Nghiên cứu quy trình chuyển gen tăng chiều dài sợ gỗ echb1 vào bạch đàn urô eucalyptus urophylla thông qua agrovacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HỒNG VŨ MINH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ (ECHB1) VÀO BẠCH ĐÀN URÔ (EUCALYPTUS UROPHYLLA) THÔNG QUA AGROVACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ Thái Nguyên – 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HỒNG VŨ MINH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ (ECHB1) VÀO BẠCH ĐÀN URƠ (EUCALYPTUS UROPHYLLA) THƠNG QUA AGROVACTERIUM TUMEFACIENS Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS CHU HỒNG HÀ Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ Thái Nguyên – 2013 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG b (Eucalyptus urophylla) 1.1.3 Giá trị kinh tế 1.1.4 Tình hình trồng bạch đàn Việt Nam 1.2 EcHB1 chu trình tổng hợp lignin thực vật 1.2.1 Chu trình sinh tổng hợp lignin thực vật 1.2.2 EcHB1 – nhân tố phiên mã làm tăng chiều dài sợi gỗ 14 1.3 Ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật 15 1.3.1 Khái niệm chuyển gen 15 1.3.2 Các phương pháp chuyển gen cho trồng 16 1.3.3 Những thành tựu nghiên cứu tạo chuyển gen 21 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.1.1 Vật liệu 27 2.1.2 Hóa chất, thiết bị sử dụng 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Tạo mẫu bạch đàn in vitro 28 2.2.2 Ảnh hưởng môi trường chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh trực tiếp từ mô sẹo 29 2.2.3 Tạo vật liệu trước chuyển gen 32 2.2.4 Tạo dịch huyền phù 32 2.2.5 Nhiễm khuẩn đồng nuôi cấy 33 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 2.2.6 Diệt khuẩn tái sinh chồi chuyển gen 33 2.2.7 Phương pháp tách chiết DNA thực vật 33 2.2.8 Phương pháp điện di DNA 35 2.2.9 Kiểm tra có mặt cuả gen EcHB1 kỹ thuật PCR 36 2.3 Các công thức sử dụng xử lý số liệu 36 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Tạo mẫu bạch đàn urô in vitro 38 3.2 Ảnh hưởng mơi trường chất điều hịa sinh trưởng đến khả tái sinh chồi trực tiếp tái sinh chồi từ mô sẹo 40 3.2.1 Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng nhóm cytokinin đến khả tái sinh chồi trực tiếp tái sinh chồi từ mô sẹo 40 3.2.2 Ảnh hưởng BAP kết hợp với chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin đến khả tái sinh chồi trực tiếp tái sinh chồi từ mô sẹo 44 3.2.3 Ảnh hưởng NAA IBA tới khả rễ chồi 48 3.2.4 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh 50 3.3 Kết chuyển gen EcHB1 vào bạch đàn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 51 3.3.1 Tạo dịch huyền phù 51 3.3.2 Nhiễm khuẩn đồng nuôi cấy 51 3.3.3 Diệt khuẩn tái sinh chồi chuyển gen 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Bích Ngọc - Phịng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận văn Tơi muốn bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS Lê Văn Sơn - Phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi, ủng hộ giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Phương Thảo KS Lê Hồng Đức - Phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học cộng tác giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn chủ nhiệm đề tài, TS Trần Hồ Quang cho phép thực phần nội dung đề tài “Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho sợi gỗ dài” thuộc Chương trình Ứng dụng CNSH Nông nghiệp, Bộ Nông Nghiệp Phát triển nơng thơn Trong q trình làm luận văn tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình tồn thể cán phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Cơng nghệ Sinh học Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán thuộc sở đào tạo Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên giảng dạy tạo điều kiên cho tơi hồn thành khóa học Cuối tơi biết ơn người thân gia đình ln bên động viện, quan tâm tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Thái Nguyên, ngày 25 tháng 10 năm 2013 Học viên Số hóa trung tâm học liệu Hồng Vũ Minh http://lrc.tnu.edu.vn/ Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CNSH Công nghệ sinh học AS Acetosyringone EST sequencing for Express Sequence Tag CAD Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase CCR Cinnamoyl CoA Reductase BAP Benzyl Amino Purine Kin Kinetin IBA Indol-3-Butyric Acid NAA Naphthyl Acetic Acid MS Môi trường Murashige Skoog (1962) LB Môi trường nuôi cấy Luria and Betani Knop Môi trường Sachs & Knop (1860) TDZ Thidiazuron GUS β - Glucuronidase gene kb kilo base kDa kilo Dalton OD Optical density – Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi trùng hợp NPT neomycin phosphotransferase HPT hygromycin phosphotransferase dNTP deoxynucleotide triphosphate Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nồng độ BAP, kinetin TDZ công thức môi trường tái sinh 29 Bảng 2.2 Nồng độ BAP, NAA IBA công thức môi trường tái sinh 30 Bảng 2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn A tumefaciens 32 Bảng 2.5 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 36 Bảng 3.1 Kết tạo mẫu bạch đàn sau ngày nuôi cấy 39 Bảng 3.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng cytokinin đến khả tái sinh 40 Bảng 3.3 Ảnh hưởng tổ hợp chất điều hịa sinh trưởng BAP nhóm auxin đến khả tái sinh chồi 45 Bảng 3.4 Ảnh hưởng NAA IBA tới khả rễ chồi 49 Bảng 3.5 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tạo mô sẹo 50 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu biến nạp 51 Bảng 3.7 Hiệu suất chuyển gen thí nghiệm 52 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng với NaOCl 30% đến kết tạo mẫu Bạch đàn in vitro từ phôi hạt 39 Biều đồ 3.2 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi 41 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi 42 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả tái sinh chồi 43 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng BAP TDZ đến khả tái sinh chồi trực tiếp 43 Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng BAP NAA tới khả tái sinh 46 Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng BAP IBA tới khả tái sinh 47 Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng BAP, NAA IBA đến khả tái sinh 47 Biểu đồ 3.9 Ảnh hưởng môi trường đến khả tạo mơ sẹo 50 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 49 chuyển trực tiếp đất Mơi trường kích thích tạo rễ thường bổ sung chất điều hịa sinh trưởng thuộc nhóm auxin Auxin nhóm điều hịa sinh trưởng thực vật sử dụng thường xuyên nuôi cấy mô, tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chễ với thành phần khác mơi trường để kích thích tăng trưởng mơ sẹo, huyền phù tế bào, điều hịa phát sinh hình thái, đặc biệt phát sinh rễ Các chồi bạch đàn sinh trưởng, phát triển tốt có chiều cao từ - 5cm cấy chuyển sang môi trường rễ (R1-5) nuôi dàn đèn neon Sau - tuần nuôi thu thập xử lý số liệu trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng NAA IBA tới khả rễ chồi Công thức môi NAA IBA Số chồi Số chồi Tỷ lệ trường (mg/l) (mg/l) cấy rễ (%) ĐC 0,2 20 20 R1 0,3 0,2 20 45 R2 0,6 0,2 20 20 100 R3 0,8 0,2 20 15 75 R4 0,2 20 14 70 Quan sát tỷ lệ hình thành rễ chồi sau thời gian tuần, ta thấy công thức môi trường (ĐC) không bổ sung NAA, tỷ lệ rễ thấp (20%) Khi tăng dần nồng độ NAA bổ sung vào môi trường rễ tỷ lệ hình thành rễ chồi tăng dần lên cho tỷ lệ tạo rễ cao (100%) công thức R2 (0,6 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA) (bảng 3.4) Sau xác định công thức so sánh với báo cáo Bùi Văn Thắng cộng (2013) 0,5 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA cho thấy kết phù hợp Vậy môi trường tăng khả rễ bạch đàn là: MS + 0,6mg/l NAA + 0,2mg/l IBA + 30g/l sucrose + 8g/l agar Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 50 3.2.4 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tái sinh Lá mầm thân mầm cắt thành mảnh nhỏ cấy lên công thức môi trường dinh dưỡng tạo mô sẹo (M1-5) nuôi đèn neon Sau tuần, kết thu thập xử lý số liệu trình bày bảng 3.5, biểu đồ 3.9 Bảng 3.5 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tạo mô sẹo CTNC Môi trường Số mẫu Số mẫu tạo Tỷ lệ Đặc điểm khối mô sẹo dinh dưỡng cấy mô sẹo (%) M1 MS 90 85 94,44 Mô sẹo trắng, M2 1/2MS 90 71 78,89 Mô sẹo vàng nhạt, xốp M3 MS* 90 88 97,78 Mô sẹo trắng - hồng, M4 Knops 90 80 88,89 Mô sẹo trắng, M5 Knops* 90 85 94,44 Mô sẹo trắng, Số liệu cho thấy cấy mơi trường khác tỷ lệ mơ sẹo tạo thành thay đổi khác Cụ thể cơng thức thí nghiệm tỷ lệ mơ sẹo tạo thành thay đổi từ 78,89% (M2) đến 97,78% (M3) Ta nhận thấy tỷ lệ tạo mô sẹo M3 cao nhất, cho ta mơ sẹo có màu trắng - hồng Nên môi trường MS* mơi trường thích hợp cho tạo mơ sẹo bạch đàn urô Biểu đồ 3.9 Ảnh hưởng môi trường đến khả tạo mơ sẹo Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 51 Hình 3.3 Mẫu tái sinh chồi môi trường M3 3.3 Kết chuyển gen EcHB1 vào bạch đàn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.3.1 Tạo dịch huyền phù Lấy khuẩn lạc A tumefaciens chủng CV58/pGWB2 mang gen EcHB1 nuôi phục hồi để thu dịch huyền phù phục vụ cho nội dung chuyển gen Dịch huyền phù vi khuẩn thu có giá trị đo OD600 = 0,5 đủ điều kiện biến nạp vào thân mầm bạch đàn 3.3.2 Nhiễm khuẩn đồng nuôi cấy Thân mầm mầm bạch đàn cho vào dịch huyền phù vi khuẩn với thời gian 30 phút, sau thấm khơ giấy thấm vô trùng Các mảnh thân đồng nuôi cấy tối khoảng thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 môi trường: MS (1/2 N) + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 200 µM AS Sau khoảng thời gian mẫu cấy chuyển lên môi trườn tái sinh bổ sung 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l kanamycin Sau tuần nuôi cấy, thu thập số liệu xử lý kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu biến nạp Công thức Thời gian đồng nuôi cấy(giờ) Sơ mẫu thí nghiệm Số mẫu tái sinh Tỷ lệ (%) Đ1 24 60 (2/60) Đ2 48 60 10 (6/60) Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 52 Đ3 72 60 0 Số lượng chồi kết đánh giá tạm thời đến hiệu biến nạp Kết nghiên cứu cho thấy, mẫu thời gian đồng nuôi cấy 48 (Đ2) cho tỷ lệ chồi sau biến nạp cao (10%) Ta nhận thấy thời gian 72 đồng ni cấy tỷ lệ mẫu bị úng nhũn nhiễm lại cao, khó diệt khuẩn tỷ lệ mẫu chết cao (bảng 3.6) 3.3.3 Diệt khuẩn tái sinh chồi chuyển gen Căn vào kết thu từ thí nghiệm phần trên, mẫu sau đồng nuôi cấy mang diệt khuẩn cho vào môi trường tái sinh có bổ sung kanamicyn cefotaxim: MS(1/2 N) + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l IBA + 50 mg/l kanamicyn + 500 mg/l cefotaxime Sau tuần nuôi cấy môi trường tái sinh thu kết bảng 3.7 Bảng 3.7 Hiệu suất chuyển gen thí nghiệm Loại vật Số mẫu Số Số chồi Số chồi Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%) liệu nhận thí mẫu dương dương chơi gen nghiệm tái tính tính với dương chuyển sinh môi PCR tinh/ chôi gen/∑ chồi trường tái sinh mẫu thí chọn lọc Mảnh 508 45 nghiệm mầm Đoạn thân 513 42 mầm Tổng 1021 87 Số hóa trung tâm học liệu 6,67 0.59 (3/45) (3/508) 9,52 0,78 (4/42) (4/513) 8,04 0,69 (7/87) (7/1021) http://lrc.tnu.edu.vn/ 53 Các mẫu sau cho vào mơi trường chọn lọc có kanamycyn cefotaxim để diệt khuẩn, ta quan sát thấy có lượng mẫu tái sinh thành chồi, mẫu cịn lại phân hóa chậm, vàng dần, đen chết Như mẫu phân hóa chậm, vàng dần, đen chết gen kháng Kan chuyển vào không tiếp tục phiên mã chúng chưa chuyển vào nên không tái sinh môi trường chọn lọc Các mẫu tái sinh thành chồi đưa sang môi trường chọn lọc để tránh mẫu chết sản sinh chất làm ức chế tái sinh mẫu chồi Hình 3.4 Kết tái sinh rễ i: mầm tái sinh môi trường chọn lọc; ii: thân mầm tái sinh môi trường chọn lọc; iii: Các chồi sau 32 tuần nuôi cấy; iv: chồi rễ môi trường chọn lọc Các mẫu tái sinh chồi sau chuyển vào mơi trường rễ có bổ sung chất chọn lọc cho thấy chồi rễ, sinh trưởng chậm ngừng sinh trưởng Các chồi rễ lấy mảnh đem tiến hành PCR kiểm tra đánh Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 54 giá tạm thời có mặt gen Từ kết cho thấy, thân mầm có tỷ lệ chồi chuyển gen/∑ chồi tái sinh môi trường chọn lọc cao so với mảnh mầm tỷ lệ 0,78% chuyển gen/∑ mẫu thí nghiệm cao cơng thức nghiên cứu Hình 3.5 Kết kiểm tra sảm phẩm i: Kết kiểm tra DNA tổng số bạch đàn; ii: Kết điện di PCR nhân gen (M: thang DNA chuẩn 1kb; 1: đối chứng âm; 2,3,4,5: dòng bạch đàn chuyển gen) Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Nghiên cứu tìm mơi trường chất điều hịa sinh trưởng phù hợp với khả tái sinh trực tiếp tái sinh từ mô sẹo: + Xác định chất điều hịa trưởng thích hợp cho tái sinh bạch đàn 0,5 mg/l BAP 0,2 mg/l IBA thu được: i) tỷ lệ tái sinh chồi trực tiếp đạt cao 39,29%, trung bình 4,67 chồi/mẫu; ii) tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo đạt cao 40,62%, trung bình 4,33 chồi/mẫu + Xác định môi trường ảnh hưởng đến khả tái sinh chồi trực tiếp tái sinh chồi từ mô sẹo có tỷ lệ tạo tái sinh chồi đạt 97,78% môi trường MS* 1.2 Xác định khả rễ có tỷ lệ rễ đạt 100% môi trường bổ sung 0,6 mg/l NAA 0,2 mg/l IBA 1.3 Xây dựng quy trình chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) thông qua Agrobacterium tumefaciens với hiệu suất chuyển gen đạt 0,78% chuyển gen/tổng số mẫu thí nghiệm thu bạch đàn urô mang gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 56 KIẾN NGHỊ 2.1 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật vi nhân giống bạch đàn urơ để ứng dụng vào sản xuất trồng chất lượng tốt phục vụ trồng rừng sản xuất 2.2 Đưa dòng bạch đàn urô chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) điều kiện tự nhiên Theo dõi sinh trưởng phát triển bach đàn, thu hạt kiểm tra mức độ ổn định gen chuyển kỹ thuật sinh học phân tử 2.3 Ứng dụng nghiên cứu quy trình chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào đối tượng lâm nghiệp có ý nghĩa kinh tế khác Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Andrew I (1991), Thiết kế đơn giản cho thí nghiệm lâm nghiệp , Bản tin, Viện nghiên cứu lâm nghiệp (số 71), 39 trang Bộ Nông nghiệp PTNT (2002), Số liệu thống kê Nông nghiệp PTNT 1996 – 2001, Hà Nội, Nhà xuất Nơng nghiệp, 599 trang Bùi Văn Thắng, Chu Hồng Hà, Hồng Xn Xính, Nguyễn Văn Mùi, Lê Trần bình (2005), "Thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp mang gen mã hoá kháng nguyên vỏ glycoprotein virus dại Báo cáo Khoa học", Hội nghị Khoa học tồn quốc Cơng nghệ Sinh học, hướng 8.2, tr 306-308 Dương Mộng Hùng (1993), Chọn trội nhân giống nuôi cấy mơ tế bào cho hai lồi bạch đàn E camadulensis E urophylla, Báo cáo đề tài, trường Đại Học Lâm nghiệp, Hà Tây Đặng Trọng Lương, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (2001a), "Nghiên cứu chuyển gen cryIA(c) kháng sâu vào số giống cải bắp (Brassica oleraceavar capitana) qua Agrobacterium", Kết nghiên cứu khoa học 1999-2000, Viện Di truyền Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà nội, tr 120-128 Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (2001b), "Phân lập thiết kế vector mang gen tổng hợp insulin để chuyển vào lúa mì", Thông tin Công nghệ Sinh học ứng dụng, tr 36-41 Lê Châu Thanh, Phạm Thanh Thoại, Dỗn Thái Hịa, Những thí nghiệm hóa học gỗ cenlulose, NXB ĐH Bách Khoa Hà Nội Lê Đình Khá (1970), Một dạng Bạch đàn sinh trưởng nhanh miên Bắc Việt Nam, Tập san lâm nghiệp, (số 3), trang Lê Đình Khá (1999), Nghiên cứu sử dụng giống lại tự nhiên Keo tai tượng Keo tràm Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 170-172 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 58 10 Lê Đình Khá Nguyễn Việt Cường (2001), Ưu lai sinh trưởng tính chống chịu số tổ hợp lai khác loài Bạch đàn, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 41-43 11 Lê Đình Khá, Đồn Thị Mai (2002), "Một số phương thức nhân giống sinh dưỡng sản xuất lâm nghiêp", Công nghệ nhân sản xuất giống trồng, giống lâm nghiệp giống vật nuôi, NXB Lao Động xã hội (Chủ biên: Ngô Thế Dân, Lê Hưng Quốc), Hà Nội (2002), tr 166-182 12 Lê Đình Khá cộng (2003), Chọn tạo nhân giống cho số lồi trơng rừng chủ yếu Việt Nam, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 13 Lê Đình Khá, Dương Mộng Hùng (2003), Giống rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 14 Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Thuỳ Dương, Đào Thị Thu Hà, Huỳnh Thị Thu Huệ, Lê Trần Bình, Nông Văn Hải (2004a), "Thiết kế vector hệ mang gen kháng côn trùng cryIA(c) để chuyển vào trồng", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2(1),tr 85-92 15 Lê Thị Thu Hiền, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Hải Yến, Lê Trần Bình, Nơng Văn Hải (2005), "Thiết kế Ti-Plasmid tái tổ hợp hệ mang gen mã hố vip3A có hoạt tính diệt trùng", Hội nghị khoa học tồn quốc 2005: Cơng nghệ Sinh học nghiên cứu Trường Đại Học Nông nghiệp I Hà nội 16 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 17 Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển (1998), "Bước đầu chuyển gen bar, gen gus gen cryIA(c) vào đậu xanh (Vigna radiata L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens", Hội nghị tồn quốc lần thứ Cơng nghệ Sinh học lúa, 86-87 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 59 18 Nguyễn Đức Kiên, Trần Hồ Quang, Gunnar Jansson, Chris Harwood, David Clapham, Sara von Arnold (2009), "Cellulose content as a selection trait in breeding for kraft pulp yield in Eucalyptus urophylla", Ann For Sci (66), tr 711-719 19 Nguyễn Hoàng Nghĩa (2000), Chọn giống bạch đàn Eucalytus theo sinh trưởng kháng bệnh Việt Nam, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 20 Nguyễn Hồng Nghĩa, Lê Đình Khá, Hồng Chương (1993), Kết khảo nghiệm lồi xuất xứ bạch đàn giai đoạn 1990-1992, Báo cáo khoa học, Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam, 41 trang 21 Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển (1999), Tạo thuốc (Nicotiana tabacum L.) kháng thuốc trừ cỏ basta chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Báo cáo Khoa học Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà nội, tr 1297-1304 22 Nguyễn Luyện, "Tìm hiểu bạch đàn E urophylla", Tạp chí lâm nghiệp (số 10, tháng 10/1991) 23 Nguyễn Quang Thạch, (1995), Công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội 24 Nguyễn Quang Thạch, (2000), Giáo trình sinh lý thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 25 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005) Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 26 Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2003), "Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro Hông (Paulownia forturey) ảnh hưởng tác nhân chọn lọc để tạo chuyển gen", Báo cáo Khoa học hội nghị Công nghệ Sinh học tồn quốc 2003, tr 866-869 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 60 27 Phan Tố Phượng, Phạm Thu Hằng, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý, Lili C., Zhang S., Fauquet C M., Beachy R N (1998) Chuyển gen kháng hygromycin, gen gus gen kháng bệnh bạc vào lúa súng bắn gen Tạp chí Nơng nghiệp Công nghiệp thực phẩm, (2), tr 56-57 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 28 Anterola M., Lewis G (2002), "Trends in lignin modification: a comprehensive analysis of the effects of genetic manipulations/mutations on lignification and vascular integrity", Phytochemistry 6, pp 221–294 29 Baghdady A., Blervacq A.S., Jouanin L., Grima-Pettenati J., Sivadon P., Hawkins S (2006), "Eucalytus gunnii CCR and CAD2 promoters are active in lignifying cell during primary and secondary xylem formation in Arbidopsis thaliana", Plant Physiol and Bioch 44, pp 674-683 30 Demura, T., Tashiro, G., Horiguchi, G., Kishimoto, N., Kubo, M., Matsuoka, N., Minami, A., Nagata-Hiwatashi, M., Nakamura, K., Okamura, Y., Sassa, N., Suzuki, S., Yazaki, J., Kikuchi, S., and Fukuda, H (2002), “Visualization by comprehensive microarray analysis of gene expression programs during transdifferentiation of mesophyll cells into xylem cells”, PNAS USA 99, pp 15794-15799 31 Demura T., Ye Z.-H (2010), “Regulation of Plant Biomass Production”, Current Opin Plant Biol, in press 32 Ellen McCrady (1991), The Nature of Lignin, Volume 4, number 33 Endo, S., Pesquet, E., Yamaguchi, M., Tashiro, G., Sato, M., Toyooka, K., Nishikubo, N., Udagawa-Motose, M., Kubo, M., Fukuda, H., and Demura, T (2009), "Identifying new components participating in the secondary cell wall formation of vessel elements in zinnia and Arabidopsis", Plant Cell, 21, pp 1155-1165 34 Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima P.J (1995), "Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 61 dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants", Plant Mol Biol, 4(27), pp 651-667 35 Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W and Xiangning J (2003), "Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco", Plant Growth Regul, 41, pp 279-286 36 Ho, C., Y Chen & Z Chen (2002), "cDNA cloning and sequence analysis of hydroxyconiferaldehyde -methyltransferese from Eucalyptus camaldulensis", Taiwan J For Sci, 17(4), pp 429-438 37 James Clive (2009), Global stutus of commercialzed biotech/GM crops: 2009, ISAAA brief No.41 38 Jyayu B., Jianmin X and Siming G (2003), "Genetic improvement of Tropical Eucalypts in China In Eucalyptus in Asia" Proceeding of an international conference Turbull J.E edit, pp 64-70 39 Kubo M., Udagawa M., Nishikubo N., Horiguchi G., Yamaguchi M., Ito J., Mimura T., Fukuda H., and Demura T (2005), "Transcription switches between protoxylem and metaxylem vessel formation", Genes Dev, 19, pp 1855-1860 40 Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P and Grima P.J (2002), "The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous plant species", Plant Mol Biol, 50(3), pp 497-509 41 Lauvergeat, V., P Rech, A Jauneau, C Guez, P Coutos-Thevenot & J Grima-Pettenati (2002), "The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunni cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous plant species", Plant Mol Biol, 50(3), pp 497-509 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 62 42 Luo Jianzhong (2003), "Variation in growth and wood density of Eucalyptus urophylla In Eucalyptus in Asia", Proceeding of an international conference Turbull J.E edit, pp 94-100 43 Matthieu Chabannes, Abdellah Barakate, Catherine Lapierre, Jane M Marita, John Ralph, Michel Pean, SaoEda Danounl, Claie Halpin, Jacqueline Grima-Pettenati and Alain Michel Boudetl (2001), "Strong decrease in lignin content without significant alterration of plant development is induced by simultaneous down-regulation of cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) in tobaco plants", The Plant Journal (2001), 28(3), pp 257-270 44 Murashige T and Skoog F (1962), “A resied medium for rapid growth and bioassays wirh tobacco tissue cultures”, Physiol Plant, (15), pp 473-495 45 Poke F.S, Rene E.Vaillancourt, Brad M.Potts & James B.Reid (2005), "Genomic research in Eucalyptus", Genetica (2005) 125, pp 79–101 46 Poke, F.S., R.E Vaillancourt, R.C Elliott & J.B Reid (2003), "Sequence variation in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD2)", Mol Breed, 12(2), pp 107-118 47 Santos, P.E.T (1990), "Potential for genetic improvement program, estimates of genetic parameters and genotype x environment interaction in Eucalyptus urophylla S.T.Blake stands", Scienctia Forestalis 43-44, pp 11-19 48 Sonoda, T., Koita, H., Nakamoto-Ohta, S., Kondo, K., Suezaki, T., Kato, T., Ishizaki, Y., Nagai,N., Iida, N., Sato, S., Umezawa, T., and Hibino, T (2009), "Increasing fiber length and growth in transgenic tobacco plants overexpressing a gene encoding the Eucalyptus camaldulensis HD-Zip class II transcription factor", Plant Biotech, 26, pp 115-120 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 63 49 Takayoshi Koyama, Naoki Kato, Takashi Hibino, Tetsu Kawazu, Tetsuya Kimura*,Kazuo Sakka (2006), "Isolation and expression analysis of phosphate transporter genes from Eucalyptus camaldulensis", Plant Biotech, 23, pp 215-218 50 Tsutomu Kawasaki, Hisako Koita, Tomoyuki Nakatsubo, Kana Hasegawa, Kenichi Wakabayashi, Hiroki Takahashi, Kenji Umemura, Toshiaki Umezawa, and Ko Shimamoto (2005), "Cinnamoyl-CoA reductase, a key enzyme in lignin biosynthesis, is an effector of small GTPase Rac in defense signaling in rice", PNAS vol 103 no 1, pp 230–235 51 Wei X, Borralho N.M.G (1998a), "Genetic control of growth traits of Eucalyptus urophylla S.T Blake in Southest China", Silvae Genetica 47(23), pp 158-165 52 Yamaguchi M., Ohtani M., Mitsuda M., Kubo M., Ohme-Takagi M., Fukuda H., and Demura T (2010), “VND-INTERACTING2, a NAC domain, negatively regulates xylem vessel formation in Arabidopsis”, Plant Cell in press 53 Zhong R., Demura T., and Ye Z.H (2006), "SND1, a NAC domain transcription factor, is a key regulator of secondary wall synthesis in fibers of Arabidopsis", Plant Cell, 18, pp 3158-3170 TÀI LIỆU WEB 54 Bảo Ngọc (2010), Thành công nghiên cứu bột giấy có hiệu suất cao, http://www.baomoi.com, ngày 07/12/2010 55 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 56 http://vi.wikipedia.org/wiki/Xylem 57 http://en.wikipedia.org/wiki/Ti_plasmid Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ... nạp gen Xuất phát từ sở khoa học nhu cầu ứng dụng vào thực tiễn, thực đề tài : "Nghiên cứu quy trình chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) thông qua. .. Agrobacterium tumefaciens" Mục tiêu đề tài + Xây dựng quy trình chuyển gen cho bạch đàn urô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens + Tạo dịng bạch đàn urơ chuyển gen (EcHB1) tăng chiều dài sợi gỗ thông. .. TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HỒNG VŨ MINH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ (ECHB1) VÀO BẠCH ĐÀN URÔ (EUCALYPTUS UROPHYLLA) THƠNG QUA AGROVACTERIUM TUMEFACIENS Chun ngành: Cơng nghệ