3
2.2.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen
Tách dòng phân tử đƣợc thực hiện theo Sambrook và cs (2001) [21].
Tạo vector tái tổ hợp
Sản phẩm RT-PCR nhân gen ORCA3 đƣợc làm sạch bằng bộ kit QIA quick Gel Extraction. Sản phẩm RT-PCR sau khi đƣợc làm sạch đƣợc gắn trực tiếp vào vector pBT nhờ enzyme nối T4
2.2. Hỗn hợp trên đƣợc ủ ở nhiệt độ là 220C trong 3 giờ và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng
E. coli DH5α.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ STT Thành phần Thể tích(µl) 1 Buffer T4 ligase(10X) 1 2 Sản phẩm PCR 5,0 3 Vector pBT 1,0 4 T4 ligase(2unit/µl) 1,0 5 H2O 2,0 6 Tổng 10,0
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α
Tế bào khả biến đƣợc lấy từ tủ -800C chuyển sang môi trƣờng -40 C. Khoảng 30 phút biến nạp bằng phƣơng pháp sốc nhiệt.
Bổ sung 15µl vectơ tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến Ecoli DH5α và trộn nhẹ. Hỗn hợp để trong bình đá 20 phút, ủ ở 420
C (trong 1 phút 30 giây), sau đó chuyển nhanh vào đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 500 µl LB lỏng (trypton, cao nấm men, NaCl) nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 2 giờ.
Cấy trải
Sau khi nuôi phục hồi, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch nổi giữ lại 150-250µl trộn nhẹ.
Sử dụng que cấy đã khử trùng cấy trải 150 - 250µl dịch khuẩn trên môi trƣờng LB đặc (Tripton, cao nấm men, NaCl và agar) có kháng sinh carbenicilin (100mg/l), IPTG (0,1 mM) và X - gal (40mg/l). Nuôi qua đêm ở 370 trong 16 giờ.
Chuyển khuẩn lạc sang pha nuôi lỏng
Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung carbenicilin 100 mg/l) nuôi ở 370C trong khoảng 3 giờ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
dòng bằng kĩ thuật colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen ORCA3. Thành phần phản ứng colony- 2.3. Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony - PCR STT Thành phần Thể tích (l) 1 H2O khử ion 6 2 Master Mix 7,5 3 Mồi F 0,5 4 Mồi R 0,5 5 DNA plasmid 0,5 6 Tổng 15
Chu trình nhiệt đƣợc đặt nhƣ sau: 940 - nhiệt độ là (940
C - 30 giây, 580C - 45 giây, 720C - 45 giây)30; 720C - 10 phút và lƣu giữ ở 40
C.
Sản phẩm colony-PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
Tách plasmide
Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, tiến hành tách plasmid
bằng bộ kit QIA prep Spin Miniprep của hãng QIA gen. Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.2.5. Phương pháp xác định v 3
Trình tự của gen ORCA3 đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
dụng bộ hoá chất sinh chuẩn Big Dye®
Terminator v3.1 cycle sequencing. . , khoa Sinh - - DN . Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
RT- gen ORCA3
Đoạn gen ORCA3 (gen vùng AP2 đáp ứng với dẫn xuất octadecanoid của cây dừa cạn) đƣợc công bố và phân lập đầu tiên bởi Van der Fits và Memelink (2000) bằng kỹ thuật hoạt hóa gắn đuôi T-DNA. Gen ORCA3
825 bp, đoạn mã hóa từ nucleotide số 19 đến nucleotide số 630 và đoạn gen ORCA3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
-
612 nucleotide, mã hóa cho 203 amino acid [25]. Dựa trên cơ sở dữ liệu khai thác từ trình tự gen mang mã số AJ251249 trên Ngân hàng gen NCBI chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân và phát hiện sự có mặt của đoạn gen ORCA3 ở giống dừa cạn nghiên cứu. Mồi xuôi có độ dài 31bp, mồi ngƣợc có độ dài 32bp, nhiệt độ gắn mồi là 580
C. Vì mục đích phân lập đoạn gen ORCA3 để tạo nguyên liệu chuyển gen nên chúng tôi có bổ sung 6 nucleotide vào đầu 5‟ của mồi xuôi (đó là các nucleotide 5‟-CrORCA3-F-CCTCAG-3‟) và bổ sung 7 nucleotide vào đầu 5‟ của mồi ngƣợc (đó là các nuclotide 5‟-CrORCA3-R-CGAGCTC-3‟), các nucleotide này là vị trí cắt của enzyme giới hạn loại BseMII.
CrORCA3-F/ CrORCA3- 3.1.
Bảng 3.1. Cặp mồi nhân đoạn gen ORCA3
Mồi Trình tự mồi (5'-3') Nhiệt độ
gắn mồi CrORCA3-F 5‟-CCTCAGATGTCCGAAGAAATCATTTCCGTCT- 3‟ 580C CrORCA3-R 5‟-CGAGCTCTTAATATCGTCTCTTCTTCCTTCCT- 3‟ 580C