995. Biomoleccular and serological methods to identify strains of cucumber mosaic cucumovirus on tomato. EPPO Bulletin 25: 321- 327

[23]: Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) β-Glucuronidase from

Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447– 8451

[24: Jefferson R.A (1987), “ Asaying chimeric gens in plants: The gus gen fussiuon system”, Plant Molecculer Biology Reporter, (5), pp. 387- 405.

[25: Juliana D, Annika P, Jurith M and Iris S ( 2006), “ The use of the phosphomanose isomerase/ mannose seclection system to recover transgenic apple plants” Plant Cell Rep (25), pp. 1149- 1156.

[26] Kamachi S, Mochizuki A, Nishiguchi M, Tabei Y (2007) Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing. Plant Cell Rep. 26(8): 1283-8

[27: Owen A.M., Downes, J.D., Sahakian, B.J., Polkey, C.E. and Robbins T.W. (1990). Planning and spatial working memory following frontal lobe lesions in Man. Neuropsychologia, 28 (10), 10211034

[28: Owen & Palukaitis, Virology 166: 495, 1988

[29: Palukaitis, P., Roossinck, M. J., Dietzgen, R. G., and Francki, R. i. B. 1992. Cucumber mosaic virus. Adv. Virus Res. 41: 281-348

[30: Palukaitis, P., and Zaitlin, M. 1997. Replicase – mediated resistance to plant virus disease. Adv. Virus Res. 48: 349-377

[31: Roossinck MJ (2002): Evolutionnary history of cucumber mosaic virus as deduced by phylogentic analyses. J. Virol. 76: 3382- 3387

[32]Scholthof K-BG, Scholthof HB, Jackson AO (1993) Control of Plant virus diseases by Pathogen-derived resistance in transgenic plants. Plant Physiol 102: 7-12

[33]Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature 407: 319-20

[34] Stryer Lubert (1988) Third Edition. W. H. Freeman and Company Biochemstry. ISBN 0-7167- 1843

[35]Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010)

Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection. Appl Biochem Biotechnol. Epub ahead of print

[36]: Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature 407: 319-20

[37]: Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010)

[38]: Tenllado F, Llave C, Díaz-Ruíz J (2004) RNA interference as a new biotechnological tool for the control of virus diseases in plants.Virus Res. 102(1): 85-96

[40]Tyagi H, Rajasubramaniam S, Rajam MV, Dasgupta I (2008) RNA- interference in rice against Rice tungro bacilliform virus results in its decreased accumulation in inoculated rice plants. Transgenic Res. 17(5): 897-904

[41]Vanderschuren H, Alder A, Zhang P, Gruissem W (2009) Dose- dependent RNAi-mediated geminivirus resistance in the tropical root crop cassava. Plant Mol Biol. 70(3):265-72

[42]: Wahyuni, W.S., Dietzegen, R. G., Hanada, K., and Francki, R.I.B. 1992. Seorological and biological variatinon bwtwwen and within subgroup I and II strains of cucumber mosaic virus. Plant Pathol. 41: 282- 297

[43]:Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64.

[44] 42Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J. 27(6): 581-90

[45]: Wesley SV et al (2001) Constructs for efficient, effective and high throughput gene silencing in plants. Plant J 27: 581–590

[46]: Zrachya A, Kumar PP, Ramakrishnan U, Levy Y, Loyter A, Arazi T, Lapidot M, Gafni Y (2007) Production of siRNA targeted against TYLCV coat protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to the virus. Transgenic Res. 16(3): 385-98

Trang web:

[47]: http://www.vinataba.com.vn/?module=viewnews&id=316 [48]: http://www.vinataba.com.vn/?module=viewnews&id=316

[49]: http://dantri.com.vn/kinhdoanh/An-Giang-Thoat-ngheo-nho-cay-thuoc- la/2008/4/226146.vip

[50]: Quyết định 88/2007/QĐ-TTg, http://www.vinataba.com.vn/toanvan.htm

[51]:http://www.hanghoaviet.com/vietnamproducts/vi/news/Trong-cay- gi/DV2962-giong-ca-chua-chiu-nhiet-va-khang-benh-xoan-la-virus-4637/ [52]: http://www.apsnet.org/online/comcom/names/tobacco.asp

Phụ lục

Phụ lục 1. Thành phần các môi trƣờng MS

THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƢỜNG MS (Murashige và Skoog, 1962)

SKOOG I SKOOG II SKOOG III

NH4NO3: 1650mg/l FeSO4.7H2O: 27,8mg/l KI: O,83 mg/l KON3: 1900 mg/l MnSO4.4H2O: 22,3mg/l Na2MoO4.2H2O:

0,25mg/l KH2PO4: 170mg/l H3BO4: 6,2mg/l CuSO4.5H2O:

0,0025mg/l

MgSO4.7H2O: 370mg/l ZNSO4.7H2O: 8,6mg/l CoCl2.6H2O : 0,025 mg/L CaCl2.2H2 : 440 mg/L Na2EDTA : 37,3 mg/L Và các nguyên tố đa lƣợng N P K Ca Mg S, vi l ƣ ợng Fe Zn B Co N Mn Cu Al Mo I

Phụ lục 2: Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy

Môi trƣờng Thành phần

Nuôi cấy cơ bản MS(I-V) +30g/l glucose, 8g/l agar, pH5,8.

Lây nhiễm ½ MS(I-V) , pH 5,8

Tạo mô sẹo MS (I-V) +1mg/l BAP+ 30g/l glucose+ 8g/l agar, pH5,8.

Tạo chồi MS (I-V) +250mg/l cefotaxime + 50mg/l

kanamycine + 30g/l glucose +8g/l agar, pH5,8.

Ra rễ MS (I-V) + 0,1mg/l NAA + 30g/l glucose+ 8g/l agar, pH5,8.

LB lỏng Bacto pepton 10g/l + NaCl 10g/l + Yeast extract 5g/l. pH 7

LB aga LB lỏng + 16 g/l aga

Dung dịch X-Gluc 50 mM Na2HPO4 và NaH2PO4; pH7;

10mM[K3(Fe(CN)6]; 10mM K4[(Fe(CN)6]; 10 mM Na2EDTA; 0,1% Triton-100; 1,5mM X-glucuronide

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ... 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ... 2

MỞ ĐẦU ... 3

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 4

1.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ ... 4

1.1.1.Phân loại... 4

1.1.2. Giá trị của cây thuốc lá ... 5

1.1.3 . Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam ... 6

1.2. MỘT SỐ BỆNH THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ ... 8

1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá ... 8

1.2.2. Bệnh khảm lá do virus ... 10

1.3. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC ... 14

1.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh: ... 14

1.3.2.Sử dụng giống sạch bệnh ... 15

1.3.3. Các biện pháp canh tác... 15

1.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học ... 15

1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus ... 18

1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi ... 18

1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT NAM. ... 19

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ... 21

2.1. VẬT LIỆU... 21

2.1.1.Vật liệu thực vật ... 21

2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen: ... 21

2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng... 22

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 22

2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm: ... 22

2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo ... 22

2.2.1.2. Gieo hạt... 22

2.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens ... 23

2.2.2.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen ... 23

2.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy ... 23

2.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen... 24

2.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh... 24

2.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phƣơng pháp nhuộm mô hóa tế bào ... 24

2.2.4. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng phƣơng pháp PCR ... 25

2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số ... 25

2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR... 25

2.2.5. Phân tích khả năng kháng virus của các cây chuyển gen bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo ... 26

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 28

3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS ... 28

3.1.1. Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen ... 29

3.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây ... 29

3.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi ... 29

3.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh ... 32

3.1.3. Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào... 35

3.2. CÁC KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi... 35

3.2.1. Tái sinh và chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi ... 35

3.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus ... 37

3.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo ... 37

3.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây ... 38

3.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số ... 38

3.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR ... 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ... 41