Tạo giống thuốc lá C9-1 chuyển gen kháng bệnh khảm lá bằng kỹ thuật RNAi

BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC

Giống sạch bệnh thu từ cây thuốc lá khỏe chọn giống chống bệnh bằng cách lai với các giống thuốc lá dại.Sử dụng nguồn vật liệu giống sạch bệnh đƣợc xem là biện pháp quan trọng nhất để hạn chế bệnh virus ở nhiều loại cây trồng. Thành công trong việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống cây trồng kháng bệnh virus đƣợc đánh dấu bởi công bố của Beachy và cộng sự năm 1986 khi những cây thuốc lá chuyển gen mã hóa protein vỏ của TMV (cấu trúc dạng sense) đã biểu hiện tính kháng với virus này [14]. Các bước chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyển mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây chuyển gen [38].

Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp,…) có khả năng kháng lại chính virus đó đã đƣợc chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại virus khác nhau nhƣ: Potato virus Y PVY [43][33]cucumber mosaic virus CMV, Plum pox potyvirus PPV [18], Tobacco mosaic virus TMV và Potato virus Y PVY[35], Tomato yellow leaf curl virus TYLCV [46]Rice tungro bacilliform virus RTBV, African cassava mosaic virus ACMV [41] … Trong những nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thường được sử dụng để chuyển vào cây và sẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và cộng sự [ 26] đã công bố kết quả tạo ra đƣợc một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã đƣợc phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này. Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, đƣợc công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus.

Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh đƣợc sử dụng chuyển vào cây trồng để tạo tính kháng có thể là các loại khác nhau nhƣ: các cấu trúc của virus theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngƣợc (antisense), các cấu trúc dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) và các miRNA nhân tạo có đích là các trình tự gen của virus gây bệnh, hay kỹ thuật RNAi “RNA interference”, đang đƣợc quan tâm nhiều và ứng dụng rộng rãi. Ở thực vật có ba con đường ức chế RNA trong đó con đường đầu tiên là sự ức chế gen sau phiên mã PTGS (post-transcriptional gen silencing) qua trung gian là các RNA nhỏ có vai trò ức chế siRNA (short interfering RNA) đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong những nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus.

MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT NAM

Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng to lớn kỹ thuật RNAi trong việc tạo giống cây trồng kháng virus. Kỹ thuật RNAi cũng đã đƣợc tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong đề tài trọng điểm cấp nhà nước thuộc chương trình phát triển công nghệ sinh học (KC04- 03/06-10) với mục đích tạo cây đu đủ và cây ăn quả có múi chuyển gen kháng bệnh virus. Một trong những kết quả đạt đƣợc của đề tài là đã tạo ra đƣợc các dòng đu đủ chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với virus đốm vòng.

Bên cạnh cây trồng chuyển gen kháng virus cũng đã có rất nhiều thành công trong việc tạo cây có khả năng kháng bệnh cây trồng, kháng vi khuẩn, kháng côn trùng có hại hay cây chuyển gen chống chịu với điều kiện sinh thái bất lợi mang lại hiểu quả kinh tế cao[6].

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm

Bổ sung vào cốc đựng Javen 3ml HCl, hỗn hợp này sẽ tạo ra khí Clo có tác dụng khử trùng hạt thuốc lá. Sau 4h lấy hạt đã khử trùng ra để trong box cấy 30 phút để bay hết khí rồi tiến hành gieo hạt. Khi cây phát triển đƣợc 1 tuần, đánh giá tỉ lệ nảy mầm và cấy chuyển sang môi trường MS mới.

- Lấy chủng khuẩn từ ống giữ chủng và cấy vạch lên môi trường LB đặc có bổ sung các kháng sinh chọn lọc ( Cefotaxime 25mg/l, kanamycin 50mg/l đối với chủng A.tumerfaciens mang vecter chuyển gen chứa câu trúc pCB_GUS; Rifamycine 50mg/l, streptomycine 100mg/l, spectinomycine 100mg/l đối với chủng vi khuẩn A.tumerfaciens mang vecter chuyển gen chứa cấu trúc TMV_RNAi) nuôi trong tủ ổn nhiệt 28˚C trong thời gian 48 giờ. - Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 2 ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc nhƣ khi nuôi ở môi trường LB đặc. Dùng dao cắt bốn cạnh mép lá để gây tổn thương, tạo thành các mảnh lá có hình vuông kích thước khoảng 0,25 cm2.

Ngâm khoảng 30 mảnh lá trong đĩa petri chứa 20 ml dung dịch IM có bổ sung 100àl dịch khuẩn Agrobacterium. Tiến hành tách các chồi nhỏ và cấy trên môi trường MS, 30g/l glucose,8g/l aga,pH 5,8 và có chứa các kháng sinh 50mg/l kanamycine, 250mg/l Cefotaxime. Đối với những cây đƣợc chuyển cấu trúc pCB_GUS, biểu hiện của gen gus đƣợc kiểm tra bằng nhuộm trong dung dịch X-gluc (50 mM Na2HPO4 và NaH2PO4; pH7;.

Sau thời gian ủ , mẫu được rửa sạch bằng nước cất khử trùng và ngâm vào dung dịch cồn 70% nhằm loại bỏ diệp lục. Sau khi loại bỏ diệp lục, mẫu đƣợc đƣa lên kính hiển vi soi nổi, quan sát và chụp ảnh. ADN tổng số từ lá thuốc lá đƣợc tách chiết và sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sự có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá.

(1) Lấy 100mg lá non (trong ống effendorf 1.5ml) nghiền trong nitơ lỏng cho tới khi thành dạng bột mịn. Phân tích khả năng kháng virus của các cây chuyển gen bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo. Các cây chuyển gen sau khi trồng ngoài nhà lưới cao khoảng 10-30 cm được kiểm tra tính kháng virus bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo theo phương pháp của Herbers và cộng sự (1996) [20].