3
1.3.1.3. Cấu trúc protein ORCA3
ORCA3 là thành viên của phân họ AP2/ERF của protein vùng AP2 với một vùng AP2 đơn, trong khi phân họ AP2 có tới 2 vùng AP2. Hơn nữa trình tự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
acid amin của vùng AP2 và vùng AP2/ERF khá khác nhau. Khi ORCA3 liên kết với một số protein dạng AP2/ERF ở một số loài thực vật khác, ngƣời ta đã nhận thấy một mức độ tƣơng đồng cao bên trong vùng AP2/ERF. ORCA3 hình thành nên phân nhóm của protein vùng AP2/ERF có một đầu tận C bảo thủ với khoảng 20 amino acid [17].
Nghiên cứu đặc tính chức năng của các vùng khác nhau trong protein
ORCA3 ở nấm men và tế bào thực vật cho thấy sự hiện diện của một vùng hoạt hóa đầu tận N có tính acid và vùng tận C giàu serin có chức năng điều hòa tiêu cực. Trong đó, vùng đầu tận N có tính acid hoạt động nhƣ vùng hoạt hóa phiên mã ở cả nấm men và tế bào thực vật, trong khi sự hoạt hóa phiên mã ở các tế bào thực vật lại bị ức chế bởi các nhóm serin định vị ở đầu tận C của protein ORCA3. Nếu loại bỏ 24 amino acid có chứa 11 gốc serin từ đầu tận C của ORCA3 sẽ gây ra sự tăng hoạt hóa trans. Sự tăng cƣờng này gây ra là do sự gia tăng của protein ORCA3 hay sự ổn định của RNA. Ngoài ra, đầu tận của ORCA3
có chứa một vị trí bám cho protein ức chế, vì vậy làm giảm khả năng hoạt hóa của nó. Serin định vị ở đầu tận C của ORCA3 có chứa vị trí phosphorin hóa, vì thế hình thành nên vị trí điều khiển đích. Các vùng giàu serin cũng có mặt ở các vị trí tƣơng tự của các thành viên khác của họ các yếu tố phiên mã vùng AP2/ERF, ví dụ nhƣ AtERF1 và AtERF2 ở Arabidopsis. Đặc biệt là trình tự acid amin của AtERF2 thể hiện sự tƣơng đồng cao với trình tự giàu serin của ORCA3 [20].
1.3.2. Gen ORCA3 ORCA3
Gen ORCA3
Gen ORCA3 3 2, sự
biểu hiện quá mức của gen ORCA3 có thể làm tăng cƣờng biểu hiện của các gen sinh tổng hợp các chất trao đổi khác nhƣ CPR, TDC, STR và làm tăng cƣờng tích lũy TIA ởcây dừa cạn [8].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bằng phƣơng pháp hoạt hóa đoạn gắn đuôi T-DNA, một khung đọc mở (ORF) đã đƣợc xác định vị trí khoảng 600bp của T-DNA mà tạo ra một đoạn protein 203 acid amin với một vùng AP2 bảo thủ. Vùng bám protein này đƣợc tìm thấy trong lớp AP2/EREBP của các yếu tố phiên mã thực vật, rất nhiều trong số đó có liên quan tới việc điều khiển đáp ứng với stress [8].
Gen ORCA3 không chứa intron và sự phối hợp đoạn T-DNA không cảm ứng bất kì một sự tái sắp xếp DNA nào. Sự biểu hiện của ORCA3 đƣợc hoạt hóa bởi đoạn T-DNA. Yếu tố phiên mã đƣợc biểu hiện vƣợt mức và mRNA nội sinh có cùng kích thƣớc, chứng tỏ rằng chiều dài đầy đủ của mRNA và protein đƣợc tạo ra là phù hợp với đoạn gen cấu trúc đƣợc đánh dấu [13].
Yếu tố đáp ứng jasmonate của promotor ORCA3 có chứa một yếu tố đáp ứng jasmonate tự động, bao gồm hai trình tự quan trọng, một trình tự bậc 4 giàu A/T có khả năng đáp ứng với sự biểu hiện ở mức độ cao và một trình tự bậc 4 khác hoạt động nhƣ một công tắc đóng/mở trong đáp ứng với methyljasmonate (MeJA), trình tự bậc 4 này có chứa G-box với một lỗi (AACGTG), thực chất đó là một hộp lai T/G bao gồm một nửa T-box và một nửa G-box. Hộp T/G tƣơng tự cũng đƣợc tìm thấy trong promotor của gen LAP ở cà chua. Hơn nữa, gen VSP1 ở Arabidopsis, cũng chứa G-box với một lỗi, cũng có trình tự tƣơng tự với T/G box của ORCA3. Các G-box có mặt trong vùng promotor đáp ứng với JA của gen VSPB ở đậu tƣơng và gen P I-II của khoai tây [3], [34].
Chất hoạt hóa chính trong biểu hiện của gen ORCA3 đáp ứng với MeJA là yếu tố phiên mã CrMYC2 xoắn lặp lại, gen CrMYC2 đáp ứng với jasmonate trung gian ở giai đoạn sớm. CrMYC2 bám với trình tự bậc 4 trong ORCA3, nó cảm ứng mạnh mức độ tích lũy mRNA của ORCA3 đáp ứng với MeJA [35]. Sự biểu hiện đáp ứng với MeJA của các gen sinh tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn đƣợc kiểm soát bởi một nhân tố phiên mã bao gồm protein bHLH của CrMYC2 điều khiển sự biểu hiện của gen ORCA và các yếu tố phiên mã vùng AP2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ORCA2 và ORCA3, sau đó các nhân tố phiên mã này lại điều khiển tiểu phần của các gen sinh tổng hợp alkaloid [30].
Các gen mã hóa cho tiểu phần anpha của AS và DXS (các enzyme có liên quan trong con đƣờng chuyển hóa sơ cấp dẫn đến sinh tổng hợp các tiền chất của TIA) đƣợc cảm ứng bởi sự biểu hiện quá mức của gen ORCA3, trong khi hai gen chuyển hóa sơ cấp khác không liên quan đến sự tạo thành tiền chất sơ cấp của TIA (Ggpps và Ics) lại không chịu sự kiểm soát của ORCA3. Các kết quả này chứng tỏ rằng ORCA3 là yếu tố điều khiển sơ cấp cũng nhƣ các gen sinh tổng hợp chất trao đổi thứ cấp liên quan đến sự sinh tổng hợp TIA. Mặc dù các nghiên cứu trƣớc đó đã chỉ ra rằng sự điều khiển khác biệt của các gen liên quan đến các bƣớc sớm (nhƣ Tdc và Str) và muộn (nhƣ D4H) trong sự sinh tổng hợp vindoline ở cây dừa cạn đều chịu sự kiểm soát của ORCA3 trong các tế bào nuôi cấy huyền phù [6].
Sự tổ hợp của các yếu tố phiên mã đáp ứng với jasmonate khác nhau nhƣ ORCA2 và ORCA3 có thể điều chỉnh sự sinh tổng hợp TIA bằng cách hoạt hóa chọn lọc các gen đích. Sự tạo thành của TIA trong huyền phù tế bào dừa cạn không chuyển gen thì thấp hoặc không có trong khi sự sinh tổng hợp tryptopan và tryptamine đƣợc tăng cƣờng chứng tỏ rằng con đƣờng trao đổi chất dẫn tới tiền chất indole đã đƣợc cảm ứng nhƣng phần terpennoid của con đƣờng này vẫn còn giới hạn đối với sự sản sinh TIAs [18].
Các nghiên cứu cũng đã chứng tỏ rằng ORCA3 hoạt động nhƣ một protein bám DNA, nó có liên quan trực tiếp đến sự hoạt hóa các yếu tố phiên mã nhƣ Tdc, Str và Cpr. ORCA3 hình thành nên phức hợp đặc hiệu trình tự với đoạn promotor của Tdc, Str và Cpr. Sự biểu hiện của các đoạn promotor của Tdc, Str và Cpr lại đƣợc hoạt hóa bởi sự đồng biểu hiện của ORCA3 trong tế bào cây dừa cạn. Trong khi không phát hiện ra sự hoạt hóa của yếu tố không liên quan Tcyt của promotor của gen cytokin hoặc với đoạn đối mã của gen ORCA3 [16].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Pan Q và cộng sự (2012) đã tiến hành chuyển dòng gen ORCA3 và gen
ORCA3 kết hợp với gen G10H vào cây dừa cạn. Các tác giả đã nhận đƣợc dòng cây chuyển mang gen ORCA3 và cả dòng chuyển gen mang hai gen G10H và
ORCA3 đều biểu hiện vƣợt mức. Sự biểu hiện vƣợt mức của ORCA3 cảm ứng tăng cƣờng mức độ phiên mã của các gen AS, TDC, STR và D4H nhƣng không ảnh hƣởng đến phiên mã của CRMYC2 và G10H. Mức độ phiên mã của gen G10H đƣợc tăng cƣờng dƣới sự cùng biểu hiện của hai gen G10H và ORCA3, đồng thời cũng làm tăng cƣờng sự tích lũy của strictosidine, vindoline, catharanthine và ajmalicine nhƣng không tác động lên mức độ tích lũy của anhydrovinblastine và vinblastine [17].
Wang và cộng sự (2010) đã tiến hành chuyển gen G10H (gen mã hóa một cytochrome P450 monoxygenase) cùng gen ORCA3 vào cây dừa cạn, sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogene MSU440. Khi phân tích mức độ tích lũy alkaloid đã thể hiện rằng tất cả các dòng chuyển gen đều tích lũy lƣợng catharanthin nhiều hơn, mức tích lũy cao nhất ở dòng OG12 (cao hơn gấp 6,5 lần so với dòng không biểu hiện). Xử lí với ABA, sự tích lũy catharanthine đạt đến 1,96 mg/g DW ở dòng chuyển gen OG12 [33].
Vom Endt D và cộng sự (2007) sử dụng huyền phù tế bào chuyển gen cây dừa cạn mang gen GUS chứa promotor ORCA3 đã chứng minh rằng sự tích lũy của mRNA ORCA3 cảm ứng MeJA xảy ra ở mức độ phiên mã. Bằng thử nghiệm thêm và bớt một đoạn chức năng, tác giả đã định vị đƣợc vùng 74 bp bên trong promotor ORCA3 có chứa JRE (yếu tố đáp ứng với jasmonate). Hơn nữa, tác giả cũng đã xác định đƣợc 5 dòng lai liên quan đến yếu tố phiên mã AT-hook, nó bám đặc hiệu với trình tự bậc 4 trong ORCA3 JRE. Ông cũng chứng minh đƣợc rằng các thành viên họ AT-hook có liên quan đến việc xác định mức độ biểu hiện của JRE trong đáp ứng với jasmonate [31].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Menke và cộng sự (1999) đã xác định đƣợc ORCA2 và ORCA1 bằng cách sàng lọc nấm men lai xác định cDNA mã hóa hai protein ORCA1 và ORCA2. Các tác giả nhận thấy rằng: sự cảm ứng phiên mã của các gen mã hóa các enzyme chuyển hóa Strictosidine (Str) trong tế bào cây dừa cạn cần có một nhân tố phiên mã trung gian đƣợc cảm ứng bởi JA. Khu vực 42 bp trong các promoter Str là cần và đủ để gắn một nhân tố phiên mã, khu vực này không giống nhƣ các khu vực đã đƣợc xác định trƣớc đó và chứa một GCC-box. Protein ORCA đƣợc cảm ứng biểu hiện bởi JA. ORCA2 kích hoạt promoter Str và biểu hiện nhanh chóng khi cảm ứng với JA, trong khi ORCA1 lại không biểu hiện sự thay đổi nào [12].
Ngoài nghiên cứu trên cây dừa cạn, gen ORCA3 còn đƣợc nghiên cứu trên một số đối tƣợng thực vật khác nhƣ cây Arabidopsis, thuốc lá, đậu tƣơng…[13], [16]. Những nghiên cứu trên cho thấy, các nhà nghiên cứu thế giới đang dần làm sáng tỏ cơ chế điều hòa sinh tổng hợp TIA của ORCA3, từ đó bắt đầu có những nghiên cứu ứng dụng trong việc tăng hàm lƣợng các TIA có ý nghĩa trong y học.
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về cây dừa cạn chỉ đƣợc tập trung vào khảo sát hàm lƣợng alkaloid, phƣơng pháp nuôi cấy và phƣơng pháp chiết rút để t
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
