Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen crprx phân lập từ cây dừa cạn catharanthus roseus l g don

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––– ĐÀO THỊ NHÂM THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2016 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––– ĐÀO THỊ NHÂM THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN – 2016 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thực hiê ̣n dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, tháng năm 2016 Tác giả Đào Thị Nhâm i Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Bô ̣ môn Di truyề n & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , Ban chủ nhiê ̣m K hoa Sinh học tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn, Ths Hồ Mạnh Tường cán bô ̣ Phòng DNA ứng du ̣ng , Phịng thí nghiệm Trọng điểm C ông nghê ̣ gen , Viê ̣n Công nghê ̣ S inh ho ̣c , Viê ̣n Hàn lâm Khoa ho ̣c và Công nghê ̣ Viê ̣t Nam ta ̣o điề u kiê ̣n và giúp đỡ tiế n hành các thí nghiê ̣m của đề tài luận văn Tôi xin cảm ơn động viên , khích lệ của gia đình bạn bè suốt thời gian ho ̣c tâ ̣p và thực hiê ̣n đề tài luận văn Đề tài luâ ̣n văn th uô ̣c chương triǹ h đào ta ̣o nghiên cứu sinh và cao ho ̣c Bộ môn Di t ruyề n & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , Khoa Sinh học, Trường Đa ̣i ho ̣c Sư phạm - Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên Thái Nguyên, tháng năm 2016 Tác giả Đào Thị Nhâm Số hóa Trung tâm Học liệu – iiĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu dừa cạn 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học dừa cạn 1.1.3 Tác dụng dừa cạn 1.2 Hợp chất alkaloid tác dụng 1.2.1 Alkaloid 1.2.2 Alkaloid dừa cạn 10 1.2.3 Peroxidase gen mã hóa peroxidase 14 1.3 Các nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn 17 1.3.1 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật 17 1.3.2 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp chuyển gen 19 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 22 Số hóa Trung tâm Học liệu –iii ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn 2.1.1 Vật liệu 22 2.1.2 Hóa chất thiết bị 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Thiết kế cặp mồi nhân gen 27 2.2.2 Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số 28 2.2.3 Phương pháp tổng hợp cDNA từ mRNA 28 2.2.4 Nhân gen CrPrx kĩ thuật RT-PCR 29 2.2.5 Phương pháp tinh sản phẩm RT-PCR 30 2.2.6 Kỹ thuật tách dòng gen 31 2.2.7 Phương pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen CrPrx 34 2.2.8 Thiết kế vector chuyển gen mang CrPrx 34 2.2.9 Xử lý số liệu phần mềm chuyên dụng 37 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết phân lập tách dòng gen CrPrx 38 3.1.1 Kết khuếch đại đoạn gen CrPrx từ mRNA 38 3.1.2 Kết ghép nối gen CrPrx vào vector tách dòng 39 3.2 Xác định trình tự gen CrPrx 43 3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx 47 3.3.1 Tạo cấu trúc chứa gen đích CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) 48 3.3.2 Gắn cấu trúc chứa gen CrPrx vào vector pBI121 51 3.4 Tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – iv ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh ABA Abscisic acid A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Tiếng Việt Axit Absisic Bp CaMV 35S Cặp bazơ nitơ base pairs Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter Cộng Cs Gen mã hóa peroidase dừa cạn Cây dừa cạn CrPrx Catharanthus roseus peroxidase C roseus Catharanthus roseus (L.) G Don DAT Deacetylvindoline DNA E coli tranferase Deoxyribonucleic acid Escherichia coli Axit Deoxyribonucleic EDTA ELISA Ethylene diamine tetraacetic acid Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assa Xét nghiệm ELISA IPTG Isopropyl β-D-1Thiogalactopyranoside LB Luria Bertami MCS NptII Multi Cloning Site Neomycin phosphotransferase gene PCR Kb SDS RT-PCR Polymerase chain reaction Kilo base Sodium dodecyl sulphate Reverse transcription - Polymerase Phản ứng chuỗi polymerase -phiên mã ngược X-gal Chain Reaction 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-betaDgalacto-pyranoside 4-O-acetyl Gen DAT Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn Vùng cắt gắn đa vị Phản ứng chuỗi polymerase Vịng/ phút V/p Số hóa Trung tâm Học liệu – iv ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen CrPrx 29 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt thời gian phản ứng RT- PCR nhân gen CrPrx 30 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng gắn gen CrPrx vào vector tách dòng pBT 31 Bảng 2.4: Thành phần môi trường nuôi cấy khuẩn 32 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng colony - PCR 32 Bảng 2.6: Thành phần hoá chất tách plasmid 33 Bảng 2.7: Thành phần cắt vector tái tổ hợp pBT-CrPrx pRTRA7/3 35 Bảng 2.8: Thành phần ghép nối vector pRTRA7/3 gen CrPrx 35 Bảng 2.9: Thành phần phản ứng cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx pBI121 36 Bảng 3.1: Vị trí nucleotide sai khác hai trình tự gen CrPrx LN809932 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – vĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hoa ba giống Catharanthus roseus (L.) G Don Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp vinblastine vincristine 12 Hình 1.3: Cơng thức hóa học vinblastine 13 Hình 1.4: Cơng thức hóa học vincristine 13 Hình 2.1: Vector tách dịng pBT 23 Hình 2.2: Vector pRTRA7/3 23 Hình 2.3: Vector pBI121 23 Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm phân lập thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrPrx 26 Hình 3.1: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn cDNA CrPrx 38 Hình 3.2: Đĩa ni cấy dòng tế bào khả biến E coli DH5 chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen CrPrx 40 Hình 3.3: Kế t quả điê ̣n di sản hẩ p m colony- PCR từ khuẩ n lạc 41 Hình 3.4: Kết điện sản phẩm DNA tinh sau cắt plasmid NcoI/NotI 43 Hình 3.5: So sánh trình tự nucleotid gen CrPrx với trình tự gen mang mã số LN809932 45 Hình 3.6: Sơ đồ thiết kế vector pBI121-CrPrx 47 Hình 3.7: Đoạn DNA đích tinh từ pRTRA7/3 cắt mở vòng NcoI/NotI 49 Hình 3.8: Kết PCR dịng khuẩn lạc từ plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx 50 Hình 3.9: Kết cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx HindIII thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx 52 Hình 3.10: Kết điện di sản phẩm cắt plasmid vector pBI121 53 Hình 3.11: Kết điện di colony-PCR vector tái tổ hợp pBI121-CrPrx 54 Hình 3.12: Kết điện di sản phẩm A.tumefaciens mang vector chuyển gen 55 Số hóa Trung tâm Học liệu – viĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nước ta nước nhiệt đới với điều kiện khí hậu thuận lợi, nguồn tài ngun thiên nhiên phong phú đa dạng Cùng với y học cổ truyền dân tộc có truyền thống lâu đời, nhân dân ta biết sử dụng loài cỏ xung quanh làm nguồn dược liệu để chữa bệnh có hiệu Ngày nay, bên cạnh thuốc tân dược loại dược liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày ưa chuộng Sự thay đổi khí hậu tồn cầu dẫn tới khắc nghiệt thời tiết, mơi trường sống bị nhiễm, thói quen sinh hoạt người thay đổi, thực phẩm khơng an tồn… Những yếu tố tác động đến sức khỏe người, làm gia tăng nguy mắc bệnh, có nguy tế bào bị biến đổi Đây nguyên nhân làm cho số ca mắc bệnh ung thư ngày tăng Vì thế, nhiệm vụ hàng đầu nhà khoa học nghiên cứu, cải tiến biện pháp chữa trị ung thư để nâng cao chất lượng đời sống cho người bệnh Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) có khả sản xuất indol alkaloid có dược tính quan trọng chế tạo loại thuốc chống ung thư, đặc biệt ung thư máu Trong indol alkaloid có mặt dừa cạn, hai loại alkaloid vinblastine, vincristine sử dụng nhiều Nhưng chất lại có hàm lượng nhỏ dừa cạn, khoảng nửa khô chiết 1g vinblastine cho sản xuất dược phẩm (Noble, 1990) [21] Các chất không thể tổng hợp đường hóa học có cấu trúc phức tạp Do vậy, nâng cao hàm lượng vinblastine vincristine dừa cạn theo hướng công nghệ gen hướng nghiên cứu quan tâm nhiều nhà khoa học giới Số hóa Trung tâm Học liệu – 1ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn 3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx Cấu trúc 35S-CrPrx-Cmyc-DKEL cắt enzyme giới hạn từ vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx, sau gắn vào pBI121 cắt mở vòng chuyển vào E coli DH5α Các vector tái tổ hợp tách plasmid kiểm tra cách sử dụng enzyme giới hạn HindIII Gen CrPrx phân lập từ dừa cạn hoa hồng tím đưa vào thiết kế vector gồm trình tự xác định chuỗi peptide tín hiệu (SP) hai vùng chức I II Hình 3.6: Sơ đồ thiết kế vector pBI121-CrPrx Vector pRTRA7/3 sử dụng nghiên cứu có chứa đoạn trình tự quan tâm CaMV35S, Cmyc KDEL CaMV35S promoter mạnh giúp cho gen biểu mạnh Cmyc KDEL thành phần cần thiết để gen chuyển vào Gen CrPrx ghép nối vào vector pRTRA7/3 cắt mở vịng chứa đoạn trình tự cần quan tâm Tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx phục vụ nghiên cứu thiết kế vector mang cấu trúc CrPrx Số hóa Trung tâm Học liệu –47 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn 3.3.1 Tạo cấu trúc chứa gen đích CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) Vector trung gian pRTRA7/3 dùng để cung cấp thành phần cần thiết cho việc biểu kiểm tra gen đích CrPrx tế bào thực vật như: (1) CaMV35S promoter mạnh phân lập từ virus khảm súp lơ, có thể khởi động phiên mã gen chuyển tất tế bào mô thể thực vật; (2) có polyA giúp ổn định cấu trúc phân tử mRNA tế bào chất; (3) đặc biệt pRTRA7/3 cịn cung cấp trình tự xác định chuỗi peptide Cmyc kháng nguyên để có thể dễ dàng xác định có mặt sản phẩm protein đích dùng kháng thể tương ứng Western blot ELISA Dựa vào kích thước gen CrPrx trình bày phần 2.1.1 lựa chọn gel tinh Gen CrPrx cắt enzyme giới hạn NcoI/NotI trình bày phần 3.1.2.3 (hình 3.4) Cắt mở vịng vector pRTRA 7/3 Vector pRTRA7/3 vector trung gian, vector vừa có hai điểm cắt enzyme giới hạn NcoI NotI vừa có trình tự nhận biết HindIII Nhưng gen CrPrx trình bày phần 3.1.2.3 cắt cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI Mục đích bước đưa gen CrPrx vào vector trung gian pRTRA7/3 Vì vậy, pRTRA7/3 bắt buộc phải sử dụng enzyme NcoI/NotI để tạo đầu nối pRTRA7/3 CrPrx Theo tính tốn lý thuyết, sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI NotI cắt vector pRTRA7/3 thu hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 0,9 kb (là đoạn 2SP antiABA khơng sử dụng) 3,3 kb (kích thước vector pRTRA7/3) Trong đó, phân đoạn 3,3 kb đoạn pRTRA7/3 mở vịng mang trình tự cần thu nhận để phát triển vector tái tổ hợp Số hóa Trung tâm Học liệu –48 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn Kết điện di hình 3.7A cho thấy, sau cắt mở vòng pRTRA7/3 enzyme NcoI/NotI thu hai phân đoạn 0,9 kb 3,3 kb lý thuyết Phân đoạn có kích thước 3,3 kb thơi gel để thu nhận cấu trúc mở vịng pRTRA7/3 Sản phẩm mang gel thu nhận băng có kích thước ước tính khoảng 3,3 kb (hình 3.7B), sản phẩm dùng để phục vụ phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx Hình 3.7: Đoạn DNA đích tinh từ pRTRA7/3 cắt mở vòng NcoI/NotI A Sản phẩm điện di plasmid cắt NcoI/NotI (1) Plasmid pRTRA7/3 không xử lý enzyme (đối chứng) (2) Plasmid pRTRA7/3 sau xử lý enzyme NcoI/NotI B Sản phẩm tinh vector pRTRA7/3 sau gel M: Thang DNA 1kb chuẩn; 1: Vector pRTRA7/3 tinh Gắn gen CrPrx vào vector mở vòng pRTRA7/3 Gen CrPrx mang đầu dính cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI gắn vào vector pRTRA7/3 mở vòng nhờ phản ứng ghép nối với xúc tác T4 ligase tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx Vector biến nạp vào Số hóa Trung tâm Học liệu –49 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn tế bào khả biến E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt Sản phẩm biến nạp cấy trải môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicillin Kiểm tra dòng khuẩn lạc phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI Hình 3.8: Kết PCR dòng khuẩn lạc từ plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx M: Thang DNA 1kb chuẩn - 5: Các dòng khuẩn lạc pRTRA7/3-CrPrx Kết điện di kiểm tra cho thấy, dịng khuẩn lạc có dịng (2, 3, 4, 5) xuất băng DNA đặc hiệu khoảng kb tương ứng với kích thước gen CrPrx Như vậy, dòng khuẩn lạc chọn lọc mang plasmid tái tổ hợp mang gen CrPrx Plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx sử dụng để thu nhận cấu trúc mang gen CrPrx phục vụ phát triển vector chuyển gen thực vật Số hóa Trung tâm Học liệu –50 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn 3.3.2 Gắn cấu trúc chứa gen CrPrx vào vector pBI121 Sau tạo cấu trúc gen CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) đầy đủ thành phần cần thiết cho biểu kiểm tra hoạt động gen, việc gắn cấu trúc vào vector chuyển gen phù hợp để có thể biến nạp vào hệ gen thực vật Vector pBI121 lựa chọn mang đặc điểm có điểm cắt enzyme giới hạn phù hợp, bờ trái (LB) bờ phải (RB) có gen kháng kanamycin hoạt động tế bào thực vật nhờ Nos promoter Nos terminator, có điểm khởi động tái oriV vi khuẩn, có gen chọn lọc kháng kanamycin hoạt động vi khuẩn, có operon TrfA mang gen vir đảm nhiệm trình chuyển gen từ vi khuẩn vào hệ gen thực vật số thành phần khác Việc ghép nối cấu trúc gen CrPrx vào vector chuyển gen pBI121 thực phản ứng thu nhận cấu trúc gen CaMV35S-CrPrx-CmycKDEL-polyA enzyme giới hạn từ pRTRA7/3-CrPrx, cắt mở vịng vector pBI121 Sau đó, ghép nối cấu trúc gen CaMV35S-CrPrx-Cmyc-KDEL-polyA vào vector pBI121 mở vòng tạo vector chuyển gen thực vật Thu nhận cấu trúc vector tái tổ hợp chứa gen CrPrx cắt mở vòng pBI121 Cắt đồng thời pRTRA7/3-CrPrx pBI121 enzym cắt giới hạn HindIII Gen CrPrx thành phần CaMV35S, Cmyc, KDEL polyA có kích thước 1844 bp, hai đầu điểm cắt enzyme giới hạn HindIII Xử lý vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx HindIII thu nhận cấu trúc mang gen CrPrx dài 1844 kb phần lại vector pRTRA7/3 dài 2156 bp Điện di sản phẩm cắt agarose (hình 3.10) nhận băng DNA băng có kích thước khoảng 1,8 2,2 kb tương ứng với kích thước tính Số hóa Trung tâm Học liệu –51 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn toán Băng DNA có kích thước khoảng kb tương ứng với kích thước pRTRA7/3-CrPrx Băng có kích thước khoảng 1,8 kb gel tinh để thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx cho bước phát triển vector Hình 3.9: Kết cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx HindIII thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx M: thang chuẩn DNA kb 1: sản phẩm cắt HindIII 2: plasmid khơng cắt HindIII Cắt mở vịng vector pBI121 Vùng MCS vector pBI121 có điểm cắt enzyme HindIII cắt mở vòng sản phẩm cắt tối ưu cho băng vạch khoảng 12 kb Điện di sản phẩm tinh sau cắt mở vòng plasmid pBI121 gel agarose 1% thu băng DNA có kích thước khoảng 12 kb (Hình 3.10) phù Số hóa Trung tâm Học liệu –52 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn hợp với kích thước tính tốn Trên gel điện di xuất băng nhất, khơng có sản phẩm phụ hay trạng thái đứt gãy DNA Sản phẩm DNA tinh đảm bảo sử dụng tốt cho phát triển vector chuyển gen Hình 3.10: Kết điện di sản phẩm cắt plasmid vector pBI121 A Kết điện di sản phẩm plasmid cắt HindIII (1) Plasmid pBI121 không xử lý enzyme (đối chứng) (2) Plasmid pBI121 sau xử lý enzyme hindIII B Kết điện di sản phẩm tinh vector pBI121 sau gel M: Thang DNA 1kb chuẩn 1: Vector pBI121 tinh Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx Ghép nối cấu trúc gen CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) vào pBI121 cách sử dụng T4 ligase để gắn cấu trúc CaMV35S-CrPrx-Cmyc-KDEL-polyA vào plasmid pBI121 mở vòng Sản phẩm tái tổ hợp biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến E.coliDH5α sốc nhiệt, sau cấy trải mơi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin, nuôi 37oC 16 Trên môi trường nuôi cấy sau 16 37oC xuất nhiều khuẩn lạc, dòng khuẩn lạc có thể mang hai plasmid tái tổ hợp pBI121-CrPrx pBI121 tự đóng vịng Thực colony-PCR số Số hóa Trung tâm Học liệu –53 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn khuẩn lạc với cặp mồi Prx-NcoI/Prx-NotI để lựa chọn dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx Hình 3.11: Kết điện di colony-PCR vector tái tổ hợp pBI121-CrPrx M: Thang DNA 1kb chuẩn 1-4: Các dòng khuẩn lạc pBI121-CrPrx (+): Đối chứng dương, (-): Đối chứng âm Kết colony-PCR (Hình 3.11) cho thấy, dịng khuẩn lạc âm tính (khơng xuất băng đặc hiệu) có thể chứa plasmid pBI121 tự đóng vịng, kháng kanamycin khơng mang cấu trúc gen CrPrx Các dòng khuẩn lạc 1, 2, 3, dương tính với phản ứng colony-PCR (xuất băng đặc hiệu khoảng kb) có thể chứa plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen CrPrx Những dòng khuẩn lạc dương tính ni LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc (kanamycin) để tách plsamid nhân dịng vector tái tổ hợp cho q trình biến nạp vào A.tumefaciens phục vụ chuyển gen 3.4 Tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx Plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen CrPrx tách từ sinh khối vi khuẩn E.coli DH5α biến nạp vào A.tumefaciens EHA105 kỹ thuật xung điện Sản phẩm biến nạp sau nuôi phục hồi LB lỏng cấy trải mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l rifamycin 50mg/l nuôi 28oC 48 Sau đó, chọn dịng khuẩn lạc Số hóa Trung tâm Học liệu –54 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn riêng rẽ mọc mặt thạch, tiến hành colony-PCR cặp mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI Kết thu hình 3.12 Hình 3.12: Kết điện di sản phẩm A.tumefaciens mang vector chuyển gen M: Thang DNA 1kb chuẩn 1-7: dòng khuẩn lạc A.tumefaciens EHA105 chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen pBI121-CrPrx (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm Sản phẩm điện di cho thấy, dịng khuẩn dương tính, có kích thước kb với giếng đối chứng dương Giếng đối chứng âm khơng có băng xuất Chứng tỏ dòng A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx Các dịng dương tính ni lỏng LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin rifamycin để thu khối lượng lớn phục vụ chuyển gen Số hóa Trung tâm Học liệu –55 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Phân lập đoạn gen CrPrx có chứa enzyme giới hạn NcoI/NotI Gen CrPrx phân lập từ cDNA vùng mã hóa gồm 993 nucleotide Thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx (35SCrPrx-Cmyc) ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen CrPrx vào thuốc dừa cạn Số hóa Trung tâm Học liệu –56 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn, 2011 “Nghiên cứu tách chiết Alkaloid rễ dừa cạn hoa hồng Bình Định”, Tạp chí KH&CN, Đại học Đà Nẵng, (43), tr 85 – 92 Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (1998), Bài giảng dược liệu, Tập 2, Nhà xuất Đại học Dược Hà Nội, tr 5-24 Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng, 2006, “Ảnh hường chất điều hòa tăng trưởng thực vật đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus”, Tạp chí phát triển Khoa học & Cơng nghệ, ĐHQG HCM, tập 9, số 6, tr 59 – 66 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Nội Viện dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Aerts R.J., Stoker A., Beishuizen M., van de Heuvel M., van der Meijden E., Verpoorte R (1992), “Detrimental effects of Cinchona leaf alkaloids on larvae of the polyphagous insect Spodoptera exigua”, J Chem Ecol, 18:1955–1964 Contin A., van der Heijden R., Lefeber A.W.M., Verpoorte R (1998), “The iridoid glucoside secologanin is derived from the novel triose phosphate/pyruvate pathway in Catharanthus roseus cell culture”, FEBS Lett, 434: 413–416 Costa MM, Hilliou F, Duarte P, Pereira LG, Almeida I, Leech M, Memelink J, Barceló AR, Sottomayor M (2008), “Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus”, Plant Physiol, 146(2): 403-17 Số hóa Trung tâm Học liệu –57 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn Fattorusso, E., Taglialatela, O., (2008) Modern alkaloids: structure, isolation, synthesis and biology Wiley-VCH, Weinheim, Germany 10 Ferreres F., Figueiredo R., Bettencourt S., Carqueijeiro I., Oliveira J., GilIzquierdo A., Pereira D.M., Valentao P., Andrade P.B., Duarte P., Barceló A.R., Sottomayor M (2011), “Identification of phenolic compounds in isolated vacuoles of the medicinal plant Catharanthus roseus and their interraction with vacuator class III peroxidase: an H2O2 affair”, J Exp Bot, 62(8): 2841-2854 11 Furuya T, Kojima H, Syono K, Ishii T, Uotani K (1973), “Isolation of saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng”, Chem Pharm Bull Tokyo, 21(1): 98-101 12 Guggisberg, A., Hesse, M., Alkaloids The University of Zurich 13 Javier Palazn, Rosa M Cusid, Jordi Gonzalo, Mercedes Bonfill, Carmen Morales, M Teresa Pinol (1998), “Relation Between the Amount of rolC Gene Product and Indole Alkaloid Accumulation in Catharanthus roseus Transformed Root Cultures”, Journal of Plant Physiology, 153: 712 14 Jinwei Liu, Jianhua Zhu, Le Tang, Wei Wen, Shuangshuang Lv, Rongmin Yu (2013), “Enhancement of vindoline and vinblastine production in suspension-cultured cells of Catharanthus roseus by artemisinic acid elicitation”, MIRCEN Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, DOI:10.1007/s11274-013-1432 15 Junaid Aslam, Abdul Mujib, Seikh A Nasim, Maheshwar Prasad Sharma (2009), “Screening of vincristine yield in ex vitro and in vitro somatic embryos derived plantlets of Catharanthus roseus L (G) Don”, Scientia Horticulturae, 119(3): 325-329 16 Kumar S, Dutta A, Sinha AK, Sen J (2007), “Cloning, characterization and localization of a novel basic peroxidase gene from Catharanthus roseus”, FEBS J., 274(5): 1290-1303 Số hóa Trung tâm Học liệu –58 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn 17 Kumar S, Jaggi M, Taneja J, Sinha AK, (2011), “Cloning and characterization of two new Class III peroxidase genes from Catharanthus roseus”, Plant Physiol Biochem, 49 (4): 404-412 18 Marfori E.C and Alejar (1993), “Alkaloid yeild variation in callus culture derived from different plant part of the white rosy – purple periwinke, Catharanthus roseus (L.) G Don”, Philippine Journal of Biotechnology, 4(1): 1-8 19 Maria Manuela R Costa, Frederique Hilliou, Patricia Duarte, Luís Gustavo Pereira, Iolanda Almeida, Mark Leech, Johan Memelink , Alfonso Ros Barceló, and Mariana Sottomayor (2008), “Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus”, Plant Physiol, 146(2): 403–417 20 Miyasaka H., Nasu M., and Yoneda K (1999), “Salvia miltiorrhiza: Invitro production of eryptotanshinone and feruginol In: Biotechnology in agricullture and forestry.7, Medicinal and Aromatic Plants II ed By Bajaj YPS Springer-Verlag Berlin”, Heidelberg, 417-430 21 Noble RL (1990), “The discovery of the vinca alkaloids - chemotherapeutic agents against cancer” Biochem Cell Biol, 68(12): 1344-51 22 Pahwa D (2008), Catharanthus alkaloids, B.Pharm Punjab University Chandigarh 23 Pan Q, Chen Y, Wang Q, Yuan F, Xing S, Tian Y, Zhao J, Sun X, Tang K (2010), “Effect of plant growth regulators on the biosynthesis of vinblastine, vindoline and catharanthine in Catharanthus roseus”, Plant Growth Regul, 60(2):133–141 24 Pan Q, Saiman MZ, Mustafa NR, Verpoorte R, Tang K (2016), “A simple and rapid HPLC-DAD method for simultaneously monitoring the accumulation of alkaloids and precursors in different parts and different Số hóa Trung tâm Học liệu –59 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn developmental stages of Catharanthus roseus plants”, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1014: 10-6 25 Pearce H L., Miller M A (2005), “The evolution of cancer research and drug discovery at Lilly Research Laboratories”, Adv Enzyme Regul, 45: 229–255 26 Pietrosiuk A., Furmanowa M., Zobel A., Kuras M., Michalak A (1999), “Cytological changes in meristematic cells of Allium cepa L root tips treated with extracts from callus of Catharanthus roseus (L.) G Don”, Acta Soc Bot Pol, 68: 109 – 118 27 R H F Manske (1979), The alkaloid, Chemistry and physiology 28 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 29 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 30 Sottomayor M., Lopes Cardoso I., Pereira L G., Ros Barcelo A (2004), “Peroxidase and the biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in the medicinal plant Catharanthus roseus (L.) G Don”, Phytochem Rev, 3: 159–171 31 Tarek Kapiel (2010) “Elicitation of alkaloids by biotic and abiotic stress factors in Catharanthus roseus”, Egypt J Bot, Volume 27-29, pp 207-224 32 Tsay H S., Chang W D., Chen C C., and Chang Y S (1994), “The production of imperatorin from Angelica dahurica var formosana by cell suspesion culture”, J Agric Assoc China, 168: 32-48 33 Van der Heijden R., Jabos D., Snoeijer W., Hallard D., Verpoorte R (2004), “The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology”, Curr Med Chem, 11: 607–628 34 Verpoorte R., Van der Heijden R., Moreno P R H (1997), Biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus cells, The Alkaloids, G.A Cordell (Editor) Academic Press, 221–299 Số hóa Trung tâm Học liệu –60 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn 35 Wang Q, Xing S, Pan Q, Yuan F, Zhao J, Tian Y, Chen Y, Wang G, Tang K (2012), “Development of efficient Catharanthus roseus regeneration and transformation system using agrobacterium tumefaciens and hypocotyls as explants”, BMC Biotechnology, 10: 12 – 34 36 Zhao J, Zhu W, Hu Q (2001), “Enhanced catharanthine production in catharanthus roseus cell cultures by combined elicitor treatment in shake flasks and bioreactors”, Enzyme Microb Technol, 28(7-8):673-681 Một số trang web 37 http://en.wikipedia.org/wiki/Catharanthus_roseus Số hóa Trung tâm Học liệu –61 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn ... G Don) ” Mục tiêu nghiên cứu Phân l? ??p đoạn mã hóa cDNA gen CrPrx từ dừa cạn hoa hồng tím Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân l? ??p từ dừa cạn hoa hồng tím, phục vụ chuyển gen. .. alkaloid thiết kế vector phục vụ chuyển gen quan trọng Từ l? ? trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân l? ??p từ dừa cạn (Catharanthus roseus (L. )... trình tự gen CrPrx phân l? ??p từ dừa cạn Việt Nam giới công bố Ngân hàng gen quốc tế 2.2.8 Thiết kế vector chuyển gen mang CrPrx Vector chuyển gen CrPrx thực g? ??m bước bản: (1) phát triển cấu trúc