Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ STT Thành phần Thể tích(µl) 1 Buffer T4 ligase(10X) 1 2 Sản phẩm PCR 5,0 3 Vector pBT 1,0 4 T4 ligase(2unit/µl) 1,0 5 H2O 2,0 6 Tổng 10,0
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α
Tế bào khả biến đƣợc lấy từ tủ -800C chuyển sang môi trƣờng -40 C. Khoảng 30 phút biến nạp bằng phƣơng pháp sốc nhiệt.
Bổ sung 15µl vectơ tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến Ecoli DH5α và trộn nhẹ. Hỗn hợp để trong bình đá 20 phút, ủ ở 420
C (trong 1 phút 30 giây), sau đó chuyển nhanh vào đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 500 µl LB lỏng (trypton, cao nấm men, NaCl) nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 2 giờ.
Cấy trải
Sau khi nuôi phục hồi, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch nổi giữ lại 150-250µl trộn nhẹ.
Sử dụng que cấy đã khử trùng cấy trải 150 - 250µl dịch khuẩn trên môi trƣờng LB đặc (Tripton, cao nấm men, NaCl và agar) có kháng sinh carbenicilin (100mg/l), IPTG (0,1 mM) và X - gal (40mg/l). Nuôi qua đêm ở 370 trong 16 giờ.
Chuyển khuẩn lạc sang pha nuôi lỏng
Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung carbenicilin 100 mg/l) nuôi ở 370C trong khoảng 3 giờ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
dòng bằng kĩ thuật colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen ORCA3. Thành phần phản ứng colony- 2.3. Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony - PCR STT Thành phần Thể tích (l) 1 H2O khử ion 6 2 Master Mix 7,5 3 Mồi F 0,5 4 Mồi R 0,5 5 DNA plasmid 0,5 6 Tổng 15
Chu trình nhiệt đƣợc đặt nhƣ sau: 940 - nhiệt độ là (940
C - 30 giây, 580C - 45 giây, 720C - 45 giây)30; 720C - 10 phút và lƣu giữ ở 40
C.
Sản phẩm colony-PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
Tách plasmide
Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, tiến hành tách plasmid
bằng bộ kit QIA prep Spin Miniprep của hãng QIA gen. Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.2.5. Phương pháp xác định v 3
Trình tự của gen ORCA3 đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
dụng bộ hoá chất sinh chuẩn Big Dye®
Terminator v3.1 cycle sequencing. . , khoa Sinh - - DN . Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
RT- gen ORCA3
Đoạn gen ORCA3 (gen vùng AP2 đáp ứng với dẫn xuất octadecanoid của cây dừa cạn) đƣợc công bố và phân lập đầu tiên bởi Van der Fits và Memelink (2000) bằng kỹ thuật hoạt hóa gắn đuôi T-DNA. Gen ORCA3
825 bp, đoạn mã hóa từ nucleotide số 19 đến nucleotide số 630 và đoạn gen ORCA3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
-
612 nucleotide, mã hóa cho 203 amino acid [25].
Dựa trên cơ sở dữ liệu khai thác từ trình tự gen mang mã số AJ251249
trên Ngân hàng gen NCBI chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân
và phát hiện sự có mặt của đoạn gen ORCA3 ở giống dừa cạn nghiên cứu.
Mồi xuôi có độ dài 31bp, mồi ngƣợc có độ dài 32bp, nhiệt độ gắn mồi là 580
C. Vì mục đích phân lập đoạn gen ORCA3 để tạo nguyên liệu chuyển gen nên chúng tôi có bổ sung 6 nucleotide vào đầu 5‟ của mồi xuôi (đó là các nucleotide 5‟-CrORCA3-F-CCTCAG-3‟) và bổ sung 7 nucleotide vào đầu 5‟ của mồi ngƣợc (đó là các nuclotide 5‟-CrORCA3-R-CGAGCTC-3‟), các nucleotide này là vị trí cắt của enzyme giới hạn loại BseMII.
CrORCA3-F/ CrORCA3- 3.1.
Bảng 3.1. Cặp mồi nhân đoạn gen ORCA3
Mồi Trình tự mồi (5'-3') Nhiệt độ
gắn mồi CrORCA3-F 5‟-CCTCAGATGTCCGAAGAAATCATTTCCGTCT- 3‟ 580C CrORCA3-R 5‟-CGAGCTCTTAATATCGTCTCTTCTTCCTTCCT- 3‟ 580C
3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen ORCA3 từ mRNA
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá dừa cạn Thái Nguyên màu hoa hồng (TN1) bằng Trizol Regents, sau đó kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%, kết quả kiểm tra cho thấy sản phẩm tách chiết RNA tổng số đảm bảo chất lƣợng để tiến hành tạo cDNA.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
heo hƣớng dẫn trên bộ kit của hãng Invitrogen. Phản ứng RT-PCR để nhân bản đoạn cDNA đƣợc thực hiện với cặp mồi CrORCA3-F/ CrORCA3-R, nhiệt độ gắn mồi khả dụng cho phản ứng PCR là 580
C, sau 30 chu kì phản ứng. Kết quả nhân gen đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
0,6kb M 1 2 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb M 1 2 3.1. ORCA3 (TN1) TN1
đoạn gen ORCA3 hay không và độ tƣơng đồng nhƣ thế nào với trình tự đoạn gen ORCA3
.
3.1.3. Kết quả tách dòng đoạn gen ORCA3
Sau khi khuếch đại cDNA của gen ORCA3 từ cây dừa cạn TN1 hoa màu hồng, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo hƣớng dẫn trên bộ kit
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
của hãng QIAgen. Kết quả tinh sạch cho thấy, sản phẩm tinh sạch đảm bảo về lƣợng và chất lƣợng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Sản phẩm cDNA sau khi đã tinh sạch đƣợc gắn vào vectơ tách dòng pBT và biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α. Tiến hành chọn dòng bằng phản ứng colony - PCR trực tiếp từ khuẩn lạc màu trắng với cặp mồi đặc hiệu. -PCR. Sản phẩm colony-PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromid 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng
(Hình 3.2).
Những dòng khuẩn lạc dƣơng tính với PCR đã đƣợc chọn để tách plasmid tái tổ hợp và đem đi giải trình tự. Sản phẩm tách plasmid đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromid 1 % và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide.
1 2 3 4 5 6 7 M
0,6kb 0,75kb0,5kb
3.2. -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ĐOẠN GEN ORCA3
TN1
đoạn gen ORCA3 TN1
Nguyên bằng má 3.3.
Đoạn gen ORCA3 1 mà chúng tôi phân lập đƣợc dài 603 nucleotide, trong đó có 164 base loại A, 117 base loại C, 170 base loại G, 152 base loại T. So sánh trình tự đoạn gen ORCA3 mà chúng tôi thu đƣợc với trình tự gen trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI cho thấy, gen ORCA3 có độ tƣơng đồng 98% với trình tự có mã số AJ251249 (trình tự sử dụng để thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen ORCA3) và tƣơng đồng 99% với trình tự có mã số EU072424.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3
Hình 3.3 cho thấy, trình tự đoạn gen ORCA3
251249 ở 10 vị trí nucleotide: 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 601 và sai khác với trình tự có mã số EU072424 ở 1 vị trí nucleotide: 601 (bảng 3.2).
Bảng 3.2. Bảng tổng hợp những vị trí nucleotide khác nhau đoạn gen ORCA3
Vị trí
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
AJ251249 T T C T T C T T C A EU072424 - - - A TN - - - G
Bảng 3.2 cho thấy, giống dừa cạn TN1 Thái Nguyên có một vùng từ nucleotide số 564 đến nucleotide số 572 (9 nucleotide) bị khuyết so với trình tự có mã số AJ251249 (trình tự dùng để thiết kế mồi), tuy nhiên vùng khuyết này lại giống với trình tự có mã số EU07
, rất có giống dừa cạn TN1 Thái Nguyên màu hoa hồng đoạn gen ORCA3 mang mã số EU072424 cùng phân bố trong một nhóm đoạn gen ORCA3 mang mã số
AJ251249 phân bố ở nhóm .
Nhƣ vậy, chúng tôi đã đoạn gen
ORCA3 TN1 .
Protein ORCA3 suy diễn từ trình tự đoạn gen ORCA3 giống dừa cạn Thái Nguyên mà chúng tôi phân lập đƣợc có 200 amino acid. Trong đó, amino acid loại serin có số lƣợng lớn nhất (32) chiếm tỷ lệ 15, 92%, amino acid loại histidin có số lƣợng thấp nhất (2) chiếm tỷ lệ 1,00%. Số lƣợng và tỷ lệ từng loại amino acid cụ thể đƣợc chúng tôi minh họa trong bảng 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.4.
TN1
NCBI
Kết quả so sánh vùng tƣơng đồng của 3 trình tự amino acid cho thấy protein suy diễn của AJ251249, mã số CAB96899, tƣơng đồng 98% so với protein suy diễn của giống dừa cạn Thái Nguyên, còn protein suy diễn của EU072424, mã số ABW77571, tƣơng đồng 99% so với protein suy diễn của giống dừa cạn Thái Nguyên. Bảng 3.4 thể hiện 4 vị trí sai khác (188, 189, 190, 201) về trình tự amino acid của protein suy diễn giống dừa cạn Thái Nguyên so với protein CAB96899 và ABW77571.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.3. Tỷ lệ và số lƣợng từng loại amino acid ORCA3
1 Acid amin Số lƣợng Tỷ lệ (%) Cys 3 1,49 Asp 10 4,98 Glu 19 9,45 Phe 7 3,48 Gly 16 7,96 His 2 1,00 Ile 9 4,48 Lys 11 5,47 Leu 11 5,47 Met 3 1,49 Asn 10 4,98 Pro 11 5,47 Gln 3 1,49 Arg 15 7,46 Ser 32 15,92 Thr 7 3,48 Val 6 2,99 Trp 5 2,49 Tyr 4 1,99 Ala 16 7,96
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.4. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid
96899, ABW77571
Vị trí 188 189 190 201
CAB96899 S S S R
ABW77571 - - - R
TN1 - - - G
Nhƣ vậy, trình tự amino acid của giống dừa cạn TN1 Thái Nguyên khác 4 amino acid so với CAB96899, chỉ khác 1 amino acid so với ABW77571. Nguyên nhân là do trình tự nucleotide của dừa cạn TN1 Thái Nguyên và EU072424 bị khuyết một đoạn 9 nucleotide so với AJ251249, đoạn này mã hóa cho 3 amino acid loại serin vì vậy trong trình tự amino acid của dừa cạn Thái Nguyên và ABW77571 ít hơn 3 amino acid so với trình tự amino acid của AJ251249. Chúng tôi giả định rằng, trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây dừa cạn đã xảy ra đột biến mất đoạn 9 nucleotide dẫn đến giảm 3 amino acid loại serin, điều này rất có thể khiến cho sự điều hòa phiên mã thay đổi theo hƣớng tích cực. Ở vị trí 601, AJ251249 và EU072424 là nucleotide loại A, chính điều đó đã làm thay đổi amino acid ở vị trí số 201 từ loại arginin thành loại glicine.
Nhƣ ở phần tổng quan có đề cập tới, theo nhƣ [20] C giàu serin
có chức năng điều hòa tiêu cực do sự hoạt hóa phiên mã ở các tế bào thực vật bị
ức chế bởi các nhóm serin định vị ở đầu C của protein ORCA3. Nếu loại bỏ 24
amino acid có chứa 11 gốc serin từ đầu tận C của ORCA3 sẽ gây ra sự tăng hoạt
hóa trans. Ở đây chúng tôi nhận thấy, hai trình tự amino acid
dừa cạn TN1 Thái Nguyên và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
so với trình tự AJ251249 và đồng thời hai trình tự này đều phân lập từ giống dừa cạn có cùng màu hồng. Cây dừa cạn hoa màu hồng có hàm lƣợng vinbastine và vincristine cao nhất và vì thế hiện tƣợng khuyết 3 amino acid loại serin ở đầu tận C phải chăng có liên quan đến sự khác nhau về hàm lƣợng alkaloid ở các giống dừa cạn. Đây là vấn đề đặt ra cho các nghiên cứu tiếp theo và vì vậy cần tiếp tục phân lập gen ORCA3 ở các giống dừa cạn có hoa màu khác để làm cơ sở
so sánh và phân tích mối liên quan giữa trình tự gen ORCA3 với sự tổng hợp aklaloid ở các giống dừa cạn.
Hình 3.5. Vùng AP-2 của protein ORCA3 bám DNA [37]
So sánh vùng AP2 trong đoạn gen ORCA3 của giống dừa cạn TN1 Thái Nguyên và 2 trình tự trên Ngân hàng gen NCBI cho thấy, vùng AP2 của 3 trình tự này giống nhau 100%, cả 3 trình tự đều có vùng AP2 dài 60 amino acid trong đó có 11 điểm bám với promoter là các vị trí amino acid số 101, 102, 104, 106, 108, 110, 114, 116, 124, 126, 129.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Nhƣ vậy, đoạn gen ORCA3 liên quan đến sinh tổng hợp alkaloid đã phân lập thành công từ cây dừa cạn, mẫu TN1.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1.1. Đoạn gen ORCA3 phân lập
Nguyên đã đƣợc tách dòng thành công và xác định đƣợc trình tự nucleotide.
ORCA3 603 nucleotide, mã hóa 200 amino acid. 1.2. đoạn gen ORCA3
TN1 so đoạn
gen ORCA3 mang mã số EU0
98% .
1.3. đoạn gen ORCA3
TN1 so mino acid
775 99% và tƣơng đồng 98% so 96899.
1.4. Vùng chức năng AP2 của cả 3 trình tự amino acid
3 amino acid 96899.
2. ĐỀ NGHỊ
đoạn gen ORCA3 trắng, hoa màu trắng để có cơ sở so sánh và xác định chính xác chỉ thị phân tử liên quan tới việc điều khiển sinh tổng hợp alkaloid.
đoạn gen ORCA3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Viện dƣợc liệu (2001), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, tr. 57-89.
2. Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận, Vương Chí Hùng, Nguyễn Tiến Hùng, Study on the dynamic variation of 10-DAB and taxol contents of Taxus wallichiana
needles cultivated in Lam Dong province. PHARMA INDOCHINA VI. The development of indochina pharmacy in the context of global economic recession. 15-18/12/2009, tr.621-624.
Tiếng Anh
3. Aerts RJ, Stoker A, Beishuizen M, van de Heuvel M, van der Meijden E, Verpoorte R, (1992), “Detrimental effects of Cinchona leaf alkaloids on larvae of the polyphagous insect Spodoptera exigua“, J Chem Ecol, 18:1955–1964. 4. Benoit St Bierr, Bierr Laflammer, Anne Marie Alarco, Vincenzo Deloca, (1998),
“The terminal O–acetyltransferase involved in vindoline biosynthesis define a new class of protein responsible forr coenzyme A-dependent acyl transfer”, The Plant journal, 14(6) 703-713.
5. Bhumika Shokeen, Shalu Choudhary, Niroj Kumar Sethy and Sabhyata Bhatia,(2011), Development of SSR and gene-targeted markers for construction of a framework linkage map of Catharanthus roseus, Ann Bot.; 108(2): 321– 336.
6. Canel C, Lopes-Cardoso M, Whitmer S, van der Fits L, Pasquali G, et al., (1998), Effects of overexpression of strictosidine synthase and tryptophan
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
decarboxylase on alkaloid production by cell cultures of Catharanthus roseus, Planta, 205: 414–419
7. Contin A, van der Heijden R, Lefeber AWM, Verpoorte R, (1998), The iridoid glucoside secologanin is derived from the novel triose phosphate/pyruvate pathway in Catharanthus roseus cell culture, FEBS Lett, 434:413–416.
8. Leslie van der Fits and Johan Memelink, (2001), The jasmonate-inducible AP2/ERF-domain transcriptionactor ORCA3 activates gene expression via interaction witha jasmonate-responsive promoter element, The Plant Journal, 25(1). 43 - 53
9. Luijendijk TJC, van der Meijden E, Verpoorte R, (1996), Involvement of strictosidine as a defensive chemical in Catharanthus roseus, J Chem Ecol,
22:1355–1366
10. Meijer AH, Verpoorte R, Hoge JHC (1993a) Regulation of enzymes and genes involved in terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus, J Plant Res, 3:145–164.
11. Memelink J., Gantet P., ( 2007), Transcription factors involved in terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus, Springer Science,
11101-006-9051.
12. Menke FLH, Champion A, Kijne JW, Memelink J, (1999), A novel jasmonate- and elicitor-responsive element in the periwinkle secondary metabolite biosynthetic gene Str interacts with a jasmonate- and elicitor-inducible AP2- domain transcription factor, ORCA2, Embo J, 18 4455–4463.
13. Montiel G, Zarei A, Körbes AP, Memelink J, (2011), The jasmonate-responsive element from the ORCA3 promoter from Catharanthus roseus is active in
Arabidopsis and is controlled by the transcription factor AtMYC2, Plant Cell Physiol.52(3):578-587.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
14. Moreno PRH, van der Heijden R, Verpoorte R, (1995), Cell and tissue cultures of Catharanthus roseus (L.) G.Don: a literature survey II. Updating from 1988 to 1993, Plant Cell Tiss Org Cult, 42: 1–25.
