Tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc rnai chứa đoạn gen cpi của hai loài smv và bymv

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.01.21 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, số kết cộ Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, phần đƣợc cơng bố Tạp chí Khoa học-Cơng nghệ đồng tác giả, phần cịn lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Thu Hiền, Trƣờng Đại học Y-Dƣợ ững ý kiến quý báu tận tình giúp đỡ tơi q trình tiến hành thí nghiệ ề tài luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán Bộ môn Di truyền & Sinh học đại, khoa Sinh-KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm –Đại học Thái Nguyên; xin cảm ơn chị Trần Thị Hồng – KTV phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập, thực thí nghiệm đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu K & Nhân văn miền núi tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập hồn thành khố học Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn đến bố mẹ, anh chị bạn bè động viên, khuyến khích, giúp đỡ tơi, ln quan tâm chỗ dựa cho tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn - Tác giả Lê Thị Hồng Trang Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN………………………………………………………… i LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………… ii MỤC LỤC……………………………………………………………… iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT …………… ………………… v DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………… vii DANH MỤC CÁC HÌNH……………………………………………… viii MỞ ĐẦU…………………………………………………………… 2 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………… 1.1 Cây đậu tƣơng……………………………………………………… 1.1.1 Nguồn gốc đặc điểm nông sinh học đậu tƣơng…………… 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới nƣớc……… 1.2 Bệnh khảm virus gây bệnh khảm SMV, BYMV……………… 10 1.2.1 Bệnh khảm đậu tƣơng…………………………………………… 10 1.2.2 Virus gây bệnh khảm SMV BYMV………………………… 11 1.3 Kỹ thuật RNAi…………………………………………………… 12 1.3.1 Cơ chế ức chế gen kỹ thuật RNAi…………………………… 12 … 14 ………… 16 1.4.1 Chuyển gen trực tiếp súng bắn gen vào mơ đích………… 16 1.4.2 Chuyển gen gián tiếp thông qua A tumefaciens ………………… 17 1.4.3 Hệ thống tái sinh hệ thống chọn lọ 1.4.4 ……… 19 22 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP………………………… 24 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ………………………… 24 24 ………………………………………………………… 2.1.3 Thi 25 25 25 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………… 26 2.2.1 Phƣơng pháp tạo vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp…………… 26 2.2.2 Phƣơng pháp gây tổn thƣơng nách mầm……………………… 27 2.2.3 Phƣơng pháp tái sinh đậu tƣơng từ nách mầm…………… 28 2.2.4 Phƣơng pháp lây nhiễm tạo đậu tƣơng chuyển gen……… 28 2.2.5 Phân tích đậu tƣơng chuyển gen…………………………… 32 2.2.6 Phƣơng pháp xác định hiệu suất chuyển gen…………………… 34 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 KẾT QUẢ TẠO A TUMEFACIENS MANG VECTOR CHUYỂN GEN pK7GW-CPi (SMV-BYMV)…………………………………… 35 3.2 …… 37 3.3 TƢƠNG 41 3.3.1 Tái sinh in vitro chuyể 41 giống đậu tƣơng ĐT12 DT2008 3.3.2 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 CÔNG 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa Trung tâm Học liệu 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine Bp Base pair (cặp base) BYMV Bean yellow mosaic virus CCM Cocultivation medium CP Coat protein (protein vỏ) CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide cs Cộng ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid Food and Agriculture Organization of the United Nations FAO (Tổ chức lƣơng thực nông nghiệp liên hợp quốc) GA3 Gibberellic acid GM Mơi trƣờng nảy mầm gus Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase hpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) IhpRNA Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3butyric acid Kb Kilo base Km Kanamycin Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng theo Murashige Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid PCR Polymerase chain reaction RISC RNA-inducing silencing complex RM Môi trƣờng rễ RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference SIM Môi trƣờng tạo chồi SEM Môi trƣờng kéo dài chồi siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Ti- plasmid Plasmid tạo khối u T0,T1 Các hệ đậu tƣơng chuyển gen T0 Cây đậu tƣơng chuyển gen tái sinh chồi T1 Hạt chuyển gen T0 nảy mầm thành T1 Vir Virulence Region v/p Vịng/phút YEP Yeast extract peptone Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới từ năm 2008 đến 2012………………………………………………………… ậu tƣơng củ Bảng 1.2 nƣớc đứng đầu giớ ố 2010, 2011, 2012 Bảng 1.3 Sản xuất đậu tƣơng Việt Nam từ 2007 – 2013…………… Bảng 2.1 Thành phần loại môi trƣờng tái sinh in vitro……………… 29 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách DNA tổng số………………………… 32 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng nghiên cứu 33 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 33 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng phƣơng thức gây tổn thƣơng nách mầm đến khả tạo đa chồi…………………………………… Bảng 3.2 - 38 A tumefaciens …………………………………………… 43 Bảng 3.3 Khả phát sinh chồi, kéo dài chồi khả rễ hai giống ĐT12 DT2008 trình chuyển gen Bảng 3.4 Số hóa Trung tâm Học liệu 44 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen SMV………………………………… 11 Hình 1.2 Cơ chế RNA can thiệp……………………………………… 13 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 26 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tái sinh chuyển gen vào đậu tƣơng… 30 Hình 3.1 Kết điệ ản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc…………………………………………………… Hình 3.2 36 37 Hình 3.3 Kết gây tổn thƣơng, tạo đa chồi nách mầm phƣơng thức khác hai giống ĐT12 DT2008…… 39 Hình 3.4 Kết tái sinh chuyển gen giống đậu tƣơng ĐT12 DT2008 42 Hình 3.5 Kết tỷ lệ tạo đa chồi, kéo dài chồi đƣa giá thể… 45 số tách từ Hình 3.6 Đ 2008 46 ện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấ Hình 3.7 ậu tƣơng chuyể - 12 47 ện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấu Hình 3.8 trú chuyể ậu tƣơng - 2008 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 48 A.tumefaciens [2] Đối với nghiên cứu chuyển gen gián tiếp thực vật, chủng A tumefaciens A rhizogens đƣợc sử dụng phổ biến hai lồi có khả xâm nhiễm qua vết thƣơng hầu hết lồi thực vật hai mầm số loài thực vật mầm Kết gây khối u hay hình thành lơng rễ tơ theo chế tự nhiên Trong vi khuẩn A tumefaciens đƣợc sử dụng rộng rãi phƣơng pháp dễ sử dụng, tốn nhƣng mang lại hiệu quả, thuận lợi cho việc phân tích chuyển gen khơng gây tổn thƣơng tế bào [2] DNA tổng số từ dòng đậu tƣơng giống ĐT12 20 dòng đậu tƣơng giống tra gel agarose 17 18 19 20 21 22 23 24 25 10 11 12 13 14 15 16 26 27  28 29 30 31 32  33 số tách từ Hình 3.6 T12 (1-5 Kết thể hiệ 2008 (6-25) 3.6 có cao (SMV-BYMV) tro Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - gen CPi (SMV-BYMV) K (SM - 12 3.7 oạn DNA thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 573 bp 500 bp 3.7 ện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấ - ậu tương chuyể 12 1-5: dòng đậu tương ĐT12 chuyển gen; M: Marker 50 bp (Thermo Scientific) 12 đƣ : T12-03, T12-5 Kết cho thấy cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) chuyển thành công vào giống đậu tƣơng ĐT12 20 2008 đƣợc thể hình 3.8 Trên hình ảnh cho thấy xuất khoảng DT2008 gen Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ n 500 ện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt cấ 3.8 ậu tƣơng chuyể DT2008 1-20: 20 dòng đậu tương DT2008 chuyển gen; M: Marker 50 bp (Thermo Scientific) 5/20 dịng dƣơng tính, tƣơng PCR ứng vớ ố 3, 10, 11, 12, 16 : T08-3 T08-10, T08-11, T08-12, T08-16 Điều cho thấy chuyển thành công cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) vào giống đậu tƣơng DT2008 3.3.2.3 2008 3.2 c sinh kanamicine 25 chọn lọc gen 12 20 n sống sót giá thể 3.4 12, số 157 Số hóa Trung tâm Học liệu biến nạp http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1,27 2008, số 190 biến nạp ới d 2,63% 3.4) 12 3.4 G (%) ĐT12 1,27 DT2008 25 20 2,63 ẳng định cấu trúc RNAi [CPi (SMV-BYMV)] đƣợc chuyển thành công vào giống đậu tƣơng ĐT12 DT2008 12 Ở sinh vật nhân chuẩn, phổ biến đóng vai trị quan trọng nhiều trình sinh học đặc biệt tạo trồng kháng bệnh virus gây (Hammon cs, 2000) [23] Kỹ thuật thành công đối tƣợng nhƣ Plum pox potyvirus (Nicola-Negri cs 2005), Tobaco mosaic virus (Kai cs, 2005) [16], [25] Năm 2007, Bonfim cs tạo đƣợc dòng đậu tƣơng chuyển gen kháng virus Bean golden mosaic virus với tính kháng lên tới 93%, Shinichiro cs cơng bố kết tạo số dịng thuốc chuyển gen CP cấu trúc ihpRNA có khả kháng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ virus Cucumber Green mottle mosaic virus cao đến hệ thứ T2 (12/14 số kiểm tra) siRNA đƣợc phát dòng chuyển gen [26], [40] N chung, thông qua chế RNAi hầu hết chuyển gen làm chậm tích lũy virus làm chậm giảm nhẹ triệu chứng bệnh virus Ứng dụng kỹ thuật RNAi để tạo trồng kháng virus đƣợc tiến hành nghiên cứu số phịng thí nghiệm nƣớc thu đƣợc thành công định Thành công kể đến thuốc chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus Tobacco mosaic virus [5] Tiếp đến đu đủ kháng bệnh đốm vòng virus Papaya ringspot virus Kết ban đầu cho thấy, số 45 dòng đu đủ chuyển gen đƣợc chọn tạo, có 34/35 dịng có khả kháng hồn tồn với virus đốm vịng Đu đủ đƣợc trồng mơi trƣờng nhiễm bệnh nhƣng đu đủ chuyển gen phát triển mạnh, cho đều, đẹp, suất cao (Chu Hoàng Hà cs, 2011) [6] t , Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1 A tumefaciens (SMV- BYMV) a 1.3 Đã chuyể ậ - 2008 thu đƣợc dòng đậ hệ 2008 dƣơng tính với phản ứ 1,27 2,63% - 12 iếp tục chọn lọc, phân tích biểu hiệ ế hệ tiế Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lị Thị Mai Thu, , Chu Hồng Hà, Chu Hồng Mậ - , 118 (04), tr 111-115 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ngô Thế Dân cs, (1999), Cây Đậu Tương, NXB Nông Nghiệp Trần Quốc Dung, Nguyễn Hồng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Cơng nghệ chuyển gen, NXB Đại học Sƣ phạm, Huế Nguyễn Tiến Dũng, Ngơ Xn Bình, (2011), “Nghiên cứu khả tiếp nhận gen số giống đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merr.) Việt Nam thông qua vi khuẩn A tumefaciens”, Kỷ yếu Hội nghị khoa học tuổi trẻ toàn quốc 2011, tr: 338-343 Trần Văn Điển, (2007), Giáo Trình Cây Đậu Tương, NXB Nơng Nghiệp Chu Hồng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình, (2009), “Tạo trồng chuyển gen kháng bệnh virus kỹ thuật RNAi”, Báo cáo Hội nghị quốc gia sinh vật biến đổi gen quản lý an toàn sinh học, Hà Nội 2009, p 19-28 Chu Hoàng Hà, Đỗ Xuân Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, (2011), “Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng dụng chế RNAi”, Hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam: 316-326 Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, (2011), “Nghiên cứu khả tái sinh biến nạp gen qua nách mầm hai giống đậu tƣơng (Glycine max L.) ĐT12 DT84 Agrobacterium”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 8(38): tr 1305-1310 Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2012),“Nghiên cứu tạo đậu tƣơng chuyển gen mang cấu trúc biểu Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ gen mã hóa kháng nguyên bề mặt virus H5N1 phục vụ sản xuất vaccine thực vật“, Tạp chí khoa học cơng nghệ Đại học Thái Nguyên, 89(1), tr 123-127 Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh invitro đậu tƣơng (Glycine max L Merrili) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí khoa học công nghệ Đại học Thái Nguyên, 52(4), tr 8288 10 Vũ Triệu Mân, (2007), Giáo trình bệnh chuyên khoa, NXB Nông nghiệp 11 Phạm Văn Thiều, (2008), Cây đậu Tương - Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, NXB Nơng nghiệp 12 Lị Thị Mai Thu, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu, (2013),“Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen coat protein virus SMV BYMV”, Tạp chí sinh học, 35(3), tr 129135 13 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, (2008), “Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dƣa chuột kỹ thuật RNAi”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(4A), tr 679-687 Tài liệu tiếng Anh 14 Baulcombe D., (2004), RNA silencing in plants, Nature 431(7006), pp 356-63 15 Chengalrayan K., Hazra S., Gallo M M., (2001), “Histological analysis of somatic embryogenesis and organogenesis induced from mature zygotic embryo-derived leaflets of peanut (Arachis hypogaea L.)”, Plant Sci., 161, pp 415–421 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 16 Di Nicola-Negri E., Brunetti A., Tavazza M., Ilardi V., (2005), “Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus”, Transgenic Res., 14(6), pp 989-94 17 Gary Stacey, (2008), Genetics and genomics of soybean, Springer 18 Geng L., Lihong N., Changlong S., Fuping S., Dafang H., Jie Z., (2011), “High-efficiency regeneration of peanut (Arachis hypogaea L.) plants from leaf discs”, J Biotechnol., 10(59), pp 12650-12652 19 Gelvin S.B., (2010b), “Plant proteins involved in Agrobacterium mediated genetic transformation”, Annu Rev Phytopathol, 48, pp 45-68 20 Gelvin S.B., (2003), “Agrobacterium and plant transformation: The biology behind the “gene-jockeying” tool”, Microbiol Mol Biol, 67(1), pp 16-37 21 Gottula J., Fuchs M., (2009), “Toward a quarter century of pathogenderived resistance and practical approaches to plant virus disease control”, Adv Virus Res., 75, pp 161-83 22 Guyatt K.J., Proll D.F., Mensen A., Davidson A.D., (1996), “The complete nucleotide sequence of bean yellow mosaic potyvirus RNA”, Archives of Virology, 141(7), pp 1231-1246 23 Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G.J., (2000), “An RNA directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells”, Nature, 404, pp 293-296 24 Jimenez V M (2001), “Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones”, Rev, Bras Fisiol Veg., 13, pp 196-223 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 25 Kai Shi, Li Jun Fu, Shuai Zhang, Xin Li, Yang Wen Ke Liao, Xiao Jian Xia, Yan Hong Zhou, Rong Qing Wang, Zhi Xiang Chen, Jing QuanYu, (2013), “Systemic Induction and Role of Mitochondrial Alternative Oxidase and Nitric Oxide in a Compatible Tomato–Tobacco mosaic virus Interaction”, Planta, 237(2), pp 589-601 26 Kenny B., Josias C.F., Elsa O.P.L.N., Érica A.M., Francisco J.L.A., (2007), “RNAi-Mediated Resistance to Bean golden mosaic virus in Genetically Engineered Common Bean (Phaseolus vulgaris)”, Mol Plant Microbe In., 20(6), pp 717-726 27 Kohli A., Twyman R.M., Abranches R., Weget E., Stoger E., Christou P (2003), “Transgene integration, organization and interaction in plants”, Plant Mol Biol, (52), pp.247-258 28 Lim, H., Woo, S., Kim, H S., Jong, S.-K and Lee, J (2007), “Comparison of extraction methods for determining tocopherols in soybeans”, Eur J Lipid Sci Technol., 109, pp 1124–1127 29 Margine M.Paz, Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K.B., Wang K., (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp 167-169 30 Milena Schenkel Homrich, Beatriz Wiebke-Strohm, Ricardo Luís Mayer Weber, Maria Helena Bodanese Zanettini, (2012), “Soybean genetic transformation: A valuable tool for the functional study of genes and the production of agronomically improved plants”, Genetics and Molecular Biology, 35(4), pp 998-1010 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 31 Olhoft, P.M., D.A Somers, (2001), “L-Cysteine increases Agrobacteriummediated T-DNA delivery into soybean cotyledonarynode cells”, Plant Cell Rep., 20, pp 706-711 32 Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A, (2003), “Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary node method”, Planta, 216, pp 723–735 33 Olhoft P.M., Bernal L.M., Grist L.B., Ozias-Akins P., (2007), “A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using pri- mary-node explants from seedlings”, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 43, pp 536-549 34 Paz M.M., Shou H., Guo Z., Zhang Z., Anjan K., Banerjee and Wang K., (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp 167-179 35 Philips G C., Gamborg O L., (2005), “ Plant cell tissue and organ culture, Community centre, New Delhi”, India, pp 91- 93 36 Rech E.L., Vianna G.R and Aragão F.J.L., (2008), “High-efficiency transformation by biolistics of soybean, common bean and cotton transgenic plants”, Nat Protoc, 3, pp 410-418 37 Reddy D V R., Sudarshana M R., Fuchs M., Rao N C and Thottappilly G., (2009), “Genetically Engineered Virus-Resistant Plants in Developing Countries: Current Status and Future Prospects”, Advances in Virus Research, 75, pp 185-220 38 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W., (1984), “Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ inheritance, chromosomal location and population dymnamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81, pp 8014-8018 39 Saruta M., Kikuchi A., Okabe A and Sasaya T., (2005), “Soybean mosaicvirus CP gene for coat protein, partial cds, isolate: OK2”, Plant Virology 40 Shinichiro Kamachi, Atsuko Mochizuki, Masamichi Nishiguchi, Yutaka Tabei, (2007), “Transgenic Nicotiana benthamianaplants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing”, 26(8), pp 1283-1288 41 Smith N.A., Singh S.P., Wang M.B., Stoutjesdijl P.A., Green A.G., Waterhouse P.M., (2000), “Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs”, Nature, 407, pp 319-20 42 Somers D.A., Samac D.A., Olhoft P.M., (2003), “Recent advances in legume transformation”, Plant Physiol, 131, pp 892-899 43 Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai and La Cao Thang, (2008), “Transformation efficiencies of the soybean variety PC19 [Glycine max (L.) Merrill] using Agrobacterium tumefaciens and the cotyledonary node method”, Omonrice, 16, pp 1-8 44 Vianna G.R., Aragão F.J.L., Rech E.L., (2011), “A minimal DNA cassette as a vector for genetic transformation of soybean (Glycine max)”, Genet Mol Res, 10, pp 382-390 45 Waterhouse P.M., Graham M.W., Wang M.B., (1998), “Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA”, Proc Natl Acad Sci USA, 95(23), pp 13959-64 46 Wiebke-Strohm B., Pasquali G., Margis-Pinheiro M., Bencke M., BückerNeto M., Becker-Ritt A.B., Martinelli A.H.S., Polacco J.C., Stolf R., Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Marcelino F.C., (2012), “Ubiquitous urease affects soybean susceptibility to fungi”, Plant Mol Biol, 79, pp 75-87 47 Xue R.G., Xie H.F., Zhang B., (2006), “A multineed leassisted transformation of soybean cotyledonary node cell”, Biotechnology Lett, 28, pp 1551-1557 48 Xue R., Zhang B., (2007), “Increased endogenous methyl jasmo- nate altered leaf and root development in transgenic soybean plants”, J Genet Genomics, 34, pp 339-346 49 Yamada T., Takagi K., Ishimoto M., (2012), “Recent advances in soybean transformation and their application to molecular breeding and genomic analysis”, Breeding Science, 61, pp 480-494 50 Yin G.H., Sun Z.N., Song Y.Z., An H.L., Zhu C.X., Wen F.J., (2010), “Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection”, Appl Biochem Biotechnol, 162(7), pp 1901-1914 51 Zhang Z., Xing A., Staswick P.E and Clemente T.E., (1999), “The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium- mediated transformation of soybean, Plant Cell Tissue Or- gan Cult, 56, pp 37-46 Một số trang web 52.http://www.ngheandost.gov.vn/JournalDetail/ar1681_Can_thiep_ARN_voi _cuoc_song.aspx 53.http://nhanonglamgiau.com/forum/threads/ky-thuat-trong-dau-tuong.605/ 54.www.gso.gov.vn Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 55.http://www.hcmbiotech.com.vn/print.php?id=1388&p=news&f1=title_vn& f2=detail_vn 56.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 57.http://nhanonglamgiau.com/forum/threads/cac-loai-sau-benh-hai-tren-caydau-tuong.654/ 58.http://agriviet.com/nd/4020-ky-thuat-trong-cay-dau-nanh/ 59.http://faostat.fao.org/site/291/default.aspx 60.http://www.vietrade.gov.vn/nong-sn-khac/2750-san-xuat-va-tieu-thu-dautuong-tai-viet-nam-2012-va-mot-so-du-bao.html 61.http://www.patentlens.net/daisy/Antibiotic/g3/1127.html 62.http://www.answers.com/topic/marker-systems 63.http://fcri.com.vn/Product/giong-dau-tuong-dt12-pd14222.html 64.http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi-vn/25/34006/Khuyen-nong/DT2008-Giong-dau-tuong-dot-bien-chiu-han.html 65.http://www.haiduongdost.gov.vn/nongnghiep/?menu=news&catid=8&subje ctid=31&itemid=208&lang=vn&expand=true 66 http://viralzone.expasy.org/all_by_species/50.html Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa CPi từ hai loài SMV BYMV để đƣa vào hệ gen thực vật BYMV [CPi (SMV- BYMV) ] Đoạn gen Số hóa Trung tâm Học liệu pK7GW -CPi (SMV- BYMV) 573 nucleotide... [55] lựa chọn đề tài: ? ?Tạo đậu Xuất phát từ lý tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi hai loài SMV BYMV? ?? Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu cấu trúc RNAi A tumefaciens vi... NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  LÊ THỊ HỒNG TRANG TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN CPi CỦA HAI LOÀI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: DI TRUYỀN