TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DEACETYL VINDOLINE 4-O-ACETYLTRASFERASE (DAT) THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC Tên đề tài TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DEACETYL VINDOLINE 4-O-ACETYLTRASFERASE (DAT) THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) Mã số: ĐH2016 – TN05-04 Chủ nhiệm đề tài: ThS Bùi Thị Hà THÁI NGUYÊN, 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC Tên đề tài TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DEACETYL VINDOLINE 4-O-ACETYLTRASFERASE (DAT) THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) Mã số: ĐH2016 – TN05-04 Xác nhận tổ chức chủ trì Chủ nhiệm đề tài (ký, ghi rõ họ tên) ThS Bùi Thị Hà THÁI NGUYÊN, 2018 i DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI I Danh sách thành viên STT Họ tên Nguyễn Thị Tâm Nguyễn Thu Hiền Nguyễn Huy Hồng Đơn vị cơng tác Khoa sinh học, ĐH Sư phạm Thái Nguyên Bộ môn Sinh học, ĐH Y Dược Thái Nguyên Bộ môn Sinh học, ĐH Y Dược Thái Nguyên II Đơn vị phối hợp thực Khoa sinh học, Trường ĐH Sư phạm, ĐH Thái Nguyên Bộ môn Sinh học, ĐH Y Dược Thái Nguyên Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ii MỤC LỤC Trang MỤC LỤC ii DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN 1.1.1 Vai trò alkaloid thực vật 1.1.2 Alkaloid dừa cạn 1.2 SINH TỔNG HỢP ALKALOID VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME DAT Ở CÂY DỪA CẠN .10 1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp alkaloid dừa cạn 10 1.2.2 Hoạt động enzyme DAT gen DAT 17 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Vật liệu thực vật .19 2.1.2 Chủng vi khuẩn loại vector .19 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .19 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Các phương pháp sinh học phân tử 20 2.3.2 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT 24 2.3.3 Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào thuốc 28 iii 2.3.4 Phương pháp phân tích chuyển gen .29 2.3.5 Phương pháp tính hiệu suất chuyển gen .31 2.3.6 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu 31 3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN CrDAT PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN .32 3.1.1 Kết tách dòng xác định trình tự nucleotide gen CrDAT 32 3.1.2 So sánh trình tự nucleotite gen CrDAT 34 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CrDAT 39 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDATError! Bookmark not 3.2.2 Phân tích biểu gen CrDAT thuốc chuyển gen .44 3.2.3 Thảo luận kết thiết kế đánh giá hoạt động vector chuyển gen pBI121-CrDAT 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 Kết luận 54 Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 64 iv DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 35S Promoter CaMV 35S bp DNA base pair Deoxyribonucleic acid Cặp bazơ nitơ cDNA Complementary DNA DNA bổ sung DAT Deacetyl vindoline 4-Oacetyltransferase Gen DAT DEPC Diethyl pyrocarbonate dNTP Deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige Skoog Tên gọi đặt cho môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật mRNA Messenger ribonucleic acid NptII Neomycyn phosphatranferaseII PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid rCrDAT Recombinant CrDAT protein SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Gen kháng kanamycine Phản ứng chuỗi polymerase Protein DAT tái tổ hợp v Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase T-DNA Transfer DNA TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine WT Wild type X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galacto-pyranoside Đoạn DNA chuyển vào thực vật Cây không chuyển gen vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR .21 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen CrDAT vào vector tách dòng 22 Bảng 2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn 23 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt DNA BamHI .24 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid NotI/ NcoI 26 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid HindIII 26 Bảng 3.1 Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide gen CrDAT .35 Bảng 3.2 Các vi ̣tri ́ sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn protein DAT ở mẫu dừa cạn TN1, TN2 protein mang mã số AAC99311 Ngân hàng Gen .38 Bảng 3.3 Kết biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào thuốc 46 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Hoa ba giống Catharanthus roseus Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn đường sinh tổng hợp terpenoid indole alkaloid (TIA) 12 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo vinblastine vincristine 16 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrDAT 25 Hinh ̀ 3.1 Kết điêṇ di kiểm tra sản phẩ m PCR nhân gen CrDAT 32 Hình 3.2 Tri nh ̀ tự nucleotide của gen CrDAT phân lâ ̣p từ dừa ca ̣n mẫu TN1, TN2 và tri nh ̀ tự mang mã số AF053307 Ngân hàng gen quốc tế 36 Hình 3.3 Tri nh ̀ tự amino acid suy diễn gen CrDAT từ hai mẫu dừa cạn TN1, TN2 và của protein mang mã số AAC99311 Ngân hàng Gen 37 Hình 3.4 Kết cắt vector tách dòng tái tổ hợp pBT-CrDAT với cặp enzyme giới hạn NcoI NotI 40 Hình 3.5 Kết cắt mở vòng vector pRTRA7/3 41 Hình 3.6 Kết tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrDAT 42 Hình 3.7 Kết tạo vector chuyển gen pBI121- CrDAT .43 Hình 3.8 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT kết điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR 44 Hình 3.9 Hình ảnh mơ tả q trình biến nạp, chọn lọc tái sinh tạo thuốc chuyển gen 45 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen CrDAT thuốc chuyển gen đối chứng .47 Hình 3.11 Kết phân tích Southern blot dòng thuốc chuyển gen CrDAT .48 viii Hình 3.12 Kết phân tích Western blot dòng thuốc chuyển gen CrDAT 50 53 khoảng 51,5 kDa kiểm tra Western blot Từ kết cung cấp thông tin rõ ràng hoạt động gen CrDAT liên quan đến nhân tố phiên mã trans yếu tố cis promoter vai trò biểu protein CrDAT mô tế bào cụ thể thực vật Tuy nhiên, yếu tố cis nhân tố trans có vai trò cụ thể với biểu gen CrDAT thực vật chuyển gen cần tiếp phân tích làm sáng tỏ Cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc chuyển thành công vào mô thuốc N tabacum K326 nhờ A tumefaciens, tạo thuốc chuyển gen Sự có mặt hợp gen chuyển CrDAT vào hệ gen thuốc chuyển gen kiểm tra PCR Southern blot Protein tái tổ hợp CrDAT có trọng lượng phân tử khoảng 51 kDa biểu dòng thuốc chuyển gen Kết biến nạp đánh giá hoạt động cấu trúc 35SCrDAT-cmyc thuốc chuyển gen sở cho viêc̣ điều khiển biểu mạnh gen CrDAT dừa cạn, ta ̣o dòng dừa cạn chuyển gen có hàm lượng vincristine vinblastine cải thiện 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Gen CrDAT phân lập từ dừa cạn tách dòng phân tử xác định trình tự nucleotide Gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320 bp, mã hóa cho 439 amino acid 1.2 Vector chuyển gen thực vâ ̣t pBI121-CrDAT thiết kế chuyển vào hệ gen thuốc dừa cạn chuyển gen biểu protein tái tổ hợp CrDAT có kích thước khoảng 51 kDa 1.3 Môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 10 g/l; BAP 1,0 mg/l IBA 0,6 mg/l; nước dừa 100 ml/l; pH = 5,8 thích hợp cho phát sinh chồi sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 10 g/l; BAP 0,5 mg/l IBA 0,4 mg/l; nước dừa 100 ml/l; pH = 5,8, thích hợp cho phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm Đề nghị Tiếp tu ̣c chuyển gen DAT vào dừa cạn phân tích dừa cạn chuyển gen nhằm tạo hệ T2,T3 có hàm lượng alkaloid cao 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội Chu Hoàng Mâ ̣u (2008), Phương pháp phân tích di truyề n hiê ̣n đại chọn giố ng trồ ng, Nxb Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên Vương Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cường, Phan Thị Mỵ Lan (2012), Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen gus vào phơi trưởng thành gia đình Thơng nhựa vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Kết nghiên cứu Khoa học công nghệ lâm nghiệp giai đoạn 2006-2010, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tr 60 - 66 Tài liệu Tiếng Anh Allen G J., Murata Y., Chu S P., Nafisi M., Schoeder J I (2002), “Hypersensitivity of abscisic acid-induced cytosolic calcium increases in the Arabidopsis farnesyltransferase mutant era1-2”, Plant Cell, 14(7), pp 1649 1662 Arcuri H A., Zafalon G F D., Marucci E A., Bonalumi C E., Da Silviera N J F., Machado J M., De Azevedo W F., Palma M S (2010), “SKP DB: a structural database of shikimate pathway enzymes”, BMC Bioinformatics, Jan 7, pp 11:12 doi: 10.1186/1471-2105-11-12 Benoid St-Pierre, Pierre Laflamme, Anne-Marie Alarco and Vincenzo De Luca (1998), “The terminal O-acetyltransferase involved in vindoline biosynthesis defines a new class of proteins responsible for coenzyme Adependent acyl transfer”, The Plant Journal, 14(6), pp 703 - 713 56 Bernays E A (1982), The insect on a plant- A closer look in: insect-plant Relationships, Wageningen, pp – 17 Brown R L., Kazan K., McGrath K C., Maclean D J., Manners J M (2003), “A role for the GCC-box in jasmonate-mediated activation of the PDF1.2 gen of Arabidopsis”, Plant Physiology, 132, pp 1020 – 1032 Canel C., Lopes-Cardoso M I., Whitmer S., van der Fits L., Pasquali G., van der Heijden R., Hoge J H C., Verpoorte R (1998), "Effects of overexpression of strictosidine synthase and tryptophan decarboxylase on alkaloid production by cell cultures of Catharanthus roseus", Planta, 205 (3), pp 414 – 419 10 Collu G., Unver N., Peltenburg-Looman A M G., van der Heijden R., Verpoorte R., Memelink J (2001), "Geraniol 10-hydroxylase, a cytochrome P450 enzyme involved in terpenoid indole alkaloid biosynthesis", FEBS Letters, 16: 508(2), pp 215 – 220 11 Costa M M R., Hilliou F., Duarte P., Pereira L G., Almeida I., Leech M., Memelink J., Barcelo A R., Sottomayor M (2008), "Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus", Plant Physiology, 146, pp 403 – 417 12 Choi P S., Kim Y D., Choi K M., Chung H J., Choi D W., Liu J (2004), " Plant regenration from hairy-root cultures transformed by infection with Agrobacterium rhizogenes in Catharanthus roseus", Plant Cell Reports, 22(11), pp 828 – 831 13 Dao Xuan Tan, Ho Manh Tuong, Vu Thi Thu Thuy, Le Van Son, and Chu Hoang Mau (2015), "Cloning and overexpression of GmDREB2 gen from Vietnamese drought-resistant soybean variety", Brazilian Archives Biology and Technology, 58 (5), pp 651 - 657 57 14 De Luca V., Balsevich J., Tyler R T., Eilert U., Panchuk B D., Kurz W G W (1986), "Biosynthesis of indole alkaloids: developmental regulation of the biosynthetic pathway from tabersonine to vindoline in Catharanthus roseus", Journal of Plant Physiology, 125(1-2), pp 147 – 156 15 De Luca V., Cutler A J (1987), "Subcellular localization of enzymes involved in indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus", Plant Physiology, 85(4), pp.1099 – 1102 16 De Waal A., Meijer A H., Verpoorte R (1995), "Strictosidine synthase from Catharanthus roseus: purification and characterization of multiple forms", Biochemical Journal, 306 (2), pp 571 – 580 17 Ferlay, I Soerjomataram, R Dikshit, S Eser, C Mathers, M Rebelo, D M Parkin, D Forman, F Bray (2014), “Globocan, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012”, International Journal of Cancer, 136(5), doi:10.1002/ijc.29210 PMID:25220842 18 Finer K R., Finer J J., (2000), "Use of Agrobacterium expressing green fluorescent protein to evaluate colonization of sonication-assisted Agrobacteriummediated transformation-treated soybean cotyledons", Letters in Applled Microbiology, 30, pp 406 – 410 19 Global Burden of Disease Study 2015 provides GPS for global health 2030 (GBD) Collaborators (630) (2016), "Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015", Lancet, 388 (10053), pp 1545 – 1602 20 Gajalakshmi S., Vijayalakshmi S., and Rajeswari V (2013), "Pharmacological activities of catharanthus roseus: A perspective review", Internaltional Joural of Phama Bio Sciences, 4(2), pp 431 – 439 58 21 Goddijin O J M., De Kam R J., Zanetti A., Schilperoort R A., Hoge J H.C (1992), "Auxin rapidly down-regulates transcription of the tryptophan decarboxylase gen from Catharanthus roseus", Plant Molecular Biology, 18(6), pp 1113 – 1120 22 Guillon S., Gantet P., Trémouillaux-Guiller J., Thiersault M., Rideau M (2008), Hairy Roots of Catharanthus roseus: Efficient routes to monomeric indole alkaloid, Bioactive Molecules and Mdicinal Plants, pp 285 – 295 23 Hernandez-Dominguez E., Campos-Tamayo F., Vazquez-Flota F (2004), "Vindoline synthesis in vitro shoot cultures of Catharanthus roseus", Biotechnology Letters, 26(8), pp 671 – 674 24 Hughes E., Hong S., Gibson S., Shanks J., San K., (2004), "Metabolic engineering of the indole pathway in Catharanthus roseus hairy roots and increased accumulation of tryptamine and serpentine", Metabolic Engineering, 6(4), pp 268 – 276 25 Knaggs A R (2001), "The biosynthesis of shikimate metabolites", Natural Product Reports, 18(3), pp 334 - 355 26 Kumar S., Dutta A., Sinha A K., Sen J (2007), “Cloning characterization and localization of a novel basic peroxidase gen from Catharanthus roseus”, FEBS Journal, 274(5), pp 1290 – 1303 27 Laflamme P., St Pierre B., De Luca V (2001), “Molecular and biochemical analysis of a Madagascar periwinkle root - specific minovincinine – 19 hydroxy-O-acetyltransferase, Plant Physiology, 125, pp 189 – 198 28 Levac D., Murata J., Kim W S., De Luca V (2008), “Application of carborundum abrasion for investigating leaf epidermis: molecular cloning of Catharanthus roseus 16-hydroxy-tabersonine-16-Omethyltransferase”, Plant Journal, 53(2), pp 225 – 236 59 29 Lo Thi Mai Thu, Vi Thi Xuan Thuy, Le Hoang Duc, Le Van Son, Chu Hoang Ha, Chu Hoang Mau (2016), “RNAi-mediated resistance to SMV and BYMV in transgenic tobacco”, Crop Breeding and Applied Biotechnology, 6, pp 213 218 30 Magnotta M, Murata J, Chen J, De Luca V (2006), Identification of a low vindoline accumulating cultivar of Catharanthus roseus (L.) G Don by alkaloid and enzymatic profiling, Phytochemistry, 67, pp 1758 – 1764 31 Magnotta M, Murata J, Chen J, De Luca V (2007), Expression of deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase in Catharanthus roseus hairy roots, Phytochemistry, 68(14), pp 1922-1931.doi:10.1016/j.phytochem 2007.04.037 32 Meehan T.D., Coscia C.J (1973), Hydroxylation of geraniol and nerol by a monooxygenase from Vinca rosea, Biochemistry Biophys Res Commun 53, pp 1043 – 1048 33 Mei-Liang Zhou, Xue-Mei Zhu, Ji-JongShao, Yan-Min Wu, Yi-Xiong Tang (2012), An protocol for gentic transformation of catharanthus roseus by Agrobacterium rhizogenes A4, Appl Biochemistry Biotechnology, 166(7), pp 1674 - 1684 34 Nisa Nur Iskandar and Iriawati (2016), “Vinblastine and Vincristine Production on Madagascar Periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G Don) Callus Culture Treated with Polethylene Glycol”, Makara Journal of Science, 20/1, pp - 16 doi: 10.7454/mss.v20i1.5656 35 Noé W., Mollenschott C., Berlin J (1984), “Tryptophan decarboxylase from Catharanthus roseus cell suspension cultures: purification, molecular and kinetic data of the homogenous protein”, Plant Molecular Biology 3(5), pp 281 – 288 60 36 Nowacki E and Wezyk S., (1960), “Preliminary reseach on lupin alkaloid Toxicity for Rabbit organism”, Rozniki Nauk Rolinkzych, pp 75 - 383 37 O’Keefe B R., Mahady G B., Gills J J., Beecher C W W (1997), “Stable vindoline production in transformed cell cultures of Catharanthus roseus”, Journal of Natural Products 60(3), pp 261 – 264 38 Pahwa D (2008), Catharanthus alkaloids, B Pharm Punjab University Chandigarh 39 Peebles C A., Sander G W., Hughes E H., Peacock R., Shanks J V., San K Y (2011), “The expression of 1-deoxy-D-xylulose synthase and geraniol-10-hydroxylase or anthranilate synthase increases terpenoid indole alkaloid accumulation in Catharanthus roseus hairy roots”, Metabolic England, 13(2), pp 234 – 240 40 Qifang Pan , Quan Wang., Fang Yuan., Shihai Xing., Jingya Zhao., Young Hae Choi., Robert Verpoorte., Yuesheng Tian., Guofeng Wang and Kexuan T ang (2012), “Overexpression of ORCA3 and G10H in Catharanthus roseus P lants Regulated Alkaloid Biosynthesis and Metabolism Revealed by NMRMetabolomics”, BMC Biotechnology, 7(8), pp 12 - 34 doi: 10.1186/14726750 41 Roepke J., Salim V., Wu M., Thamm A M K., Murata J., Ploss K., Boland W., De Luca V (2010), “Vinca drug components accumulate exclusively in leaf exudates of Madagascar periwinkle”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(34), pp 15287 – 15292 42 Russo P., Frustaci A., Del Bufalo A., Fini M., Cesario A (2013), “Multitarget drugs of plants origin acting on Alzheimer's disease”, Current Medicinal Chemistry, 20 (13), pp 1686 - 1693 61 43 Sambrook J., Russell D W., (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual NeW York, Cold Sping Harbor Laboratory Press 44 Santarém ER., Trick HN., Essig JS., Finer JJ (1998), “Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons: optimization of transient expression”, Plant Cell Reports, 17 (10), pp 752 – 759 45 Southern EM (1975), “Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, Journal of molecular Biology, 98(3), pp 503 517 46 St-Pierre B., De Luca V (1995), “A Cytochrome P-450 Monooxygenase Catalyzes the First Step in the Conversion of Tabersonine to Vindoline in Catharanthus roseus”, Plant Physiology 109(1), pp 131 - 139 47 St-Pierre B., Laflamme P., Alarco AM., De Luca V (1998), “The terminal Oacetyltransferase involved in vindoline biosynthesis defines a new class of proteins responsible for coenzyme A dependent acyl transfer”, Plant Journal 14(6), pp 703 – 713 48 St-Pierre B., Vazquez-Flota compartmentation of FA., Catharanthus De Luca roseus V alkaloid (1999), “Multicellular biosynthesis predicts intercellular translocation of a pathway intermediate”, Plant Cell 11(5), pp 887 – 900 49 Stevens LH., Blom TJM., Verpoorte R (1993), “Subcellular localization of tryptophan decarboxylase, strictosidine synthase and strictosidine glucosidase in suspension cultured cells of Catharanthus roseus and Tabernaemontana divaricata”, Plant Cell Reports, 12(10), pp 573 – 576 50 Shukla AK., Shasany AK., Verma RK., Gupta MM., Mathur AK., Khanuja SPS (2010), “Influence of cellular differentiation and licitation on 62 intermediate and late steps of terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus”, Protoplasma 242, pp 35 – 47 51 Sun HJ., Cui ML., Ma B., Ezura H (2006), “Functional expression of the tastemodifying protein, miraculin, in transgenic lettuce”, FEBS Letters, 580 (2), pp 620 - 626 52 Topping J F., Foster G D., Taylor S C (1998), “Plant virology protocols, from virus isolation to transgenic resistance”, Human Press, Totowa, 81, pp 365 480 53 Vancanneyt G., Schmidt R., Connor-Sanchez AO., Willmitzer L., Sosa MR (1990), “Contruction of an intron-containing maker gen: Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agobacterium-mediated plants transformation”, Molecular Gen gent, 220, pp 245 - 250 54 Van der Heijden R., Jabos DJ., Snoeijer W., Hallard D., Verpoorte R (2004), “The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology”, Current medicinal chemistry 11(5), pp 607 – 628 55 Vázquez - Flota F., Vincenzo De Luca V (1998), “Jasmonate modulates development and light regulated alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus”, Phytochemistry 49(2), pp 395 – 402 56 Vázquez - Flota FA., St-Pierre B., De Luca V (2000), “Light activation of vindoline biosynthesis does not require cytomorphogensis in Catharanthus roseus seedlings”, Phytochemistry 55(6), pp 531 – 536 57 Vázquez - Flota F., De Luca V., Carrillo - Pech M., Canto - Flick A., de Lourde M - Ham M (2002), “Vindoline biosynthesis is transcriptionally blocked in Catharanthus roseus cell suspension cultures”, Molecular Biotechnology 22(1) 63 58 Verma P., Mathur AK (2011a), “Direct shoot bud organogensis and plant regenration from leaf explants in Catharanthus roseus Plant Cell”, Tissue and Organ Culture 106(3), pp 401 – 408 59 Wang Q., Yuan F., Pan Q., Li M., Wang G., Zhao J., Tang K (2010), “Isolation and functional analysis of the Catharanthus roseus deacetylvindoline-4-Oacetyltransferase gen promoter”, Plant Cell Reports, 29(2), pp 185 - 192 60 Zárate R., Verpoorte R (2007), “Strategies for the gentic modification of the medicinal plant Catharanthus roseus (L.) G Don”, Phytochemistry Reviews 6(2-3), pp 475 - 491 61 Woolley JG (2001), Plant Alkaloids, Encyclopedia of life science Nature Publishing Group / www.els.net (11 peges) Trang web 62 http://www.chm.bris.ac.uk/webprojects2002/jjones/Content/vincristine.htm 64 PHỤ LỤC Phụ lục Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng nghiên cứu P1.1 Sơ đồ cấu trúc vector tách dòng pBT P1.2 Sơ đồ cấu trúc vector pCB-gusplus 65 P1.3 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pRTRA7/3 P1.4 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121 66 Phụ lục Thành phần môi trường sử dụng nuôi cấy in vitro chuyển gen P2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy in vitro thuốc Môi trường Thành phần Nảy mầm MS1(20ml/l) + MS2 (20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) + (MS) MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + sucrose (30g/l); pH=5,8 Cảm ứng MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS 3(5ml/l) + MS 4(5ml/l) + tạo chồi MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + sucrose (30g/l) + BAP (0,001g/l); (GM1) pH=5,8 Cảm ứng MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS 3(5ml/l) + MS 4(5ml/l) + tạo chồi MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + sucrose (30g/l) + BAP (0,001g/l) (GM2) Kéo dài chồi (GM3) + Kanamycin 0,05g/l + cefortaxime 0,4g/l; pH=5,8 MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS 4(5ml/l) + MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + sucrose (30g/l) + BAP (0,001g/l) + Kanamycin 0,05g/l + cefotaxime 0,4g/l; pH=5,8 MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS 3(5ml/l) + MS 4(5ml/l) + Ra rễ (RM1) MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + mannose (30g/l) + IBA 0,0001g/l + Kanamycin 0,05g/l + cefotaxime 0,25 g/l; pH=5,8 Ra rễ (RM2) MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS 3(5ml/l) + MS 4(5ml/l) + MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + sucrose (30g/l) + IBA 0,0001g/l + Kanamycin 0,05g/l + cefotaxime 0,25 g/l; pH=5,8 67 * Ghi chú: Các môi trường chuẩn pH = 5,8 khử trùng Thí nghiệm tiến hành nhiệt độ 25 ± oC, thời gian chiếu sáng 16 sáng/ngày P2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy in vitro dừa cạn Thành phần Môi trường GM MS + đường sucrose 30 g/l + agar 8,5g/l + than hoạt tính 1g/l + nước dừa 100 ml/l bổ sung BAP 0,5mg/l SIM MS + BAP 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + đường sucrose 30g/l + agar 8,5g/l + than hoạt tính 1g/l + nước dừa 100ml/l SEM MS + IBA 0,2 mg/l + đường sucrose 30 g/l + agar 8,5g/l + than hoạt tính1g/l RM MS + IBA 0,2 mg/l + đường sucrose 30 g/l + agar 8,5g/l + than hoạt tính1g/l ... HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC Tên đề tài TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DEACETYL VINDOLINE 4-O-ACETYLTRASFERASE (DAT) THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID... thước 1383 bp (Bảng 2.1) 2.3.1.2 Phân lập gen 21 Tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA RNA tổng số tách chiết Trizol Reagent Kit cDNA tổng hợp theo quy trình Maxima® First Strand cDNA Synthesis Kit... 37 Hình 3.4 Kết cắt vector tách dòng tái tổ hợp pBT-CrDAT với cặp enzyme giới hạn NcoI NotI 40 Hình 3.5 Kết cắt mở vòng vector pRTRA7/3 41 Hình 3.6 Kết tạo vector tái tổ