Đề Tài Nghiên Cứu Tách Dòng Và Xác Định Trình Tự Gene Lycopene Beta - Cyclase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN - BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP BỘ TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GENE LYCOPENE BETA CYCLASE MÃ SỐ: B2009 – TN03 – 21 Chủ nhiệm đề tài: ThS Dương Văn Cường THÁI NGUYÊN - 2011 Phần I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tính cấp thiết đề tài Carotenoid nhóm sắc tố tự nhiên tổng hợp chủ yếu thực vật, tảo, vi khuẩn nấm (Schmidt-Dannert et al., 2000) Carotenoid có vai trò hình thành màu sắc, che chắn ánh sáng hình thành hormone (Vershinin, 1999) Trong công nghiệp carotenoid dùng làm dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, chất phụ gia thức ăn cho động vật, phẩm màu làm mỹ phẩm thực phẩm (Lee and Schmidt-Dannert, 2002) Do khả chống oxi hóa, carotenoid mang lại lợi ích cho sức khỏe người, bảo vệ da tác động ánh nắng mặt trời, tăng cường chức hệ miễn dịch, ngăn ngừa hay làm chậm trình phát bệnh bệnh mãn tính, có tác dụng điều trị phòng ngừa số bệnh ung thư (Giovannucci, 1999; Lee and Schmidt-Dannert, 2002; Lenore Arab and Steck, 2000; Lu et al., 2001) ß-carotene, với vai trò tiền chất vitamin A, tăng cường hệ miễn dịch chống số bệnh ung thư (Bendich, 2004) trở thành chất quan tâm nhóm carotenoid Cơ thể người không tự tổng hợp ß-carotene mà phải hấp thụ từ thức ăn (Fujisawa et al., 2008) Carotenoids xây dựng từ đơn phân isopentenyl diphosphate (IPP) dimethylallyl diphosphate (DMAPP) Hiện có 20 gene crt chịu trách nhiệm tổng hợp nên carotenoids tách dòng từ loại sinh vật vi khuẩn, vi khuẩn lam, nấm, tảo thực vật bậc cao (Joseph Hirschberg, 1997 ) Một vi khuẩn cung cấp gene carotenoid để tổng hợp carotenoid vi khuẩn Pantoea ananatis (trước gọi Erwinia uredevora) (Misawa et al., 1990) ß-carotene tổng hợp từ lycopene nhờ enzyme lycopene cyclase mã hóa gene crtY Hiện nay, có số carotenoid bao gồm β-carotene, lycopene, astaxanthin, canthaxanthin, capsanthin, lutein, Annatto, β-Apo-8-carotenal, β-Apo-8-carotenal-ester sản xuất thương mại tổng hợp hóa học, lên men tách chiết với số lượng nhỏ từ nguồn có sẵn tự nhiên (Johnson and Schroeder, 1996) Ngày nay, mà phương pháp tổng hợp carotenoid thực vật hay hóa học có nhược điểm định phương pháp dùng vi sinh vật để tổng hợp carotenoid thân thiện với môi trường có khả đáp ứng ngày tăng nhu cầu carotenoid Xuất phát từ thực tế thực đề tài : “Tách dòng xác định trình tự gene crtY mã hóa cho enzyme Lycopene cyclase từ vi khuẩn Pantoea ananatis” Kết nghiên cứu sở cho nghiên cứu tạo ß-carotene tái tổ hợp hợp chất khác nhóm carotenoids 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Tách dòng xác định trình tự gene crtY từ vi khuẩn Pantoea ananatis 1.3 Yêu cầu đề tài - Thực quy trình phân lập tách dòng gene crtY từ vi khuẩn Pantoea ananatis Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học 2.1.1 Tổng quan Carotenoids ß-carotene 2.1.1.1 Carotenoid Carotenoid : Carotenoid nhóm sắc tố tự nhiên tổng hợp chủ yếu thực vật, tảo, vi khuẩn nấm (Schmidt-Dannert et al., 2000) Carotenoid có màu từ màu vàng, màu cam tới đỏ (Devitt et al., 2010), Wackenroder phát vào năm 1831 ông phân lập hợp chất từ cà rốt Năm 1837 Berzelius chiết xuất thành công hợp chất màu vàng từ mùa thu, đặt tên xantophyl Năm 1911, nhà khoa học phát liên quan hai hợp chất đặt tên chung “carotenoid” (Britton et al., 1996) Năm 1948 Kauren phát cấu trúc hóa học carotenoid Năm 1950 Kauren lần tổng hợp nhân tạo β-carotene licopen phòng thí nghiệm Kể từ carotenoid trở thành đối tượng quan tâm nghiên cứu liên ngành hóa học, sinh học, y học, vật lí học nhiều ngành khoa học khác (Britton et al., 1996) a Cấu trúc hóa học tính chất lý hóa carotenoid Cấu trúc hóa học : Cơ sở cấu trúc hóa học carotenoid cấu trúc polyizopren gồm 40 nguyên tử cacbon, carotenoid chứa phân tử izopren (hình 1) Hình 1: Phân tử izopren Mạch polyisopren nhiều sắc tố tận vòng ionon, số khác dạng mạch hở Bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, nhà khoa học xác định vị trí nhóm -CH3 - CH2 – phân tử Nhóm -CH3 có quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân khác biệt với nhóm - CH2 – định sprin prin proton hệ thông liên kết đôi đơn xen kẽ Phương pháp cho phép xác định cấu trúc nhóm tận Carotenoid Phần trung tâm phân tử carotenoid gồm 18 nguyên tử cacbon hình thành hệ thống liên kết đôi xen kẽ liên kết đơn, có gắn thêm nhóm CH3 Vòng đầu giống khác lycopen, phần trung tâm nối liền nối liền với vòng theo kiểu 1-1, γ-caroten 1-2, βcaroten 2-2, … Tính chất lý hóa : Tính chất lí hóa carotenoid định đặc tính cấu trúc Các carotenoid có lượng lớn gốc kị nước, định tính kị nước hợp chất Carotenoid không tan nước, tan lipit dung môi hữu cơ, tính ưa lipit giảm dần tăng dần số nguyên tử oxi Carotenoid tách chiết dung môi hữu không phân cực (benzen, ete dầu hỏa…) hay phân cực (ete etylic, rượu, axeton…) Sự hình thành màu sắc carotenoid quy định hệ thống liên kết đơn, đôi xen kẽ mạch phân nhánh, phần lớn hidratcacbon tạo nên từ 40 nguyên tử cacbon liên kết với Hidro hình thành mạch phân nhánh dài Màu sắc carotenoid phụ thuộc vào cấu trúc, trạng thái hòa tan dung môi, dạng tinh thể hay phức hợp, tồn dạng đồng phân cis hay trans (Britton et al., 1996) b Phân loại carotenoid Hiện tìm thấy 600 loại carotenoid khác nhau, xếp theo hai nhóm : carotene xanthophylls (Britton et al., 1996) Caroten (C40H56) : Là loại hidratcacbon chưa bão hòa, không tan nước, tan lipit dung môi hữu Caroten để không khí hấp thụ oxi (đến 40% so với trọng lượng), trở thành dạng oxi hóa Caroten nguyên chất tinh thể có màu đỏ sáng có ánh kim, dung dịch caroten có màu đỏ cam Phần trung tâm phân tử gồm 18 nguyên tử cacbon hình thành hệ thống liên kết đơn, đôi xen kẽ, có nhóm CH3 mạch nhánh Các loại caroten quan trọng α-carotene, β-carotene, γ-carotene lycopen Xantophyl : Xantophyl nhóm sắc tố màu vàng sẫm, có công thức chung C40H56On (n từ 1-6) Xantophyl dẫn xuất caroten, chứa oxi nhóm hydroxyl, ceto, cacboxyl… Các Xantophyl quan trọng Lutein, Zeaxantin Oxi nhóm % thực vật 40 34 19 Ở tảo Ở tảo nâu Spiriloxantin nhóm -OH -OH -OH, O< (epoxi) -OH, O< -OH O= (xeto) -OH, Olcl|20859 Length=1161 Score = 2145 bits (1161, Expect = 0.0 Identities = 1160/1161 (99,91%), Gaps = 1/1161 (0,09%), Strand=Plus/Plus D90087.2 4610673 GTGGGAGCGGCTATGCAACCGCATTATGATCTGATTCTCGTGGGGGCTGGACTCGCGAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY ATGGGAGCGGCTATGCAACCGCATTATGATCTGATTCTCGTGGGGGCTGGACTCGCGAAT 4610732 D90087.2 4610733 GGCCTTATCGCCCTGCGTCTTCAGCAGCAGCAACCTGATATGCGTATTTTGCTTATCGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 61 GGCCTTATCGCCCTGCGTCTTCAGCAGCAGCAACCTGATATGCGTATTTTGCTTATCGAC 4610792 60 120 D90087.2 4610793 GCCGCACCCCAGGCGGGCGGGAATCATACGTGGTCATTTCACCACGATGATTTGACTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 121 GCCGCACCCCAGGCGGGCGGGAATCATACGTGGTCATTTCACCACGATGATTTGACTGAG 4610852 D90087.2 4610853 AGCCAACATCGTTGGATAGCTTCGCTGGTGGTTCATCACTGGCCCGACTATCAGGTACGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 181 AGCCAACATCGTTGGATAGCTTCGCTGGTGGTTCATCACTGGCCCGACTATCAGGTACGC 4610912 D90087.2 4610913 TTTCCCACACGCCGTCGTAAGCTGAACAGCGGCTACTTCTGTATTACTTCTCAGCGTTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 241 TTTCCCACACGCCGTCGTAAGCTGAACAGCGGCTACTTCTGTATTACTTCTCAGCGTTTC 4610972 D90087.2 4610973 GCTGAGGTTTTACAGCGACAGTTTGGCCCGCACTTGTGGATGGATACCGCGGTCGCAGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 301 GCTGAGGTTTTACAGCGACAGTTTGGCCCGCACTTGTGGATGGATACCGCGGTCGCAGAG 4611032 D90087.2 4611033 GTTAATGCGGAATCTGTTCGGTTGAAAAAGGGTCAGGTTATCGGTGCCCGCGCGGTGATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 361 GTTAATGCGGAATCTGTTCGGTTGAAAAAGGGTCAGGTTATCGGTGCCCGCGCGGTGATT 4611092 D90087.2 4611093 GACGGGCGGGGTTATGCGGCAAACTCAGCACTGAGCGTGGGCTTCCAGGCGTTTATTGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 421 GACGGGCGGGGTTATGCGGCAAACTCAGCACTGAGCGTGGGCTTCCAGGCGTTTATTGGC 4611152 D90087.2 4611153 CAGGAATGGCGATTGAGCCACCCGCATGGTTTATCGTCTCCCATTATCATGGATGCCACG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 481 CAGGAATGGCGATTGAGCCACCCGCATGGTTTATCGTCTCCCATTATCATGGATGCCACG 4611212 D90087.2 4611213 GTCGATCAGCAAAATGGTTATCGCTTCGTGTACAGCCTGCCGCTCTCGCCGACCAGATTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 541 GTCGATCAGCAAAATGGTTATCGCTTCGTGTACAGCCTGCCGCTCTCGCCGACCAGATTG 4611272 D90087.2 4611273 TTAATTGAAGACACGCACTATATCGATAATGCGACATTAGATCCTGAACGCGCGCGGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 601 TTAATTGAAGACACGCACTATATCGATAATGCGACATTAGATCCTGAACGCGCGCGGCAA 4611332 D90087.2 4611333 AATATTTGCGACTATGCCGCGCAACAGGGTTGGCAGCTTCAGACATTGCTGCGTGAAGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 661 AATATTTGCGACTATGCCGCGCAACAGGGTTGGCAGCTTCAGACATTGCTGCGTGAAGAA 4611392 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 40 D90087.2 4611393 CAGGGCGCCTTACCCATCACCCTGTCGGGCAATGCCGAGGCATTCTGGCAGCAGCGCCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 721 CAGGGCGCCTTACCCATCACCCTGTCGGGCAATGCCGAGGCATTCTGGCAGCAGCGCCCC 4611452 D90087.2 4611453 CTGGCCTGTAGTGGATTACGTGCCGGTCTGTTCCATCCTACCACCGGCTATTCACTGCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 781 CTGGCCTGTAGTGGATTACGTGCCGGTCTGTTCCATCCTACCACCGGCTATTCACTGCCG 4611512 D90087.2 4611513 CTGGCGGTTGCCGTGGCCGACCGCCTGAGCGCACTTGATGTCTTTACGTCGGCCTCAATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 841 CTGGCGGTTGCCGTGGCCGACCGCCTGAGCGCACTTGATGTCTTTACGTCGGCCTCAATT 4611572 D90087.2 4611573 CACCAGGCTATTAGGCATTTTGCCCGCGAGCGCTGGCAGCAGCAGCGCTTTTTCCGCATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 901 CACCAGGCTATTAGGCATTTTGCCCGCGAGCGCTGGCAGCAGCAGCGCTTTTTCCGCATG 4611632 D90087.2 4611633 CTGAATCGCATGCTGTTTTTAGCCGGACCCGCCGATTCACGCTGGCGGGTTATGCAGCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 961 CTGAATCGCATGCTGTTTTTAGCCGGACCCGCCGATTCACGCTGGCGGGTTATGCAGCGT 4611692 D90087.2 4611693 TTTTATGGTTTACCTGAAGATTTAATTGCCCGTTTTTATGCGGGAAAACTCACGCTGACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 1021 TTTTATGGTTTACCTGAAGATTTAATTGCCCGTTTTTATGCGGGAAAACTCACGCTGACC 4611752 D90087.2 4611753 GATCGGCTACGTATTCTGAGCGGCAAGCCGCCTGTTCCGGTATTAGCAGCATTGCAAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CrtY 1081 GATCGGCTACGTATTCTGAGCGGCAAGCCGCCTGTTCCGGTATTAGCAGCATTGCAAGCC 4611812 D90087.2 4611813 ATTATGACGACTCATCGTTAA ||||||||||||||||||||| CrtY 1141 ATTATGACGACTCATCGTTAA 780 840 900 960 1020 1080 1140 4611833 1161 Hình 10: Kết so sánh trình tự gene crtY phân lập với trình tự gene crtY phân lâp từ Pantoea ananatis công bố ngân hàng gene NCBI mã số D90087.2 Kết so sánh cho thấy, hai gene có kích thước với độ tương đồng 99,91 %, có sai khác nucleotide thiết kế mồi ban đầu nhằm tạo ba mã khởi đầu ATG Trình tự gene phân lập không xảy biến đổi di truyền, không xuất đội biến điểm gene phân lập so với trình tự gene công bố 41 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Tách dòng thành công gene crtY từ vi khuẩn Pantoea ananatis, thu dòng mang gene crtY Trình tự nucleotide gene crtY tách dòng trùng khớp 100% với trình tự gene crtY từ vi khuẩn Pantoea ananatis công bố trước ngân hàng gene NCBI với mã số D90087.2 5.2 Kiến nghị Tiếp tục tiến hành đưa gene crtY gene thuộc đường sinh tổng hợp lycopene vào E.coli nhằm tạo chủng vi khuẩn có khả sản xuất β-carotene 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003) Sinh Học Phân Tử Nxb Giáo Dục Nguyễn Thu Huyền, Nguyễn Văn Mùi, Trần Thị Huyền Nga, Trần Thị Quỳnh Trang (2007) Điều tra, phân tích carotenoid từ số họ bầu bí Cucurbitaceae Báo cáo hội nghị khoa học Hoá sinh y dược:196200 Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi (2007) Điều tra hợp chất carotenoit số thực vật Việt Nam Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, KHTN & CN, T.XXIII số 2:59 – 63 Phùng Xuân Lê, Trần Thị Huyền Nga (2008) Nghiên cứu ảnh hưởng lutein lên sinh trưởng vi sinh vật bị chiếu UV tia tử ngoại Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ IV Hóa sinh Sinh học phân tử:67-70 Hà Thị Tâm Tiến, Nguyễn Văn Mùi, Trần Thị Huyền Nga, Hà Thị Bích Ngọc (2006 ) Điều tra, tách chiết đánh giá hoạt tính sinh học lutein cúc vạn thọ Tagetes erecta L Báo cáo khoa học, hội thảo khoa học công nghệ quản lí nông học phát triển nông nghiệp bền vững VN:344349 Nguyễn Văn Phòng, Trần Thị Huyền Nga (2008) Điều tra thử hoạt tính hợp chất carotenoit hoa số loài thực vật Việt Nam Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ IV Hóa sinh Sinh học phân tử:366-368 Lưu Vân Quỳnh, Trần Thị Huyền Nga, Hà Thị Bích Ngọc, Nguyễn Văn Mùi (2006) Nghiên cứu beta-carotene từ gấc Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng mướp đắng Momordica charantia L Báo cáo khoa học, hội thảo khoa học công nghệ quản lí nông học phát triển nông nghiệp bền vững VN:295-301 Nguyễn Thị Hải Thanh, Nguyễn Văn Mùi, Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga (2006) Điều tra, tách chiết đánh giá hoạt tính sinh học lycopen từ số thực vật Việt Nam Báo cáo khoa học, hội thảo khoa học 43 công nghệ quản lí nông học phát triển nông nghiệp bền vững VN:317- 323 Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Văn Mùi, Trần Thị Huyền Nga (2007) Điều tra carotenoit số loài rau Việt Nam Báo cáo hội nghị khoa học Hoá sinh y dược : 201 - 205 10 Nguyễn Minh Thủy (2005) Giáo trình dinh dưỡng người Đại Học Cần Thơ pp 140 Tài liệu tiếng anh 11 Albrecht M., Ruther A., Sandmann G (1997) Purification and biochemical characterization of a hydroxyneurosporene desaturase involved in the biosynthetic pathway of the carotenoid spheroidene in Rhodobacter sphaeroides J Bacteriol 179:7462-7 12 Armstrong G.A., Schmidt A., Sandmann G., Hearst J.E (1990) Genetic and biochemical characterization of carotenoid biosynthesis mutants of Rhodobacter capsulatus J Biol Chem 265:8329-38 13 Bendich A (1989) Symposium conclusions: biological actions of carotenoids J Nutr 119:135-6 14 Bendich A (2004) From 1989 to 2001: what have we learned about the "biological actions of beta-carotene"? J Nutr 134:225S-230S 15 Blas A.L., Ming R., Liu Z., Veatch O.J., Paull R.E., Moore P.H., Yu Q (2010) Cloning of the papaya chromoplast-specific lycopene beta-cyclase, CpCYC-b, controlling fruit flesh color reveals conserved microsynteny and a recombination hot spot Plant Physiol 152:2013-22 DOI: pp.109.152298 [pii] 10.1104/pp.109.152298 16 Britton G., Liaaen-Jensen S., Pfander H (1996) Carotenoids Birkhäuser Verlag 17 Das A., Yoon S.H., Lee S.H., Kim J.Y., Oh D.K., Kim S.W (2007) An update on microbial carotenoid production: application of recent metabolic engineering tools Appl Microbiol Biotechnol 77:505-12 DOI: 10.1007/s00253-007-1206-3 44 18 De Maayer P., Chan W.Y., Venter S.N., Toth I.K., Birch P.R., Joubert F., Coutinho T.A (2010) Genome sequence of Pantoea ananatis LMG20103, the causative agent of Eucalyptus blight and dieback J Bacteriol 192:2936-7 DOI: JB.00060-10 [pii] 10.1128/JB.00060-10 19 Devitt L.C., Fanning K., Dietzgen R.G., Holton T.A (2010) Isolation and functional characterization of a lycopene beta-cyclase gene that controls fruit colour of papaya (Carica papaya L.) J Exp Bot 61:33-9 DOI: erp284 [pii] 10.1093/jxb/erp284 20 Do Xuan Hoan T.T.Q.T., Tran Thi Huyen Nga, Nguyen Van Mùi (2007) Examine some biological effects of carotenoids and flavonoids from leaves of certain yellow Camellia species VNU, Journal of Science, Nat., Sci., & tech., T.XXIII No.1S CAP:124 – 130 21 Fujisawa M., Watanabe M., Choi S.K., Teramoto M., Ohyama K., Misawa N (2008) Enrichment of carotenoids in flaxseed (Linum usitatissimum) by metabolic engineering with introduction of bacterial phytoene synthase gene crtB J Biosci Bioeng 105:636-41 DOI: S1389-1723(08)70121-X [pii] 10.1263/jbb.105.636 22 Giovannucci E (1999) Tomatoes, tomato-based products, lycopene, and cancer: review of the epidemiologic literature J Natl Cancer Inst 91:31731 23 Harjes C.E., Rocheford T.R., Bai L., Brutnell T.P., Kandianis C.B., Sowinski S.G., Stapleton A.E., Vallabhaneni R., Williams M., Wurtzel E.T., Yan J., Buckler E.S (2008) Natural genetic variation in lycopene epsilon cyclase tapped for maize biofortification Science 319:330-3 DOI: 319/5861/330 [pii] 10.1126/science.1150255 24 Johnson E.A., Schroeder W.A (1996) Microbial carotenoids Adv Biochem Eng Biotechnol 53:119-78 25 Joseph Hirschberg M.C., Mark Harker, Tamar Lotan, Varda Mann and Iris Pecker (1997 ) Molecular genetics of the carotenoid biosynthesis pathway in plants and algae Pure and Applied Chemistry 69:10 26 Kim S.W., Jung W.H., Ryu J.M., Kim J.B., Jang H.W., Jo Y.B., Jung J.K., Kim J.H (2008) Identification of an alternative translation initiation site 45 27 28 29 30 31 32 33 34 for the Pantoea ananatis lycopene cyclase (crtY) gene in E coli and its evolutionary conservation Protein Expr Purif 58:23-31 DOI: S10465928(07)00276-8 [pii]10.1016/j.pep.2007.11.004 La Rocca N., Rascio N., Oster U., Rudiger W (2007) Inhibition of lycopene cyclase results in accumulation of chlorophyll precursors Planta 225:1019-29 DOI: 10.1007/s00425-006-0409-7 Lee P.C., Schmidt-Dannert C (2002) Metabolic engineering towards biotechnological production of carotenoids in microorganisms Appl Microbiol Biotechnol 60:1-11 DOI: 10.1007/s00253-002-1101-x Lenore Arab, Steck S (2000) Lycopene and cardiovascular disease Am J Clin Nutr 71:1691S-5S; discussion 1696S-7S Linden H., Misawa N., Saito T., Sandmann G (1994) A novel carotenoid biosynthesis gene coding for zeta-carotene desaturase: functional expression, sequence and phylogenetic origin Plant Mol Biol 24:369-79 Lu Q.Y., Hung J.C., Heber D., Go V.L., Reuter V.E., Cordon-Cardo C., Scher H.I., Marshall J.R., Zhang Z.F (2001) Inverse associations between plasma lycopene and other carotenoids and prostate cancer Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10:749-56 Misawa N., Nakagawa M., Kobayashi K., Yamano S., Izawa Y., Nakamura K., Harashima K (1990) Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli J Bacteriol 172:6704-12 Mukoyama D., Takeyama H., Kondo Y., Matsunaga T (2006) Astaxanthin formation in the marine photosynthetic bacterium Rhodovulum sulfidophilum expressing crtI, crtY, crtW and crtZ FEMS Microbiol Lett 265:69-75 DOI: FML471 [pii]10.1111/j.1574-6968.2006.00471.x Ribaya-Mercado J.D., Maramag C.C., Tengco L.W., Dolnikowski G.G., Blumberg J.B., Solon F.S (2007) Carotene-rich plant foods ingested with minimal dietary fat enhance the total-body vitamin A pool size in Filipino schoolchildren as assessed by stable-isotope-dilution methodology Am J Clin Nutr 85:1041-9 DOI: 85/4/1041 [pii] 46 35 Sandmann G (1994) Carotenoid biosynthesis in microorganisms and plants Eur J Biochem 223:7-24 36 Schmidt-Dannert C., Umeno D., Arnold F.H (2000) Molecular breeding of carotenoid biosynthetic pathways Nat Biotechnol 18:750-3 DOI: 10.1038/77319 37 Tran Thi Huyen Nga L.V.Q., Ha Thi Bich Ngoc, Nguyen Van Mui (2006) Study of β- carotene from some vegetation in Vietnam VNU, Journal of Science, Nat., Sci., & tech., T.XXIII No3 CAP:239 -244 38 Vershinin A (1999) Biological functions of carotenoids diversity and evolution Biofactors 10:99-104 39 Yu B., Lydiate D.J., Young L.W., Schafer U.A., Hannoufa A (2008) Enhancing the carotenoid content of Brassica napus seeds by downregulating lycopene epsilon cyclase Transgenic Res 17:573-85 DOI: 10.1007/s11248-007-9131-x 40 Yu Q., Schaub P., Ghisla S., Al-Babili S., Krieger-Liszkay A., Beyer P (2010) The lycopene cyclase crtY from Pantoea ananatis (formerly Erwinia uredovora) catalyzes an FADred-dependent non-redox reaction J Biol Chem 285:12109-20 DOI: M109.091843 [pii]10.1074/jbc.M109.091843 XÁC NHẬN CỦA THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI [...]... : Xác định trình tự gene crtY và so sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng gene quốc tế + Xác định trình tự gene bằng phương pháp giải trình tự tự động + So sánh trình tự gene crtY với trình tự đã công bố trên ngân hàng gene quốc tế thông qua chương trình BLAST 18 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Quy trình tách dòng gene crtY từ Pantoea ananatis Trình tự gene đã công bố PCR Mồi đặc hiệu nhân gene. .. phương pháp thôi gel Gắn gene vào vector tách dòng pLUG Biến nạp vào vi khuẩn Ecoli chủng DH5α Cấy trải trên môi trường chọn lọc Chọn lọc dòng mang gene cần chuyển Tách DNA plasmid Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạnHindIII Xác định trình tự gene bằng phương pháp giải trình tự tự động So sánh trình tự bằng phần mềm Blast Hình 3 2: Quy trình tách dòng và xác định tự gene crtY 19 3.4.2... di - Agarose - Dung dịch TE 1X • Hóa chất tách plasmid - Bể ổn nhiệt Multi temp III - Máy ly tâm thường Mikro22Hettich.2entrifugen - Máy PCR AB - Tủ nuôi 370C OF-22 - Máy xác định trình tự DNA tự động 3130 Genetic Analyzer - Máy chụp ảnh gel CLS-Microdoc - Máy soi gel Carestrealth IN - Mồi (10 pm/µl) - Taq-polymerase (5U/µl) - H2O - Đệm tra mẫu DNA - Ethidium bromide 15 Sol I : Glucose : 50 mM Tris-HCl... Pantoea ananatis trong điều kiện nhân tạo - Xác định trình tự gene crtY đã phân lập và so sánh trình tự gene này với các trình tự gene đã công bố trên ngân hành gene quốc tế 3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm : Phòng Sinh học phân tử và Kỹ thuật di truyền - viện Khoa hoc sự sống - Đại học Thái Nguyên - Tổ 10 - Xã Quyết Thắng - TP Thái Nguyên Thời gian : Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2009... gel trên máy chụp ảnh gel CLS-Microdoc và phân tích kết quả 3.4.8 Phương pháp xác định trình tự gene crtY bằng máy tự động Trình tự nucleotide của gene crtY được xác định bằng phương pháp xác định trình tự gene tự động trên máy xác định trình tự gene của hãng Applied Biosystems Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger có sử dụng 4 loại deoxynucleotide và 4 loại dideoxynucleotide Trong... Lê, 2008) Nghiên cứu tác động sinh học của carotenoids và chất flavonoid từ lá của một số loài Camellia vàng (Do Xuan Hoan, 2007), … Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về tách dòng và xác định trình tự các gene mã hóa cho enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp các carotenoid cũng như các nghiên cứu về tổng hợp carotenoid từ vi sinh vật 14 Phần III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1... màu nhận được, máy sẽ tự động ghi lại và chuyển các tín hiệu màu thành trình tự nucleotide tương ứng Hình 3 3: cấu trúc của deoxynuclotide và dideoxynuclotide 3.4.9 Phương pháp so sánh trình tự gene crtY với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gene quốc tế 27 Gene crtY sau khi xác định trình tự được so sánh với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gene quốc tế thông qua chương trình BLAST trên NCBI... Tris-HCl (pH=8) : 10 mM EDTA (pH=8) : 1mM • Một số hóa chất sử dụng trong tách dòng gene - Cặp mồi khuếch đại gene crtY Chúng tôi sử dụng một cặp mồi để nhân đoạn gene crtY Trình tự mồi được thiết kế dựa trên trình tự gene công bố trên ngân hàng gene NCBI với mã số D90087.2 Cặp mồi được đặt làm từ hãng Invitrogen Trình tự và thông tin về cặp mồi được thể hiện qua bảng 3.1 Bảng 3 1 : Trình tự và thông... mồi Trình tự mồi crtY-F 5’TGAATTCAGGAGGTGTCTTAAATGGGAGCGGCTAT3’ crtY-R 5’GCAAGCTT TTAACGATGAGTCGTCATAATGG3’ - Vector tách dòng pLUG® TA-cloning (Intronbiotechnology) Vector tách dòng pLUG® TA-cloning là một trong những vector được sử dụng phổ biến trong tách dòng gene hiện nay Vector pLUG® TA-cloning có kích thước 2982bp, cấu trúc của vector được thiết kế gồm một gene kháng kháng sinh Amp và một gene. .. al., 1990) Gene crtY mã hóa cho enzyme lycopene cyclase tham gia chuyển hóa lycopene thành ß-carotene (hình 1.1) có chiều dài 1161bp với một bộ ba mã mở đầu ATG và bộ ba mã kết thúc ATT đã được xác định trình tự nucleoid và công bố trên ngân hàng gene NCBI với mã số D90087.2 2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới 2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được