Thiết kế vector mang cấu trúc gen gmexp1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN ĐỨC HÀO THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN ĐỨC HÀO THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Đức Hào Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn NCS Lị Thanh Sơn, Trường Đại học Tây Bắc đóng góp ý kiến quý báu tận tình bảo, giúp đỡ tơi q trình tiến hành thí nghiệm để hồn thành đề tài luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán Bộ môn Di truyền&Sinh học đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm –Đại học Thái Nguyên, cảm ơn cán phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phịng thí nghiệm trọng điểm quốc gia cơng nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập, thực thí nghiệm đề tài Tơi xin cảm ơn Ban giám hiệu trường THPT Phù Lưu, Tuyên Quang tạo điều kiện thuận lợi cho học tập hồn thành khố học Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn động viên khuyến khích giúp đỡ tơi trình làm luận văn Tác giả luận văn Nguyễn Đức Hào Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi Các ký hiệu dùng luận văn vi MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chọn giống đậu tương theo định hướng nâng cao khả chịu hạn 1.1.1 Chọn giống đậu tương chịu hạn đột biến thực nghiệm 1.1.2 Chọn dòng đậu tương chịu hạn công nghệ tế bào thực vật 1.1.3 Chọn dòng đậu tương chịu hạn kỹ thuật chuyển gen 1.2 Gen liên quan đến tính chịu hạn gen GmEXP1 đậu tương 1.2.1 Các gen liên quan đến tính chịu hạn đậu tương 1.2.2 Gen GmEXP1 protein EXP1 đậu tương 10 1.2.3 Vector chuyển gen thực vật 11 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Vật liệu thiết bị 14 2.1.1 Vật liệu 14 2.1.2 Hoá chất thiết bị 15 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phân lập gen 16 2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào thuốc 23 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3 Phương pháp thiết kế vector 25 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Phân lập gen GmEXP1 kỹ thuật RT-PCR 27 3.1.1 Nhân đoạn mã hoá gen GmEXP1 27 3.1.2 Tách dịng đoạn mã hố (cDNA) gen GmEXP1 27 3.1.3 Kiểm tra plasmid trước đọc trình tự 33 3.1.4 Kết đọc trình tự đoạn mã hố gen GmEXP1 34 3.2.2 Kết cắt mở vòng plasmid pRTRA7/3 40 3.2.3 Tạo plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp mang gen GmEXP1 41 3.2.4 Kết cắt plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp HindIII 42 3.2.5 Kết cắt plasmid pCB301 HindIII 43 3.2.6 Tạo vector chuyển gen pCB301 mang cấu trúc GmEXP1 44 3.2.7 Kết tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 45 3.3 Kiểm tra hoạt động vector mang cấu trúc GmEXP1 thuốc mơ hình 47 3.3.1 Kết chuyển cấu trúc GmEXP1 vào thuốc 47 3.3.2 Kết kiểm tra thuốc mang gen GmEXP1 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương Việt Nam từ 2007 đến 2013 Bảng 2.1 Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 17 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 18 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng colony – PCR 20 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng colony – PCR 20 Bảng 2.6 Thành phần gắn gen GmEXP1 vào vector tách dòng pBT 21 Bảng 2.7 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 22 Bảng 2.8 Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 24 Bảng 3.1 Kết tạo thuốc chuyển gen GmEXP1 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Ảnh hạt giống đậu tương SL1 14 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng nghiên cứu 15 Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hố gen GmEXP1 28 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm thơi gel đoạn mã hố gen GmEXP1 29 Hình 3.3 Ảnh khuẩn lạc 31 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR 32 Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp 33 Hình 3.6 Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid trước đọc trình tự 34 Hình 3.7 Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hố gen GmEXP1 giống đậu tương SL1 AF516879 36 Hình 3.8 Sơ đồ so sánh trình tự amino acid protein EXP1 giống SL1 AF516879 37 Hình 3.9 Ảnh điện di sản phẩm cắt pBT/EXP1 38 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 NotI + NcoI 40 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 HindIII 42 Hình 3.12 Ảnh cắt pCB301 HindIII 43 Hình 3.13 Hình điện di sản phẩm colony- PCR 45 Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR 47 Hình 3.15 Hình ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào thuốc 49 Hình 3.16 Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ thuốc 50 Hình 3.17 Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmEXP1 từ thuốc 51 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi CÁC KÝ HIỆU DÙNG TRONG LUẬN VĂN BAP 6- benzyl amino purine bp Base pair DDT Dichloro-diphenyl-trichloroethane DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid đtg Đồng tác giả E coli Escherichia coli GM Germination medium - Môi trường nảy mầm hạt GMO Genetically modified organism - Sinh vật biến đổi gen GMP Genetically modified plant - Thực vật biến đổi gen HSG Heat Shock Granules HSP Heat Shock protein - Protein sốc nhiệt IBA Indole - butyric acid IPTG Isopopyl -D-1 thiogalactopyranoside kb Kilo base LB Luria Bertani MS Môi trường nuôi cấy mô theo Murashige Skoog MSI Dung dịch I (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS MSII Dung dịch II (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS MSIII Dung dịch III (sắt) dùng để pha môi trường MS MSIV Dung dịch IV (muối vi lượng) dùng để pha môi trường MS MSV Dung dịch V (vitamin) dùng để pha môi trường MS NST Nhiễm sắc thể OD Optical density Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi RM Rooting medium - Môi trường rễ TAE Tris - Acetate - EDTA Taq Thermus aquaticus v/p vòng / phút X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 43 mRNA Sản phẩm cắt gel bảo quản nhiệt độ - 200C để dùng cho nghiên cứu 3.2.5 Kết cắt plasmid pCB301 HindIII Thành phần phản ứng cắt plasmid pCB301 gồm: H2O: µl; Red Buffer: µl; HindIII: µl; plasmid pCB301 : 23 µl Ủ 370C 16 Với enzyme HindIII plasmid pCB301 bị cắt điểm 5295 5355 đoạn bị cắt bỏ có kích thước 60 bp băng plasmid pCB301 mở vịng có kích thước 5,502 kb Sản phẩm cắt điện di gel agarose 0,8% (Hình 3.12) ~5,502 kb Hình 3.12 Ảnh cắt pCB301 HindIII; M: thang chuẩn 1kb Kết không thấy xuất băng có kích thước 60 bp, ngun nhân có kích thước q nhỏ nên nhanh chóng di chuyển mơi trường khỏi băng điện di Kết hình ảnh cho thấy xuất đoạn băng mong muốn có kích thước khoảng 5,502 kb cịn có băng lớn 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 kb, có dạng siêu xoắn plasmid chúng di chuyển chậm gel agarose môi trường điện di Chúng tiến hành cắt băng mong muốn gel tinh sạch, bảo nhiệt độ - 200C để phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen sau 3.2.6 Tạo vector chuyển gen pCB301 mang cấu trúc GmEXP1 Plasmid pCB301 dạng Ti-plasmid Agrobacterium tumefaciens cải biến cách loại bỏ gen gây độc gắn vào gen kháng sinh để chọn lọc để phù hợp với việc chuyển gen vào tế bào thực vật Cả hai cấu trúc plasmid pCB301 GmEXP1 xử lý loại enzyme HindIII, đo chúng dễ dàng ghép nối lại với nhờ enzyme T4 ligase Thành phần phản ứng ghép nối gồm: H2O: µl; BufferT4: µl; T4 ligase: µl; GmEXP1: µl; plasmid pCB301 : µl Phản ứng thực 220C khoảng thời gian từ Sau đó, tiến hành biến nạp phương pháp sốc nhiệt vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lượng lớn Kết biến nạp vào E coli DH5α có nhiều khuẩn lạc sống sót mơi trường có kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l, chứng tỏ việc biến nạp thành công Kết kiểm tra vector tái tổ hợp phản ứng colony-PCR Chúng tiến hành chọn 10 khuẩn lạc riêng rẽ, tròn đều, từ đĩa khuẩn để tiến hành tách plasmid, sau thực phản ứng PCR plasmid với mồi đặc hiệu Kết colony PCR kiểm tra điện di gel agrose (Hình 3.13) cho thấy, 6/10 mẫu plasmid tách chiết từ E coli DH5α biến nạp vector tái tổ hợp pCB301/GmEXP1 cho kết dương tính, xuất băng vạch có kích thước khoảng 768 bp Như Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 45 mẫu plasmid mang cấu trúc pCB301/GmEXP1 sử dụng tốt cho thí nghiệm Từ khuẩn lạc kiểm tra dương tính, chúng tơi tiến hành ni mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l, khuẩn nuôi máy lắc 200 v/p nhiệt độ 370C thời gian 16 Sau 16 tiến hành tách plasmid bảo - 200C để sử dụng biến nạp tiếp vào A tumefaciens làm công cụ chuyển gen ~768bp 750bp Hình 3.13 Hình điện di sản phẩm colony- PCR; Giếng 1-10: dòng khuẩn lạc; M: thang chuẩn kb 3.2.7 Kết tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 Plasmid pCB301/GmEXP1 sau thiết kế thành công biến nạp vào A tumefaciens phương pháp xung điện Đây phương pháp biến nạp có hiệu quả, có thời gian thí nghiệm ngắn Sản phẩm trình biến nạp ni chọn lọc mơi trường LB đặc có Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 chứa 50 mg/l kanamycin 100 mg/l rifamycin, ủ petri đĩa 28 oC thời gian 48 Các dòng khuẩn lạc A tumefaciens tạo nhờ xung điện chứa Ti-plasmid tái tổ hợp phát phương pháp chọn lọc môi trường chứa kháng sinh chọn lọc (kanamycin 50 mg/l 100 mg/l rifamycin) Chỉ có khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp thành công Plasmid pCB301/GmEXP1 sống môi trường chọn lọc Để kết luận chắn dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen, tiến hành kiểm tra phản ứng colony-PCR Chọn ngẫu nhiên dòng khuẩn lạc A tumefaciens mọc đĩa thạch để tiến hành phản ứng colony-PCR cặp mồi đặc hiệu Phản ứng thực với nhiệt độ gắn mồi 560C, lặp lại 30 chu kỳ Sản phẩm phản ứng điện di kiểm tra gel agarose 0,8%, kết thể (Hình 3.14) Kết điện di cho thấy có 6/6 dịng khuẩn lạc lựa chọn cho kết dương tính thực phản ứng PCR với băng có kích thước khoảng 768 bp Với kết PCR đạt tỷ lệ 100%, khẳng định biến nạp thành công vector pCB301/GmEXP1 vào vi khuẩn A tumefaciens Các chủng vi khuẩn 1, 2, 3, 4, 5, phục vụ cho việc chuyển gen vào thực vật 750bp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ~ 768bp http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR; Giếng 1-6: dòng khuẩn lạc; M: thang chuẩn kb 3.3 Kiểm tra hoạt động vector mang cấu trúc GmEXP1 thuốc mơ hình 3.3.1 Kết chuyển cấu trúc GmEXP1 vào thuốc Sau biến nạp thành công vector vào vi khuẩn A tumefaciens, tiếp tục tiến hành chuyển gen GmEXP1 thông qua việc lây nhiễm chủng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 vào tế bào mảnh thuốc Nicotiana tabacum K326 cắt tổn thương cạnh nuôi cấy môi trường cảm ứng GM trước ngày Để chuẩn bị cho việc biến nạp song song với việc nuôi lỏng A tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 đồng thời gây tổn thương mảnh trước hai ngày Sau hai ngày khuẩn nuôi phục hồi mơi trường LB lỏng khơng có kháng sinh, sau tiến hành đo OD đạt số từ 0,6 đến sử dụng khuẩn để tiến hành biến nạp Sau hai ngày đồng ni cấy tối (Hình 3.15.A), chúng tơi tiến hành rửa khuẩn cefotaxim 500 mg/l, cấy chuyển mảnh sang mơi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l BAP mg/l (Hình 3.15.B) Sau 2-3 tuần xuất chồi nhỏ (Hình 3.15.C) Số mảnh sống sót mơi trường chọn lọc kháng sinh 125/150 Từ mảnh lá, tiến hành tách chồi nhỏ cấy lên môi trường MS có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l để nhân nhanh chồi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 Sau 4-5 tuần, thu nhiều chồi từ mảnh cảm ứng tạo mô sẹo, chồi phát triển cao khoảng cm cắt chuyển sang môi trường RM ( MS + sucrose 30g/l + Agar 8g/l + IBA) RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l (Hình 3.15.D) Tỷ lệ chọn lọc sơ mảnh môi trường chọn lọc qua lần biến nạp thể Bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết tạo thuốc chuyển gen GmEXP1 Biến nạp Số mảnh Số mảnh Số mảnh Tổng lá mảnh sống sót sống sót sống sót sau sau sau tuần tuần tuần Số mảnh Số cảm rễ môi ứng tạo trường chồi chọn lọc Lần 50 46 43 40 40 30 Lần 50 45 42 39 37 32 Lần 50 43 40 38 31 30 Tổng 150 134 125 117 108 92 Bảng 3.1 cho thấy số lượng mảnh sống sót mơi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều cho thấy khả mảnh tồn phát triển mô mang tế bào chuyển gen Sau - tuần, có 117/150 mảnh sống sót môi trường chọn lọc qua lần biến nạp Sau – tuần, 92 thuốc chuyển gen hồn chỉnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 tạo thành (Hình 3.15.F) Hình 3.15 mơ tả tồn q trình chuyển gen tạo thuốc mang cấu trúc gen GmEXP1 Hình 3.15 Hình ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào thuốc A: Mảnh sau nhiễm khuẩn cấy môi trường GM B: Mảnh chuyển sang mơi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l C: Các cụm chồi tạo thành sau hai tuần nuôi cấy môi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l D: Các chồi màu xanh tách mơi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50mg/l E: Chồi chuyển gen sau tuần mơi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l 3.3.2 Kết kiểm tra thuốc mang gen GmEXP1 Để kiểm tra có mặt gen chuyển thuốc chuyển gen, tiến hành tách DNA tổng số từ mẫu 22 thuốc chuyển Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 gen GmEXP1 ngẫu nhiên Kết tách DNA tổng số thể (Hình 3.16) Hình 3.16 Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ thuốc lá; Giếng 1-22: mẫu thuốc Kết điện di (Hình 3.16) khẳng định mẫu tách chiết DNA tổng số sử dụng cho phản ứng PCR Để kiểm tra có mặt gen GmEXP1 cây, chúng tơi dùng phương pháp PCR để nhân gen cặp mồi đặc hiệu Phản ứng có nhiệt độ gắn mồi 560C Vì số gen thường so với mẫu vi khuẩn nên phản ứng PCR phải kéo dài hơn, thí nghiệm cho lặp lại phản ứng 40 chu kỳ Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thể hình 3.17 750bp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ~ 768bp http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 Hình 3.17 Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmEXP1 từ thuốc lá; Giếng 1-22: mẫu thuốc lá; M: thang chuẩn kb Kết thể (Hình 3.17) cho thấy, sản phẩm PCR điện di có 22/22 mẫu có sản phẩm PCR, kích thước khoảng 0,77 kb Kích thước hồn toàn phù hợp với chiều dài cấu trúc GmEXP1 gen chuyển Vì vậy, khẳng định gen GmEXP1 chuyển vào thuốc Như vậy, bước đầu thu thuốc chuyển gen mang cấu trúc pCB301/GmEXP1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Đã phân lập đoạn mã hố gen GmEXP1 có kích thước 768 bp từ mRNA đoạn mã hố gen GmEXP1 có sai khác vị trí nucleotit so với trình tự gen GmEXP1 mang mã số AF516879 công bố ngân hàng gen quốc tế 1.2 Thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc pCB301/GmEXP1 biến nạp vào chủng vi khuẩn A Tumefaciens 1.3 Đã tạo thuốc mang gen GmEXP1 phịng thí nghiệm phương pháp chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens Đề nghị 2.1 Tiếp tục phân tích, đánh giá khả phát triển hệ rễ dòng thuốc chuyển gen 2.2 Chuyển gen GmEXP1 vào số giống đậu tương chịu hạn chuyển vào loại trồng có rễ củ làm tăng kích thước rễ củ qua làm tăng giá trị kinh tế loại trồng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả đáp ứng chuyển nạp gen giống đậu tương trồng Việt Nam’’ Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 18, 11-16 Nguyễn Thị Thuý Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam, Luận án tiến sỹ Di truyền học, Đại học Thái Nguyên Trần Đình Long, Đoàn Thanh Nhàn (1995) “Kết nghiên cứu giống đậu tương M103’ Kết nghiên cứu khoa học câu đậu đỗ 1991-1995: 52-56 Trần Thị Phương Liên (2010) Protein tính chống chịu thực vật, NXB Khoa hoc tự nhiên Cơng nghệ: 82-140 Chu Hồng Mậu (2001), Nghiên sử dung phương pháp đột biến thực nghiêm để tạo dịng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng tế bào chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật- nghiên cứu ứng dụng NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 Tài liệu tiếng Anh Ahn J.H., Choi Y., Kim S.G., Kwon Y.M., Choi Y.D., Lee J.S (1998), “Expression of a Soybean Hydroxyproline-Rich Glycoprotein Gene Is Correlated with Maturation of Roots”, Plant Physiol, pp 671 - 679 10.Close T.J.(1997), “Dehydrin: Emergence biochemical role family plant dehydrin proteins’’, Physiologia plantarum, 795-803 11.Cosgrove D J., Li Z C., 1993 Role of expansin in cell enlargement of oat coleoptiles Plant Physiol., 103: 1321-1328 12.Cosgrove D J., 1996 Plant cell enlargement and the action of expansin BioEssays., 18: 533-540 13.Cosgrove D J., 1998 Cell wall loosening by expansin Plant Physiol., 118: 333-339 14.Cosgrove D J., 1999 Enzymes and other agent that enhance cell wall extensibility Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 50: 391-417 15.Cosgrove D J., 2000 Expansinve grouth of plant cell walls Plant Physiol Biochem., 38: 109-124 16.Csonka LN, Gelvin SB, Goodner BW, Orser CS, Siemienak D, and Slightom JL (1988), “Nuleotid sequence of a mutation in the proB gene of Escherichia coli that confers proline overproduction and enhanced tolerance to osmotic stress’’ Gene 64(2): 199-205 17.Dix PJ, (1986) “Plant cell culture culture technology’’ Yeoman M.M (eds), Oxford, Blackwell Scientific Publications 143-201 18 HamiltonIIIEW,HeckathornSA (2001) MitochondrialadaptationstoNaCL com plex I is protected by prolinee and small heat shock proteins, whereas 19.Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumasho T (1994), “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis the boundaries the T-DN’’, The plant Journal 271-181 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 20.Hiroaki Fujii and Jian-Kang Zhu (2009) an auto phosphorylation site of the protein kinase SOS2 is important for salt telerance in Arabidopsis Molecular Plant, doi: 10.1093/mp/ssn087 21.Kam M.J., Yun H S., Kanfman P B., Chang S C., Kim S C., 2005 Two expansin, EXP1 and EXPB2, are correlated with the growth and develomet of maize root J Plant Physiol., 48(3): 304-310 22.Kodym A, Afza R (2003) “Physical and chemical mutagenesis, plant functional genomics Eric Grotewold(Ed.), Humana Press 189-204 23.Lee D.K., Ahn J.H., Song S.K., Choi Y.D., Lee J.S (2003), “expression of an expansin Gene Is Correlated with Root Elongation in Soybean”, Plant Physiology, (131), pp 985 - 997 24.Li Y., Darley C.P., OngaroV., Fleming A., Schipper O., Baldauf S L., McQueen-Mason S J., 2000 Plant expansins are a Complex multigene family with an ancient eVolationary origin J Plant Physiol., 128(3): 854-864 25.Nong V.H., Arahira M., Phan V.C., Kim C.S., Zhang D., Udaka K., Fukazawa C (1997), “Glycine max cct - d gen (cDNA) for group IIchaperonin delta-subunit complete cds”, Genbank/EBI/DDBJ databases, Acc No AB004233 26.SabehatA, LurieS, WeissD (1998) Expression of small heat shock proteins at low temperatures Plant Physiology, 177: 651-658 27.Porcel R, azconR, Rui- Lozano JM (2005), “Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins (LEA D-11) during drought stress in arbuscular mycorrhizal Glycene max and Lactuca sativaplants” Journal of Experimental Botany, 56(417): 1933-42 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 28.Thomashow MF (1998) Role of cold responsive genes in plant freezing tolerance Plant Physiology, 118: 1-7 29.Umezawa T, Yoshida R, Maruyama K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K and Thomashow MF (2004) SRK2C, a SNF1-Related protein kinase 2, improves drought tolerance by controlling stressresponsive gene expression in Arabidopsis thaliana Proceeding of National Academy of Science, 101 (49): 17306-17311 30.Vierling E, Kimpe JA (1992) Plant responses to environmental stress Current Opinion in Biotechnology, 3: 164-170 31.www Vietrade.gov.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... hệ rễ phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen có hệ rễ phát triển, chúng tơi lựa chọn tiến hành đề tài luận văn là: ? ?Thiết kế vector mang cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến phát triển rễ phục vụ chuyển. .. NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN ĐỨC HÀO THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill Chuyên ngành:... Nhân gen GmEXP1 từ cDNA, tách dòng xác định trình tự đoạn mã hố gen GmEXP1 phân lập từ đậu tương; 3.3 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1