phân lập gen ORCA3 liên quan đến sự tổng hợp alkaloid từ cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TRẦN THỊ THANH HƢƠNG PHÂN LẬP GEN ORCA3 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don) LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC - 8/ 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TRẦN THỊ THANH HƢƠNG PHÂN LẬP GEN ORCA3 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC - 8/ 2014 i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN . Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2014 Tác giả Trần Thị Thanh Hƣơng ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. . . - - . Tác giả Trần Thị Thanh Hƣơng iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ORF: Open read frame ORCAs: Octadecanoid - responsive Catharanthus AP2/ERF domain MIA: Monoterpenoid indole alkaloids DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid TIA: Terpenoid indole alkaloids FDA: Food and Drug Administration JA: Jasmonic acid MeJA: Methyl ester jasmonic acid JRE: Jasmonate responsive element ERF: Ethylene response factor PCR: Polymerase chain reaction iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Những chữ viết tắt iii Mục lục iv Danh mục các bảng trong luận văn vi Danh mục các hình trong luận văn vii MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. CÂY DỪA CẠN 3 1.1.1. Giới thiệu chung 3 4 1.2. NGHIÊN CỨU ALKALOID Ở THỰC VẬT VÀ Ở CÂY DỪA CẠN 5 1.2.1. Alkaloid ở thực vật 5 1.2.1.1. Trạng thái thiên nhiên 5 1.2.1.2. Sự phân bố. 5 6 6 1.2.2. Alkaloid ở cây dừa cạn 8 1.2.2.1. Các vinca alkaloid chính 8 1.2.2.2. Một số gen chức năng liên quan đến quá trình tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn 11 1.2.2.3. A 12 3 16 1.3.1. ORCA3 16 1.3.1.1. Con đƣờng sinh tổng hợp TIA 17 1.3.1.2. Cơ chế điều khiển của ORCA3 19 v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.3.1.3. Cấu trúc protein ORCA3 21 3 22 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 27 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 27 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 27 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1. Phƣơng pháp thu mẫu 27 2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 27 2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết mRNA 27 28 2.2.2.3. Phƣơng pháp nhân gen ORCA3 bằng kĩ thuật RT-PCR 28 2.2.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen 29 3 31 31 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 DỪA ÊN 32 ORCA3 32 3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen ORCA3 từ mRNA 33 3.1.3. Kết quả tách dòng đoạn gen ORCA3 34 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen ORCA3 28 Bảng 2.2. Thành phần ph 29 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony – PCR 30 Bảng 3.1. Cặp mồi nhân gen ORCA3 33 Bảng 3.2. ORCA3 37 Bảng 3.3. Tỷ lệ và số lƣợng từng loại amino acid 1 39 Bảng 3.4. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid 96899, ABW77571 40 vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sinh tổng hợp vinca alkaloid 10 Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp TIA ở dừa cạn 19 Hình 1.3. Mô hình biểu hiện gen STR đƣợc cảm ứng bởi JA thông qua yếu tố phiên mã ORCA3 ở cây dừa cạn 20 Hình 1.4. Tổng quan về các phân tử tín hiệu thực vật 21 3.1. (TN1) 33 3.2. - 35 Hình 3.3. .36 Hình 3.4. Thái Nguyê 38 Hình 3.5. Vùng AP-2 của protein ORCA3 bám DNA 41 viii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, cả thế giới đang phải đối mặt với bệnh ung thƣ, một căn bệnh đang trở thành hiểm họa cho cuộc sống chúng ta và có xu hƣớng ngày càng gia tăng. Theo thống kê, thế giới sẽ có 21,4 triệu ngƣời đƣợc phát hiện mới mắc bệnh ung thƣ và hơn 13,2 triệu ngƣời chết vì căn bệnh này vào năm 2030. Tỷ lệ này sẽ có nguy cơ tăng dần so với thời gian. Trong khi đó, các loại thuốc chữa trị ung thƣ chƣa nhiều và giá thành của chúng khá đắt. Xu hƣớng của thế giới hiện nay là nghiên cứu phƣơng pháp . Thực vật bậc cao đƣợc coi là nguồn nguyên liệu quý giá có thể cung cấp các hợp chất thứ cấp, đặc biệt là các alkaloid. Những chất này đóng vai trò quan trọng đối với ngành công nghiệp dƣợc phẩm trong việc sản xuất các loại thuốc có giá trị, trong số đó quan trọng nhất là nhóm dƣợc phẩm điều trị ung thƣ. Trong những năm gần đây, tình hình nghiên cứu về hợp chất thứ cấp thực vật ngày càng phát triển. Các hợp chất thứ cấp đƣợc chiết xuất từ thực vật có hoạt tính và rất có giá trị đối với cuộc sống. Một số hợp chất thuộc các nhóm alkaloid, terpenoid, phenolic, saponin đƣợc biết đến nhƣ là các hợp chất có khả năng trị bệnh ung thƣ. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) là một trong các loại thực vật có khả năng sản xuất các alkaloid - có dƣợc tính quan trọng trong chế tạo thuốc chữa ung thƣ nhƣ vinblastine và vincristine. Các alkaloid này trong cây dừa cạn có hàm lƣợng rất nhỏ (khoảng 1 phần vạn trong lá dừa cạn khô đối với vinblastin còn đối với vincristin thì ít hơn 10 lần nữa) và không thể tổng hợp bằng con đƣờng hóa học do có cấu trúc phức tạp [1]. Do vậy, tiếp cận con đƣờng tổng hợp các alkaloid từ góc độ là một hƣớng nghiên cứu đầy [...]... (Catharanthus roseus L) Các nghiên cứu về gen ORCA3 tập trung vào mối liên quan giữa gen ORCA3 tới quá trình sinh tổng hợp alkaloid trong cây dừa cạn chúng tôi lựa chọn đề tài: Phân lập gen ORCA3 liên quan đến sự tổng hợp alkaloid từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L. ) G Don) 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ORCA3 3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ORCA3 K và tách dòng cDNA của gen ORCA3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu... tố không liên quan Tcyt của promotor của gen cytokin hoặc với đoạn đối mã của gen ORCA3 [16] Tình hình nghiên cứu về gen ORCA3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 24 Pan Q và cộng sự (201 2) đã tiến hành chuyển dòng gen ORCA3 và gen ORCA3 kết hợp với gen G1 0H vào cây dừa cạn Các tác giả đã nhận đƣợc dòng cây chuyển mang gen ORCA3 và cả dòng chuyển gen mang hai gen G1 0H và ORCA3 đều... cấp cũng nhƣ các gen sinh tổng hợp chất trao đổi thứ cấp liên quan đến sự sinh tổng hợp TIA Mặc dù các nghiên cứu trƣớc đó đã chỉ ra rằng sự điều khiển khác biệt của các gen liên quan đến các bƣớc sớm (nhƣ Tdc và Str) và muộn (nhƣ D4H) trong sự sinh tổng hợp vindoline ở cây dừa cạn đều chịu sự kiểm soát của ORCA3 trong các tế bào nuôi cấy huyền phù [6] Sự tổ hợp của các yếu tố phiên mã đáp ứng với jasmonate... [17] Wang và cộng sự (201 0) đã tiến hành chuyển gen G1 0H (gen mã hóa một cytochrome P450 monoxygenase) cùng gen ORCA3 vào cây dừa cạn, sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogene MSU440 Khi phân tích mức độ tích lũy alkaloid đã thể hiện rằng tất cả các dòng chuyển gen đều tích lũy lƣợng catharanthin nhiều hơn, mức tích lũy cao nhất ở dòng OG12 (cao hơn g p 6,5 lần so với dòng không biểu hiện) Xử lí... chức năng liên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 10 quan đến sinh tổng hợp alkaloid đƣợc biết đến ở cây dừa cạn là DAT, PRX, TDC… Gen DAT (deacetylvindoline 4- O-acetyl tranferase) Gen DAT là gen mã hóa cho enzyme tham gia vào sinh tổng hợp vindoline Gen DAT đã đƣợc St-Pierre và cộng sự phân lập và xác định trình tự trên đối tƣợng cây dừa cạn vào năm 1999 với mã số AF053307, gen. .. trình tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn Đối với con ngƣời, alkaloid là nguồn nguyên liệu tự nhiên hữu ích để sản xuất các loại thuốc Cơ chế chính điều khiển sự sinh tổng hợp alkaloid ở tế bào thực vật là kiểm soát sự phiên mã của các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp [29] Rất nhiều nhân tố phiên mã liên quan đến quá trình sinh tổng hợp alkaloid đã đƣợc phân lập và nghiên cứu Một trong số các gen. .. AtERF2 thể hiện sự tƣơng đồng cao với trình tự giàu serin của ORCA3 [20] 1.3.2 Gen ORCA3 ORCA3 Gen ORCA3 Gen ORCA3 3 2, sự biểu hiện quá mức của gen ORCA3 có thể làm tăng cƣờng biểu hiện của các gen sinh tổng hợp các chất trao đổi khác nhƣ CPR, TDC, STR và làm tăng cƣờng tích lũy TIA ở cây dừa cạn [8] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 22 Bằng phƣơng pháp hoạt hóa đoạn g n đuôi T-DNA,... Xử lí với ABA, sự tích lũy catharanthine đạt đến 1,96 mg /g DW ở dòng chuyển gen OG12 [33] Vom Endt D và cộng sự (200 7) sử dụng huyền phù tế bào chuyển gen cây dừa cạn mang gen GUS chứa promotor ORCA3 đã chứng minh rằng sự tích lũy của mRNA ORCA3 cảm ứng MeJA xảy ra ở mức độ phiên mã Bằng thử nghiệm thêm và bớt một đoạn chức năng, tác giả đã định vị đƣợc vùng 74 bp bên trong promotor ORCA3 có chứa JRE... của dừa cạn) là thành viên của nhóm nhân tố phiên mã AP2/ERF ở thực vật, chúng giữ vai trò rất quan trọng trong việc điều khiển thực vật đáp ứng với stress ORCAs đƣợc cảm ứng bởi MeJA và điều khiển sự phiên mã của các gen mã hóa enzyme tham gia vào sinh tổng hợp TIA ở cây dừa cạn [13] 1.3.1.1 Con đường sinh tổng hợp TIA Ở mức độ phân tử, con đƣờng sinh tổng hợp TIA ở cây dừa cạn rất phức tạp, chịu sự. .. [30] Các gen mã hóa cho tiểu phần anpha của AS và DXS (các enzyme có liên quan trong con đƣờng chuyển hóa sơ cấp dẫn đến sinh tổng hợp các tiền chất của TIA) đƣợc cảm ứng bởi sự biểu hiện quá mức của gen ORCA3, trong khi hai gen chuyển hóa sơ cấp khác không liên quan đến sự tạo thành tiền chất sơ cấp của TIA (Ggpps và Ics) lại không chịu sự kiểm soát của ORCA3 Các kết quả này chứng tỏ rằng ORCA3 là