TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -  - - - NGUYỄN NGỌC SƠN Nguyễn Ngọc Sơn TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học (IBT) Thái Nguyên - 2009 Thái Nguyên – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố Tác giả Nguyễn Ngọc Sơn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Trung Nam (Viện Công nghệ Sinh học) tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành công trình nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS TS Lê Trần Bình, TS Chu Hoàng Hà, TS Nguyễn Hữu Cường, KS Hoàng Thị Thu Hằng tập thể cán Phòng Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm đồng thời hỗ trợ suốt thời gian thực nghiệm hoàn thành khóa luận Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Nguyễn Như Cường (Viện Bảo vệ Thực vật) chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu đặc tính sinh học virut gây bệnh môi giới truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, biện pháp quản lý tổng hợp trồng (ICM) sản xuất lúa” cung cấp mẫu bệnh cộng tác trình thực công trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, thày cô giáo, cán Khoa truyền đạt kiến thức tạo điều kiện cho thực khóa luận Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tác giả luận văn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 11 1.1.1 Thế giới 11 1.1.2 Việt Nam 12 1.2 TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL 13 1.3 ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA 14 1.3.1 Virut vàng lùn lúa (RGSV) 14 1.3.2 Các loại virut khác 16 1.3.2.1 Virut lùn xoắn lúa (RRSV) 16 1.3.2.2 Virut tungro hình cầu (RTSV) 17 1.3.2.3 Virut tungro hình nhộng (RTBV) 18 1.4 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU TRUYỀN BỆNH VL&LXL 19 1.4.1 Đặc điểm hình thái 19 1.4.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái gây hại 19 1.5 PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL 20 1.6 MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT 21 1.6.1 Một số enzym sử dụng sinh học phân tử 21 1.6.2 Kỹ thuật RT-PCR 22 1.6.3 Kỹ thuật PCR 23 1.6.4 Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli 24 1.6.5 Kỹ thuật tách dòng gen 24 1.6.6 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) 25 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 VẬT LIỆU 26 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM 27 2.2.1 Hóa chất 27 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.2 Thiết bị 27 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 27 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.3.1 Thu mẫu thí nghiệm 27 2.3.2 Thiết kế mồi đặc hiệu 28 2.3.3 Tách chiết RNA tổng số virut lúa 28 2.3.4 Phản ứng RT-PCR 29 2.3.5 Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) 29 2.3.6 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt 30 2.3.7 Colony-PCR 31 2.3.8 Tách chiết plasmit 32 2.3.9 Cắt gen enzym giới hạn 32 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 THIẾT KẾ MỒI 34 3.2 TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV 34 3.2.1 RT-PCR 34 3.2.2 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 37 3.2.3 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp colony-PCR 37 3.2.4 Tách plasmit cắt kiểm tra có mặt gen 39 3.3 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV 40 3.4 SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 53 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT µg microgram µl microlitre µm micrometer bp base pair cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên mã ngƣợc từ RNA thông tin) CS Cộng CLRRI Cuulong Delta Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa đồng sông Cửu Long), http://www.clrri.org CP/NCP Coat protein/Nucleocapsid Protein (Protein vỏ) Đ/c Đối chứng ĐBSCL Đồng sông Cửu Long DEPC Diethyl pyroCarbonate DNA Deoxyribonucleic acid DPV Description of Plant Viruses (Miêu tả virus thực vật), http://www.dpvweb.net EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễm dịch liên kết với enzym) g gram ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban quốc tế phân loại virus) ICTVdB The Universal Virus Database of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Ngân hàng liệu virus ICTV), http://www.ictvdb.rothamsted.ac.uk IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu Lúa quốc tế), http://www.irri.org Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Kb Kilobase LB Luria Bertani M Nồng độ mol/lit ml mililitre mm milimeter NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia thông tin Công nghệ Sinh học), http://www.ncbi.nlm.nih.gov ng Nanogram Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng để nhân số đoạn genome RGSV… 34 nm Nanometer Bảng 3.2 Mã số đăng ký GenBank trình tự thu đƣợc 41 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PEG Polyethylene glycon RdRp RNA dependent RNA polymerase (Enzym nhân RNA tạo phân tử RNA) Bảng 3.3 Hệ số tƣơng đồng sai khác trình tự nucleotit gen CPRGSV Bình Thuận, Ninh Thuận với trình tự tƣơng ứng tỉnh ĐBSCL giới (GenBank) 42 RGSV Rice grassy stunt virus (Virut vàng lùn lúa) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RRSV Rice ragged stunt virus (Virut lùn xoắn lúa) RSV Rice stripe virus RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên mã ngƣợc) RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virut tungro hình nhộng) RTSV Rice tungro spherical virus (Virut tungro hình cầu) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi 13 Hình 1.2 RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 15 Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc gen RGSV 16 17 RWSV Rice wilted stunt virus (Virut héo lùn lúa) Hình 1.4 RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử TAE Tris - Acetate – EDTA Hình 1.5 RTSV RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 18 Taq Thermus aquaticus Hình 1.6 Các giai đoạn phát triển rầy nâu 19 v/p vòng/phút Hình 2.1 Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL Nam Trung Bộ 26 vcRNA viral complementary RNA (đoạn RNA bổ sung virus) 30 Vàng lùn, lùn xoắn Hình 2.2 Sơ đồ vectơ pBT VL&LXL vRNA viral RNA (đoạn RNA virus) Hình 3.1 Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn RGSV từ mẫu tỉnh Bình Thuận cặp mồi RNA1-RGSV RNA4-RGSV 35 X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Hình 3.2 Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP RGSV cặp mồi CP-RGSV 36 Hình 3.3 Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP RGSV cặp mồi CP-RGSV 36 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.4 Khuẩn lạc E.coli DH5α mang vectơ tái tổ hợp dòng CP RGSV tỉnh Bình Thuận môi trƣờng LB đặc 37 Hình 3.5 Điện di sản phẩm colony-PCR dòng RGSV cặp mồi pUC 18 38 Hình 3.6 Điện di sản phẩm colony-PCR từ dòng phân đoạn RGSV cặp mồi pUC 18 38 Hình 3.7 Điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP RGSV BamHI 39 Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt plasmit mang phân đoạn RGSV Bình Thuận BamHI 40 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại xây dựng việc so sánh trình tự 02 gen CP- RGSV Nam Trung Bộ (NT, BT) với trình tự tƣơng ứng ĐBSCL giới đƣợc đăng ký vào GenBank 43 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Lúa gạo nguồn lƣơng thực giàu chất dinh dƣỡng chủ yếu giới, đứng thứ ba sau ngô lúa mì sản lƣợng, cung cấp 20% calo, 15% protein, chất khoáng chất xơ cho ngƣời Năm 2009, Việt Nam dự kiến tiếp tục đứng thứ hai giới xuất gạo (khoảng 5,3 triệu tấn/năm) tổng sản lƣợng đạt khoảng 36 triệu tấn/năm [62] Khoảng 52% diện tích lúa đƣợc trồng ĐBSCL Khi đánh giá thành tựu đạt đƣợc nghiệp đổi kinh tế Việt Nam, nhà kinh tế giới thống nhận định: Thành công lớn nông nghiệp lúa lƣơng thực quan trọng bậc Việt Nam Tuy nhiên, sản lƣợng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bệnh virut rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt bệnh VL&LXL xảy thời gian gần Bệnh tổ hợp từ đến bốn loại virut gây ra, gồm virut vàng lùn lúa (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV), virut lùn xoắn lúa (Rice Ragged Stunt Virus- RRSV), virut tungro hình cầu (Rice Tungro Spherical VirusRTSV) virut tungro hình nhộng (Rice tungro bacilliform virus- RTBV) [8], [43], [48], [59] Trong số trƣờng hợp, lúa bị nhiễm lúc đến loại virut Trong đó, RGSV thƣờng chiếm tỷ lệ cao Từ năm 2006 đến dịch bệnh lại phát triển rộng tỉnh ĐBSCL với diện tích nhiễm lớn Do ảnh hƣởng dịch bệnh lúa, năm 2009 Việt Nam có nguy tiếp tục bị giảm sản lƣợng gạo xuống triệu so với năm 2008 [12] Rất nhiều thành tựu đạt đƣợc nghiên cứu biện pháp phòng chống rầy nâu- môi giới chủ yếu truyền bệnh VL&LXL nhƣ: nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh thái học rầy nâu, biện pháp phòng trừ thuốc hóa học, sinh vật học, kỹ thuật canh tác, giống kháng Tuy nhiên, hiệu phƣơng pháp chƣa cao Do dịch bệnh VL&LXL gây hại nặng nề sản lƣợng lúa gạo cho tỉnh ĐBSCL [7] có nguy lây lan khu vực lân cận, nên nhiệm vụ cấp bách phải kiểm tra có mặt chủng virus gây bệnh khu vực Nam Trung Bộ, nơi có diện tích trồng lúa lớn tiếp giáp với ĐBSCL Đồng thời, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 11 đánh giá độ tƣơng đồng di truyền chủng virut gây bệnh, góp phần vào việc đề biện pháp đối phó kịp thời với dịch bệnh khu vực miền Trung Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Với lí trên, tiến hành đề tài : “Tách dòng xác định trình tự nucleotit số đoạn genome virut vàng lùn lúa (RGSV) Việt Nam” 1.1 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Mục tiêu 1.1.1 Thế giới Phân lập so sánh trình tự nucleotit số đoạn genome virut vàng lùn lúa (RGSV) Từ thập kỷ 70 kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) lên nhƣ vấn đề thời nghề trồng lúa Châu Á Nhiều trận dịch rầy xảy quy mô rộng lớn chƣa thấy nhiều nƣớc nhƣ Ấn Độ, Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan gây tổn thất nặng nề kinh tế [17] Rầy nâu phá hại làm giảm phần suất, cháy rầy làm trắng Ngoài tác hại trực tiếp, rầy nâu môi giới truyền bệnh virut nguy hiểm cho lúa nhƣ bệnh VL&LXL, bệnh héo lùn lúa Trung Quốc bệnh vàng lúa vùng núi phía Bắc Việt Nam Theo thống kê Dyck Thomas (1979) thiệt hại rầy nâu bệnh vàng lụi Châu Á năm 1966 – 1975 lên tới 300 triệu USD [22] Nội dung nghiên cứu 1> Tách dòng, xác định trình tự số đoạn genome chủng RGSV 2> So sánh trình tự nucleotit gen CP- RGSV thu đƣợc với trình tự tƣơng ứng GenBank để đánh giá độ tƣơng đồng mặt di truyền chủng virut Năm 1966, RGSV lần đƣợc phát Nam Đông Nam châu Á [43] Năm 1977, dạng héo lùn RWSV xuất vụ mùa thứ hai Đài Loan, biểu lúa bệnh hình thái, cấu tạo RWSV tƣơng tự RGSV [20] Năm 1974 – 1977, khoảng 1,2 triệu lúa Indonesia bị nhiễm rầy virut, gây thiệt hại 03 triệu thóc [40] Năm 1992 – 1993 vụ mùa giống SP60 Thái Lan bị tác hại rầy nâu [50] Rầy nâu mang loại virut gây bệnh lúa nhƣ RGSV RRSV, nên có nguy gây “cháy rầy” làm giảm đáng kể suất trồng Hai phƣơng pháp truyền thống đƣợc sử dụng để bảo vệ lúa phun thuốc trừ sâu dùng giống kháng rầy Dùng thuốc trừ sâu hóa học đắt, độc hại ô nhiễm môi trƣờng, biện pháp trồng lúa mang gen kháng rầy thông qua lai giống đƣợc nghiên cứu áp dụng rộng rãi Tinjuangjun CS (2000) chuyển gen gna thành công vào hai giống gạo Thái Lan Khao Dawk Mali 105 (KDML 105) Supanburi 60 (SP60), 37% số lƣợng rầy giảm gna biểu promoter RSs1 42% gna biểu promoter Ubi-1 [50] Tuy nhiên, việc trồng lúa mang gen kháng rầy gặp trở ngại thay đổi đặc điểm thích nghi nhanh chóng rầy nâu Tại Hội nghị quốc tế rầy nâu họp IRRI- Philippin (05/1977), Việt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 13 Nam (11/2001), Trung Quốc (11/2002) Việt Nam (04/2006), rầy nâu đƣợc coi mối đe dọa thƣờng xuyên sản xuất lúa Châu Á [41], [61] Liêu, Tiền Giang, Trà Vinh, Bình Thuận; Vụ Thu Đông 18.747 Vĩnh Long, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bình Phƣớc, Trà Vinh, Hậu Giang, Tây Ninh Diện tích nhiễm VL&LXL vụ Hè Thu 68 chủ yếu hai tỉnh Đồng Nai Bình Thuận [12] 1.1.2 Việt Nam Bệnh VL&LXL lúa đƣợc ghi nhận sớm Mỹ Tho Long An vào năm 1963 Tại miền Bắc, bệnh đƣợc ghi nhận năm 1964, 1966 1970 giống Mộc Tuyền với diện tích lớn (khoảng 50.000 ha) [8] Bệnh xuất gây thiệt hại 20.000 vụ Hè Thu 1990 vùng ven biển miền Trung nhƣ Bình Định, Phú Yên Khánh Hoà Năm 1999 có 13.120 lúa bị nhiễm tỉnh Bến Tre, TPHCM, Bạc Liêu Long An, riêng TPHCM có 242 bị bệnh không trổ đƣợc [9] Đầu vụ Hè Thu 2006 dịch bệnh lại phát triển lan rộng hầu hết tỉnh ĐBSCL, với mật số rầy nâu cao, diện tích bị nhiễm bệnh vàng lụi riêng Đồng Tháp với thiệt hại dƣới 30% 613 ha, 30% 2636 tiêu huỷ khoảng 500 [54] Cuối năm 2006, dịch bệnh VL&LXL đƣợc công bố ĐBSCL miền Đông Nam Bệnh VL&LXL lây lan lúa vụ Thu Đông vụ Đông Xuân tỉnh vùng ĐBSCL, Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ Tây Nguyên Theo báo cáo địa phƣơng, đến tháng 10 năm 2006, diện tích lúa vụ Thu Đông 2006 vụ Đông Xuân 2006- 2007 bị nhiễm rầy nâu tỉnh vùng ĐBSCL Đông Nam 33.323 ha, diện tích nhiễm bệnh VL&LXL 51.768 ha, có 26.283 nhiễm bệnh nặng cần phải tiêu huỷ [1] Cũng năm 2006, Rogelio Cabunagan (IRRI) chuyên gia Việt Nam thực tế đồng lúa Trà Vinh, Long An, Bình Chánh (TPHCM), Bình Phƣớc, Đồng Nai, Tiền Giang quan sát thấy lúa có dấu hiệu bị bệnh VL&LXL xuất nhiều rầy nâu gây tƣợng “cháy rầy” Qua xét nghiệm phƣơng pháp ELISA dƣơng tính với kháng thể đặc hiệu RGSV RRSV khẳng định tỉ lệ nhiễm RGSV, RRSV cao, đồng thời có xuất RTSV [56] Năm 2008, dịch rầy nâu bệnh virut hại lúa có giảm so với năm trƣớc nhƣng mức nghiêm trọng Lúa Hè Thu khu vực ĐBSCL, diện tích bị nhiễm rầy nâu: 76.795 ha, có 4.298 bị nhiễm nặng Diện tích bị nhiễm bệnh VL&LXL vụ Hè Thu 206 ha, tập trung lúa hè thu giai đoạn đòng trổ, diện tích nhiễm nhẹ 55 (tỉ lệ bệnh từ 5-10%), nhiễm trung bình 13 (tỉ lệ bệnh 10-20%), nhiễm nặng 138 (tỉ lệ bệnh 20-50%) [11] Năm 2009, dịch rầy nâu bệnh VL&LXL xảy nhiều vùng với diện tích lớn Tính đến tháng 08/2009 tỉnh phía Nam diễn tích nhiễm rầy vụ Hè Thu 87.246 tập trung tỉnh Kiên Giang, Long An, Sóc Trăng, Bạc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.2 TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL Triệu chứng ban đầu chƣa thấy rõ bệnh lúa bình thƣờng Bụi lúa bệnh ngã màu xanh nhạt, có màu vàng đến cam Thời gian sau lúa bệnh phát triển (lúc dễ nhầm lẫn với tƣợng dinh dƣỡng nên nông dân thƣờng bón thêm phân đạm) [8] Lúa nhiễm bệnh giai đoạn non thƣờng lùn, mọc nhiều chồi có thẳng đứng Các bệnh thƣờng ngắn, hẹp, có màu nhạt, có nhiều đốm nhỏ màu nâu với hình dạng không cố định [32],[43] Các non mọc sau bị nhiễm bệnh thƣờng bị sọc loang lổ, nhiên lúa xanh bình thƣờng đƣợc cung cấp đủ phân đạm [32] Nhìn toàn cảnh thấy lúa hồi xanh không sau cấy, hẹp dựng đứng, có màu vàng, mềm rũ có màu xanh đậm có nhiều đốm màu rỉ sắt (Hình 1.1) Hình 1.1 Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi “Nguồn: http://www.vaas.org.vn/” Thời kỳ đẻ nhánh, bụi lúa bệnh đẻ nhiều nhánh, bụi lúa to hơn, có chiều cao tƣơng đƣơng với bụi khác, chƣa khác biệt [64] Càng sau nhìn toàn cảnh thấy lúa phát triển không bụi lúa bị bệnh không phát triển chiều cao, cuối bụi lúa bệnh khô lụi dần nhƣ cháy rầy chòm Cây lúa bệnh có nhƣng hạt bị đen lép Triệu chứng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 14 15 tồn lâu sau phát bệnh [26] Lúa trƣởng thành bị nhiễm bệnh có bị vàng, bị nâu hạt lép [43] 1.3 ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA 1.3.1 Virut vàng lùn lúa (RGSV) năm vừa qua Thể virut bao gồm nhiều đoạn vRNA, vcRNA, protein vỏ virut, vài phân tử RdRp [35] Thể virut khó đƣợc quan sát thấy dịch trích thực vật dƣới kính hiển vi điện tử Thể virut sau đƣợc ly trích có dạng sợi dài 2µm rộng 6- nm đƣợc quan sát cách nhuộm uranyl acetate [16], [29] (Hình 1.2) Virut vàng lùn lúa đƣợc phát chủ yếu lúa Oryza sativa [25], [43] có tên khoa học Rice grassy stunt virus (RGSV), thuộc chi Tenuivirus [57] Virut phân bố nhiều nƣớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, gây thiệt hại kinh tế đáng kể Các chủng RGSV gây vàng lá, mầu chết đƣợc phát năm 1977 Đài Loan [19], năm 1982- 1983 Philippin Thái Lan [25], năm 1984 Ấn Độ [33] Ngoài ra, virut phân bố nƣớc châu Á khác nhƣ Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Sri Lanka, Trung Quốc, Việt Nam [8], [9], [19], [51] RGSV ký sinh chủ yếu loài lúa Oryza spp rầy Nilaparvata spp Vì nói Nilaparvata spp vectơ truyền bệnh cho lúa [31] Thất thu suất RGSV thƣờng khó đƣợc tính toán xác thiệt hại virut thƣờng đƣợc tách biệt rõ ràng với thiệt hại rầy nâu virut lùn xoắn (RRSV- đƣợc truyền rầy nâu) [40] Trong năm 1974- 1977, có tổng cộng 1,2 triệu lúa Indonesia bị nhiễm rầy nâu virut vàng lùn lúa Sự thất thu suất hai loài dịch hại gây nên khoảng 03 triệu lúa [40] RGSV không đƣợc truyền qua hạt lúa bệnh qua phấn hoa [31] Virut không đƣợc truyền cách tiếp xúc lúa khoẻ mạnh với lúa bệnh, qua lây bệnh tay Virut đƣợc truyền rầy nâu (Nilaparvata lugens) số loài rầy khác (N bakeri, N muiri) [28], [43] Virut đƣợc truyền dạng bền vững qua tuổi rầy nhân mật số rầy ký chủ, nhƣng không đƣợc truyền qua trứng rầy [36] Rầy nâu nhiễm bệnh truyền virut lúc chết Kể từ năm 1984, RGSV thƣờng xuất gây thiệt hại châu Á Mặc dù không đƣợc báo cáo nhiều, xuất RGSV có lẽ thay đổi khả truyền bệnh quần thể rầy nâu Tại Philippin, tỉ lệ rầy nâu lấy truyền RGSV thay đổi từ 3- 5% trƣớc năm 1977 [32] sang 0- 15% năm 1984 [26] Từ ta giả thiết khả bùng phát dịch RGSV miền Nam Việt Nam thay đổi khả truyền bệnh rầy nâu: tỉ lệ rầy có khả lấy truyền virut tăng lên đáng kể quần thể rầy nâu vùng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 1.2 RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử Thanh đen dài 100 nm “Nguồn: DPV” Lúa bị nhiễm virut có nhiều bó sợi đƣợc quan sát nhân tế bào chất thể có màng bao bọc diện phần tế bào chất tế bào diệp lục [20] Các thể hình ống kèm với hạt có đƣờng kính 25 nm đƣợc tìm thấy tế bào mạch rây lúa bệnh [47] Các hạt 25 nm tƣơng tự xuất dƣới dạng mảng kết tinh thể béo khí quản rầy nâu nhiễm virut [43] RGSV có đoạn RNA khác nhau, với tổng chiều dài gen RGSV khoảng 25 kb (Hình 1.3) [21], [32] Cả đoạn RNA lƣỡng tính (ambisense, mã hoá protein theo chiều dƣơng chiều bổ sung phân tử RNA) mang đoạn mã kết thúc dài 17 nucleotit tƣơng tự Các đoạn mã kết thúc có khả tự lại tạo nên cấu trúc hình cán chảo Đoạn mã theo chiều bổ sung đoạn RNA dài (RNA1) chứa ORF mã hoá cho RdRp tƣơng tự nhƣ RdRp RSV, loài chuẩn chi Tenuivirus [35], [38] có 37 ± 9% axit amin giống tổng số 2140 axit amin Tuy nhiên, khác với Tenuivirus khác, RNA1 RGSV có thêm ORF ngắn có chiều dƣơng gần đầu 5’ Hai protein dự đoán đƣợc mã hoá RNA2 tƣơng tự chút với protein đƣợc mã hoá RNA2 Tenuivirus khác Các protein dự đoán đƣợc mã hoá RNA3 RNA4 khác biệt so với protein đƣợc biết Sự khác biệt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 16 17 protein đƣợc mã hoá chuỗi RNA2, 3, cho thấy RGSV khác biệt so với Tenuivirus khác [51] Các đoạn RNA1, 2, 5, RGSV theo thứ tự tƣơng đƣơng với RNA1, 2, 3, RSV Protein vỏ RGSV đƣợc mã hoá đoạn mã theo chiều bổ sung với RNA5 [21] Thể virut RRSV có dạng hình cầu, bao gồm vỏ, phần trung tâm, phức hợp nucleoprotein Vỏ virut màng bao mang nhiều thành phần nhỏ tạo thành gai (Hình 1.4) Vỏ virut có 12 gai dạng “B” dài – 10 nm, rộng 23- 26 nm phần chân đế 14- 17 nm phần [36] Thể virut có nhiều tế bào chất tế bào nhu mô mạch rây thƣờng liên kết với tạo thành sợi dài Virut không đƣợc phát mô khác [48] Khi bị nhiễm virut, tế bào nhu mô mạch rây nhân lên phình ra, tạo thành u sần bẹ [26] RRSV có 10 đoạn RNA sợi đôi khác [59] A B Hình 1.4 RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc gen RGSV Các đen hình sợi tƣợng trƣng cho RNA với chiều dài đƣợc xác định Các mũi tên đen tƣợng trƣng cho sản phẩm protein Chiều mũi tên chiều trình dịch mã để tạo chuỗi polypeptide “Nguồn: Hồ Xuân Thiện, 2006” 1.3.2 Các loại virut khác 1.3.2.1 Virut lùn xoắn lúa (RRSV) Bệnh lùn xoắn lúa đƣợc miêu tả năm 1977 [48] Bệnh xuất chủ yếu loài lúa Oryza spp đƣợc gây virut có tên khoa học Rice ragged stunt virus (RRSV), thuộc chi Oryzavirus, họ Reoviridae [58] (A): Thể virut với protein gai dạng B “nguồn http://www.iah.bbsrc.ac.uk”.; (B): Các thể virut liên kết lại tạo thành sợi dài, xem uranyl acetate, đen dài 50 nm “Nguồn: DPV” 1.3.2.2 Virut tungro hình cầu (RTSV) Virut tungro hình cầu có tên khoa học Rice tungro spherical virus (RTSV), chi Waikavirus, thuộc họ Sequiviridae [27] RTSV phân bố loài lúa Oryza spp hầu hết nƣớc trồng lúa vùng Nam Đông Nam Á RTSV phân bố quốc gia khác nhƣng không đƣợc phát virut thƣờng không gây triệu chứng bệnh Sự phân bố RTSV có lẽ liên quan lớn đến phân bố côn trùng truyền bệnh [59] RRSV xuất nhiều nƣớc trồng lúa châu Á nhƣ Ấn Độ, Bangladesh, Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Philippin, Sri Lanka, Thái Lan, Trung Quốc [60], Việt Nam RRSV virut quan trọng gây thiệt hại kinh tế đáng kể Virut không đƣợc truyền qua hạt lúa bệnh [20] Virut không đƣợc truyền qua phấn hoa, qua chủng bệnh tay, qua tiếp xúc lúa khoẻ mạnh với lúa bệnh [60] Rầy nâu Nilaparvata lugens tác nhân truyền bệnh đƣợc biết [18], [48] RTSV kết hợp với RTBV gây nên bệnh Tungro [14] Đây bệnh hại lúa gây thiệt hại kinh tế lớn với thiệt hại ƣớc tính hàng năm vùng Đông Nam Á lên đến 1,5 tỉ USD [24] RTSV không đƣợc truyền qua hạt lúa bị bệnh Virut không đƣợc truyền qua chủng bệnh tay tiếp xúc lúa lành với lúa bị bệnh RTSV có tác dụng nhƣ loài giúp đỡ cho RTBV việc truyền côn trùng [42] RTSV đƣợc truyền dƣới dạng bán bền số loài rầy xanh Loài rầy truyền bệnh chủ yếu RTSV vùng Đông Nam Á rầy xanh đuôi đen Nephotettix virescens (tên khác N impicticeps) [47], [59] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn 26 27 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Hóa chất - Các cặp mồi dùng để tách dòng gen mã hóa protein vỏ phân đoạn khác đƣợc tổng hợp hãng Invitrogen (Mỹ) Các hóa chất sinh học phân tử thiết bị đƣợc hãng tiếng nhƣ Fermentas (Đức), QIAGEN (Đức), Invitrogen (Mỹ), BIONEER (Hàn Quốc) cung cấp 2.1 VẬT LIỆU - Vật liệu thực vật sử dụng nghiên cứu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL đƣợc thu từ tỉnh đại diện có tỷ lệ nhiễm bệnh từ trung bình đến cao khu vực Nam Trung Bộ, tỉnh thu mẫu từ 2- địa điểm khác (Hình 2.1) - Thang DNA chuẩn (Fermentas, Invitrogen) - QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) - Bộ hóa chất sử dụng cho RT-PCR (Invitrogen- Super ScriptTM III OneStep RT-PCR system with Platinium® Taq High Fidelity) (Invitrogen) - Kit tinh DNA (QIAquick Gel Extraction Kit- QIAGEN) - Kit tách tinh plasmit (QIAprep Spin Miniprep- QIAGEN) STT Tên tỉnh thu mẫu Ký hiệu mẫu Bình Định BĐ Phú Yên PY Khánh Hòa KH Ninh Thuận NT Bình Thuận BT - Các hóa chất thông dụng khác nhƣ: Ampicillin, IPTG, X-gal, agarose, (Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech) - Các hóa chất cho phản ứng PCR, H2O khử DEPC - Vectơ pBT (Viện Công nghệ Sinh học) 2.2.2 Thiết bị Máy ly tâm, máy soi gel, điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet man, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động trang thiết bị khác 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu - Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam - Phòng thí nghiệm Di truyền học Công nghệ gen, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên Hình 2.1 Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL Nam Trung Bộ 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Thu mẫu thí nghiệm Mẫu lúa đƣợc thu địa phƣơng nghi có tƣợng nhiễm bệnh, chuyên gia địa phƣơng trực tiếp dẫn thu mẫu Mẫu lúa đƣợc thu lúa có nhiều biểu khác biệt so với bên cạnh: vàng, xoắn, lùn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 28 29 bình thƣờng Mẫu lúa đƣợc chứa ống khử trùng bảo quản điều kiện -840C đến sử dụng 10.000v/p 10 phút, bỏ dịch nổi, thu tủa; Rửa tủa cách bổ sung 700µl ethanol 70%, ly tâm 7000v/p phút (lặp lại lần), làm khô pha loãng RNA nƣớc khử DEPC 0,01%; Cất mẫu -840C 2.3.2 Thiết kế mồi đặc hiệu Quy trình thiết kết mồi đƣợc thực theo bƣớc sau i) Thu thập trình tự gen quan tâm từ Ngân hàng gen (GenBank); ii) Sử dụng phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết kế đoạn primer đặc hiệu cho đoạn gen quan tâm i) Thu thập trình tự gen quan tâm từ GenBank: Trƣớc thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho gen trình tự cần phân lập chủng virut nghiên cứu (Ví dụ: trình tự gen CP RGSV), trình tự đoạn gen đƣợc thu thập từ GenBank địa www.ncbi.nlm.nih.gov [63] Trình tự đoạn gen quan tâm tìm kiếm thông qua tên gen số hiệu gen đƣợc đăng kí ngân hàng gen Sau có đƣợc trình tự gen quan tâm, đoạn primer đƣợc thiết kế việc sử dụng chƣơng trình thiết kế ii) Sử dụng phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết kế đoạn primer đặc hiệu cho đoạn gen quan tâm Chƣơng trình Primer3 đƣợc đăng kí địa http://www.bioinformatics.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi [67] Trong trình thiết kế mồi cần vào một số điểm sau: Mồi phải có độ đặc hiệu hiệu suất khuếch đại cao Cố gắng chọn trì nh tƣ̣ mồi có khoảng 50% GC Tm khoảng 56- 620C tạo điều kiện để trình ủ đạt kết tốt Tránh G C đầu 3’ của mồi vì nó có thể làm tăng hội tạo hiện tƣợng primer-dimers (hai primer bắt cặp với ) Tránh chọn vùng có trình tự tƣơng đồng để hạn chế các mồi tƣ̣ gắn với Tính toán nhiệt độ nóng chảy (Tm) primer với tổng số 40C cho GC và 20C cho AT theo công thức T m = 4(G+C) + 2(A+T), sau đó trƣ̀ 50C tƣ̀ giá trị này và chí nh là nhiệt độ ủ (Ta) primer [30], [39] 2.3.3 Tách chiết RNA tổng số virut lúa RNA tổng số từ mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL đƣợc tách chiết theo hƣớng dẫn sử dụng hóa chất trizol reagents Lá lúa (khoảng 200g) đƣợc nghiền nitrogen thành bột mịn; Bổ sung ml trizol reagents, đảo nhẹ nhiệt độ phòng 10 phút; Bổ sung 200 µl chloroform : isoamyl (24:1), đảo nhẹ ly tâm 10.000v/p 10 phút; Hút dịch nổi, kết tủa RNA Isopropanol Ly tâm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.4 Phản ứng RT-PCR - Thành phần: Thành phần phản ứng RT-PCR (one-step) thể tích 25l: 5l đệm RT-PCR 5X; 10pg- 5g RNA tổng số (1l); 75pmol loại mồi đặc hiệu (0,75l); 1l 10mM dNTP mix (10mM loại dATP, dGTP, dTTP dCTP, pH trung tính); 1l hỗn hợp enzym (Reverse transcriptase Taq polymerase); 0,2 l chất ức chế Ribonuclease tái tổ hợp RNase OUTTM (40u/l); Bổ sung nƣớc khử ion đƣợc khử trùng tới thể tích 25l - Chu kỳ nhiệt: Thực phản ứng RT-PCR theo chu kỳ nhiệt sau: bƣớc 1: 500C, 30 phút; bƣớc 2: 950C, 15 phút; bƣớc 3: 940C, 30 giây; bƣớc 4: 530C, 30 giây; bƣớc 5: 720C, phút; từ bƣớc đến bƣớc lặp lại 10 chu kỳ; bƣớc 6: 94 0C, 30 giây; bƣớc 7: 550C, 30 giây; bƣớc 8: 720C, phút; từ bƣớc đến bƣớc lặp lại 30 chu kỳ; bƣớc 9: 720C, 10 phút; bƣớc 10: 40C, bảo quản mẫu Sản phẩm PCR đƣợc điện di gel agarose 1% đệm 1X TAE [45], nhuộm gel dung dịch ethidium bromide gel Kit QIAGEN 2.3.5 Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) Sản phẩm PCR gen quan tâm đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% đƣợc làm theo kit QIAquick Gel Extraction gắn vào vectơ tách dòng pBT (Hình 2.2) Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: - Thôi gel sản phẩm PCR: Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% cắt lấy băng quan tâm, có kích thƣớc khoảng 1kb; bổ sung dung dịch QG theo tỷ lệ: Vmẫu : VQG = : (1mg mẫu tƣơng ứng với 1µl); ủ 500C 10- 15 phút, phút đảo mẫu nhẹ lần, sau gel tan hết ủ thêm phút để đảm bảo gel tan hoàn toàn; chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột gel Qiaquick spin, ly tâm 13.000 v/p phút, loại bỏ dịch chảy qua cột; bổ sung 500µl dung dịch QG, ly tâm 13.000v/p phút; thêm 750µl dung dich PE vào cột, để nhiệt độ phòng phút; ly tâm 13.000 v/p phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung phút để loại bỏ hết dung dịch PE; hòa tan DNA 30- 50µl nƣớc cất dung dịch EB, đƣợc làm ấm đến 500C, để nhiệt độ phòng phút, ly tâm 13.000v/p để thu DNA - Gắn gen vào vectơ: Sản phẩm gel đƣợc gắn vào vectơ pBT với xúc tác T4 ligase Phản ứng gắn dựa vào hình thành mối liên kết photphodieste Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 31 nucleotit Adenin sản phẩm PCR nucleotid Thymin vectơ Các thành phần vectơ pBT đƣợc thể hình 2.2 Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ nhiệt độ phòng 02 để phản ứng xảy hoàn toàn Vectơ tái tổ hợp sau đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α đƣợc cấy trải môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 0,01mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM đặt vào đá phút Bổ sung 700µl môi trƣờng LB lỏng, hỗn hợp đƣợc nuôi 370C, lắc 200v/p Sử dụng que cấy trải, trải 150- 250µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa 0,1mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM Ủ đĩa 370C 16 Thành phần phản ứng gắn gen vào vectơ pBT: Buffer T4 ligase 10X (2µl); DNA (8µl); plasmit pBT (1µl); T4 ligase 2u/µl (1µl); H2O (8µl) Tổng thể tích 20µl Sau nuôi khuẩn biến nạp môi trƣờng chọn lọc, thu đƣợc khuẩn lạc xanh trắng Nguyên lý khuẩn lạc xanh trắng: Toàn khuẩn lạc phát triển môi trƣờng có ampicillin khuẩn lạc mang plasmit (vectơ) Vì có mặt gen kháng ampicillin plasmit giúp vi khuẩn có khả kháng kháng sinh ampicillin Những khuẩn lạc xanh xuất vectơ mang gen lac-operon hoạt động bình thƣờng, đoạn gen đƣợc xen vào, có chất cảm ứng IPTG tổng hợp enzym β-galactosidase, enzym chuyển hóa chất X-gal thành hợp chất có mầu xanh Còn khuẩn lạc trắng nhận đƣợc plasmit mang lac-operon không hoạt động, có chất cảm ứng IPTG gen không tổng hợp enzym β-galactosidase không xảy tƣợng chuyển hóa X-gal Lac-operon bị bất hoạt đoạn DNA ngoại lai xen vào promoter operon gen lacZ Do đó, lac-promoter điều khiển gen cấu trúc phiên mã, nên không cóc dịch mã thành enzym Tuy nhiên, tất khuẩn lạc trắng mang plasmit tái tổ hợp chứa đoạn DNA quan tâm Mặc dù vậy, việc chọn khuẩn lạc trắng để nghiên cứu tiếp loại bỏ đƣợc phần lớn trƣờng hợp không mong muốn Để phản ứng hiệu cần kiểm tra cách chạy phản ứng colony-PCR Hỗn hợp đƣợc ủ 220C giờ, sau đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt Hình 2.2 Sơ đồ vectơ pBT 2.3.6 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt - Chuẩn bị tế bào khả biến: Tế bào E.coli DH5α đƣợc cấy ria môi trƣờng LB đặc nuôi qua đêm 370C Chọn khuẩn lạc nuôi cấy 3ml LB lỏng, lắc 200 v/p, 370C 2- giờ, đo OD600nm đạt 0,4- 0,6 chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15 phút đá (hoặc 40C) Ly tâm 4000v/p, 40C, 15 phút (lặp lại ba lần, để đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút) Đổ dịch CaCl2, hòa tan 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu Bổ sung 15- 20% glycerol Chia 50µl dịch tế bào khả biến vào ống eppendorf 1,5ml Bảo quản tế bào khả biến tủ lạnh -840C - Biến nạp: Bổ sung 20µl vectơ tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến trộn nhẹ, đặt vào đá 30 phút ủ 420C xác 1,5 phút, sau Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.7 Colony-PCR Khuẩn lạc trắng mẫu đƣợc chọn lọc đánh số thứ tự, thực phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có plasmit mang gen quan tâm Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 0,9% để chọn khuẩn lạc mang gel có kích thƣớc nhƣ mong muốn, đồng thời nuôi khuẩn lạc 3ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l để tách plasmit Thành phần phản ứng colony-PCR: Dung dịch đệm PCR 10X (2µl); MgCl2 25mM (2µl); dNTPs 2,5mM (2µl); Mồi pUC18-xuôi 10 pmol/µl (1µl); Mồi pUC18ngƣợc 10 pmol/µl (1µl); DNA polymerase 1u/1µl (1 µl); H2O khử ion (11µl) Tổng thể tích 20µl Chu kỳ nhiệt phản ứng colony-PCR: bƣớc 1: 950C, phút; bƣớc 2: 940C, 30 giây; bƣớc 3: 520C, 30 giây; bƣớc 4: 720C, phút; từ bƣớc đến bƣớc lặp lại Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 32 33 10 chu kỳ; bƣớc 5: 940C, 30 giây; bƣớc 6: 550C, 30 giây; bƣớc 7: 720C, phút; từ bƣớc đến bƣớc lặp lại 25 chu kỳ; bƣớc 8: 720C, 10 phút; bƣớc 9: 40C, bảo quản mẫu không cho đoạn gen có kích thƣớc chênh lệch nhỏ, nhƣ vậy, xác định đƣợc đoạn gen quan tâm Sau xác định đƣợc enzym cắt giới hạn, đối chiếu với bảng enzym để xác định đƣợc đệm phù hợp nhất, cho khả cắt cao Tiến hành cắt enzym, cho lần lƣợt thành phần theo thứ tự: Đệm cho enzym cắt, chất phụ trợ (nếu có), plasmit, enzym Hỗn hợp đƣợc cắt 37 oC 02 tiếng, bất hoạt enzym 65oC 20 phút 2.3.8 Tách chiết plasmit Sử dụng kit QIAprep Spin Miniprep dẫn nhà sản xuất để tách chiết plasmit Đây phƣơng pháp tách plasmit lƣợng nhỏ từ – 1,5 ml dịch khuẩn E.coli, có số plasmit cao Qui trình bao gồm: Hút 1,5ml dịch khuẩn E.coli nuôi qua đêm môi trƣờng LB lỏng cho vào ống eppendorf 1,5ml Ly tâm 8.000v/p phút để thu tế bào vi khuẩn Hòa tan tế bào 250µl buffer RS có bổ sung RNase (sản phẩm tách không RNA) Bổ sung 250µl BL, đảo ống nhẹ nhàng 4-6 lần để trộn hỗn hợp Cần thiết đảo ống nhìn thấy dịch trắng sữa Không để phản ứng phân giải phút Các dung dịch RS BL có tác dụng phá vỡ thành tế bào, màng sinh chất giải phóng thành phần tế bào Bổ sung 350µl NE, đảo ống nhƣng nhẹ nhàng 3- lần Tránh kết tủa cục bộ, đảo dung dịch nhẹ nhàng nhƣng liên tục bổ sung NE Dung dịch trở nên có màu trắng sữa Dung dịch NE có tác dụng kết tủa protein, polysaccarit tạo kết tủa bám vào thành ống eppendorf Ly tâm 13.000v/p 15 phút Hút dịch cho vào cột QIAprep Spin Miniprep Ly tâm 13.000v/p phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, rửa cột QIAprep Spin Miniprep cách bổ sung 0,5ml buffer PB ly tâm 13.000v/p phút Loại bỏ dịch chảy qua cột Bƣớc cần thiết để loại bỏ hoạt tính nuclease sử dụng chủng endA+ nhƣ JM, HB101 hệ khác chủng dại mà có mức độ hoạt tính cao nuclease nồng đọ carbohydrate cao Chủng tế bào chủ nhƣ XL-1 DH5α không cần thiết phải thực bƣớc rửa Rửa cột QIAprep Spin Miniprep cách bổ sung 0,75ml buffer WP ly tâm 13.000v/p Loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 13.000v/p phút để loại bỏ hết buffer rửa Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml Hòa tan DNA cách bổ sung 50µl EL nƣớc cất tới tâm cột QIAprep Spin Miniprep, để nhiệt độ phòng phút ly tâm 13.000v/p phút Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm tinh plasmit gel agarose 0,9% Thành phần phản ứng cắt bằng enzym giới hạn : DNA plasmit 2,5- µg/µl (5µl); Enzym 10u/µl (1µl); Dung dịch đệm 10X (1µl); H2O khử ion (3,5µl ) Tổng thể tích 10µl 2.3.10 Xác định trình tự so sánh trình tự gen thu đƣợc với trình tự tƣơng ứng GenBank Tách dòng xác định trình tự gen: Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào vector tách dòng pBT [4] biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α Chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng môi trƣờng thạch LB có bổ sung 50 mg/l Ampicilin, 0,004% X-gal 0,1 mM IPTG Tách chiết plasmit theo hƣớng dẫn sử dụng Plasmit Extraction Kit Kiểm tra có mặt DNA tái tổ hợp phƣơng pháp colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi pUC18-ngƣợc Chọn mẫu plasmit tái tổ hợp có kích thƣớc nhƣ mong muốn để tinh xác định trình tự máy tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer Sử dụng phần mềm DNAstar, BioEdit MEGA để so sánh trình tự gen dựng phát sinh chủng loại theo phƣơng pháp tối đa (Maximum Parsimony (MP)) cở sở số liệu thu đƣợc qua so sánh trình tự gen 2.3.9 Cắt gen enzym giới hạn Bƣớc trình cắt gen enzym giới hạn, phải xác định enzym sử dụng để cắt đƣợc đoạn gen quan tâm Những enzym đƣợc lựa chọn enzym dự tính điểm cắt đoạn gen quan tâm, nhiều vị trí cắt vectơ Đặc biệt, enzym cắt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 34 35 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN đảm bảo cho hiệu phản ứng RT-PCR cao Sản phẩm RT-PCR đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 0,9% (Hình 3.1, Hình 3.2, Hình 3.3) 3.1 THIẾT KẾ MỒI Để thực đƣợc kỹ thuật PCR RT-PCR, bƣớc thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen muốn khuếch đại Dựa trình tự gen quan tâm chủng RGSV công bố GenBank, kết hợp sử dụng phần mềm thiết kế mồi nhƣ Primer3, DNAclub, Oligo Với mục đích đánh giá đa dạng di truyền vừa để xác định có mặt chủng virut gây bệnh VL&LXL lúa tỉnh Nam Trung Bộ, lựa chọn gen CP đoạn có trình tự bảo thủ cao khác Các cặp mồi đƣợc thiết kế thể bảng 3.1 Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng để nhân số đoạn genome RGSV STT Tên mồi Chiều dài gen (bp) Trình tự mồi RNA1-RGSV- xuôi 5’-CAAACATCCTCCCAAGCATTI-3’ RNA1-RGSV- ngƣợc 5’-ATGATCCAACGAGGAACTGGI-3’ RNA4-RGSV-xuôi 5'-AGCTGCCACTCAAGGTGTTTI-3' RNA4-RGSV- ngƣợc 5'-GAGCTAGTGGGTGGTTCTCGI-3' CP-RGSV- xuôi CP-RGSV- ngƣợc 5'-CTATACACTACGCTAAAGGCTI-3' 423 441 1021 5'-GTGTAAGATGGGTAAAGTGCAI-3' (I: Inosine – loại nucleotit đặc biệt có khả gắn với nucleotit A, C U) Cặp mồi RNA1-RGSV-xuôi, RNA1-RGSV-ngƣợc sử dụng để khuếch đại phân đoạn RNA1 RGSV với kích thƣớc dự kiến 423bp Cặp mồi RNA4-RGSVxuôi, RNA4-RGSV-ngƣợc khuếch đại phân đoạn RNA4 RGSV với kích thƣớc dự kiến 441bp Cặp mồi CP-RGSV-xuôi, CP-RGSV-ngƣợc sử dụng để khuếch đại gen CP RGSV với kích thƣớc dự kiến 1021bp 3.2 TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV 3.2.1 RT-PCR Sau tách đƣợc RNA tổng số virut từ lúa, RNA tổng số đƣợc sử dụng để thực phản ứng RT-PCR Trong trình tiến hành phản ứng cần điều chỉnh lƣợng mẫu, nồng độ mồi, nồng độ Mg2+, nhiệt độ bắt cặp mồi đƣợc tối ƣu hóa để Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 0,5 Kb Hình 3.1 Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn RGSV từ mẫu BT cặp mồi RNA1-RGSV RNA4-RGSV M Thang chuẩn 1Kb; (-) Đ/c âm; (+) Đ/c dƣơng; Phân đoạn1; Phân đoạn Hình 3.1 cho thấy điện di sản phẩm RT-PCR từ phân đoạn RGSV, giếng đối chứng âm không lên băng chứng tỏ thành phần phản ứng không nhiễm DNA RNA, giếng đối chứng dƣơng lên băng có kích thƣớc khoảng 500bp (kết PCR từ plasmit mang đoạn DNA có kích thƣớc 500bp) chứng tỏ phản ứng diễn tối ƣu Giếng số xuất băng có kích thƣớc khoảng 423bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc phân đoạn RNA1-RGSV Giếng số xuất băng có kích thƣớc khoảng 441bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc phân đoạn RNA4RGSV Nhƣ vậy, thực phản ứng PCR cặp mồi đặc hiệu với phân đoạn phân đoạn RGSV RNA1-RGSV RNA4-RGSV với mẫu RNA phân lập từ lúa tỉnh Bình Thuận thu đƣợc băng điện di có kích thƣớc nhƣ mong muốn Kết hình 3.2 cho thấy giếng số không lên băng, giếng số xuất băng có kích thƣớc khoảng 1Kb tƣơng đƣơng với băng đối chứng dƣơng Nhƣ vậy, thực phản ứng RT-PCR cặp mồi CP-RGSV-xuôi CP-RGSV-ngƣợc với mẫu lúa BĐ NT, mẫu NT thu đƣợc băng có kích thƣớc phù hợp với đoạn gen CP RGSV Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 36 37 phù hợp với phân đoạn 1, RGSV mẫu lúa tỉnh Bình Thuận Các phân đoạn DNA có kích thƣớc nhƣ mong muốn đƣợc tinh gắn vào vectơ tách dòng pBT 3.2.2 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Quá trình tách dòng đƣợc thực cách gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pBT phòng Công nghệ Tế bào thực vật cung cấp ~1 Kb Hình 3.2 Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP RGSV cặp mồi CP-RGSV M: Thang chuẩn: 1kb; (+): Đ/c dƣơng; (-): Đ/c âm; 1: BĐ; 2: NT Hình 3.3 cho thấy thực phản ứng RT-PCR cặp mồi đặc hiệu với gen CP RGSV (CP-RGSV-xuôi CP-RGSV-ngƣợc), giếng số (BT) xuất băng có kích thƣớc 1Kb giếng lại ( (BĐ), (PY), (KH)) không xuất băng sản phẩm Hình 3.4 Khuẩn lạc E.coli DH5α mang vectơ tái tổ hợp dòng CP RGSV tỉnh Bình Thuận môi trƣờng LB đặc Kb Hình 3.3 Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP RGSV cặp mồi CP-RGSV M: Thang chuẩn: 1Kb; (+): Đ/c dƣơng; (-): Đ/c âm; 1: BT; 2: BĐ; 3: PY; 4: KH Nhƣ vậy, thực phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu (bảng 3.1) điện di gel agarose thu đƣợc băng có kích thƣớc phù hợp với gen CP-RGSV mẫu lúa hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận băng có kích thƣớc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Sau biến nạp vectơ vào tế bào khả biến E.coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt, đĩa petri đƣợc ủ 370C 16 Kết đƣợc thể hình 3.4 Kết thu đƣợc gồm khuẩn lạc xanh trắng Toàn khuẩn lạc phát triển môi trƣờng có ampicillin khuẩn lạc mang plasmit biến nạp Vì có mặt gen kháng ampicillin plasmid biến nạp mà vi khuẩn phát triển môi trƣờng có ampicillin Để kiểm tra khuẩn lạc trắng chứa plasmit mang đoạn DNA quan tâm, lựa chọn từ đĩa khuẩn số khuẩn lạc trắng để thực phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi pUC18-ngƣợc 3.2.3 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp colony-PCR Chọn đến khuẩn lạc trắng mẫu để chạy phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi pUC18-ngƣợc để xác định khuẩn lạc có plasmit mang đoạn DNA mong muốn Vì hai mồi nằm vectơ nên kích thƣớc đoạn DNA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 38 39 đƣợc khuếch đại lớn đoạn DNA mong muốn khoảng 0,2Kb [4] Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 0,9% (Hình 3.5, Hình 3.6) Dựa vào kết điện di hình 3.6 thấy rằng, giếng số 1, 2, 13 xuất băng tƣơng đƣơng với kích thƣớc băng đối chứng dƣơng Nhƣ vậy, plasmit khuẩn lạc tƣơng ứng với giếng số 1, 2, 13 mang đoạn DNA ligation ban đầu Plasmit khuẩn lạc tƣơng ứng với giếng lại không mang đoạn DNA mong muốn 0,5 Kb Hình 3.5 Điện di sản phẩm colony-PCR từ dòng phân đoạn RGSV cặp mồi pUC 18 M: Thang chuẩn 1Kb; (+) Đ/c dƣơng; (-) Đ/c âm; 1,2 phân đoạn 1; 3,4 phân đoạn Kết điện di hình 3.5 cho thấy giếng đối chứng dƣơng xuất băng điện di có kích thƣớc khoảng 0,6Kb kích thƣớc đoạn DNA xác định plasmit sử dụng để PCR, giếng đối chứng âm không lên băng chứng tỏ thành phần phản ứng không lây nhiễm DNA, phản ứng diễn đạt yêu cầu Tại giếng 1, 2, 3, xuất băng có kích thƣớc khoảng 0,6Kb Đây kích thƣớc phù hợp với phân đoạn RGSV Nhƣ vậy, plasmit khuẩn lạc tƣơng ứng với giếng số 1, 2, 3, mang đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng ứng với phân đoạn RGSV Phƣơng pháp colony-PCR có tác dụng loại trừ phần lớn khuẩn lạc (trắng) mang plasmit không mong muốn Từ kết colony-PCR, lựa chọn dòng khuẩn lạc 1, (Hình 3.5) 1, 2, 13 (Hình 3.6) để nuôi môi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l Sau đó, tiến hành tách plasmit từ khuẩn lạc nuôi môi trƣờng LB lỏng để phục vụ cho việc xác định trình tự 3.2.4 Tách plasmit cắt kiểm tra có mặt gen Sau chọn khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với giếng sản phẩm colony-PCR có kích thƣớc nhƣ mong muốn nuôi 3ml LB lỏng 16 giờ, tiến hành tách plasmit theo kit QIAprep Spin Miniprep nhƣ trình bày mục 2.3.8 Để kiểm tra sản phẩm tách plasmit khẳng định lần có mặt đoạn DNA quan tâm plasmit đƣợc tinh sạch, plasmit đƣợc cắt enzym cắt BamHI Kết đƣợc thể hình 3.7 3.8 ~ 2,7 Kb 0,5 Kb ~1Kb Hình 3.7: Điện di sản phẩm cắt plasmit mang phân đoạn RGSV Bình Thuận BamHI Hình 3.6 Điện di sản phẩm colony-PCR dòng RGSV cặp mồi pUC 18 M: Thang chuẩn Kb; (-): Đ/c âm; (+): Đ/c dƣơng; 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu NT; 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13: mẫu BT Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn M: Thang chuẩn 100 bp; phân đoạn 1; phân đoạn Hình 3.7 cho thấy giếng số 1, xuất băng băng có kích thƣớc khoảng 2,7 Kb phù hợp với kích thƣớc vectơ pBT Băng lại lần Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 40 41 lƣợt có kích thƣớc khoảng 423bp (giếng số 1) băng có kích thƣớc khoảng 441bp (giếng số 2) phù hợp với kích thƣớc phân đoạn RGSV gắn vào vectơ ban đầu trình tự đem so sánh với trình tự phân đoạn RGSV GenBank cao (96- 99%) Kết chứng tỏ hai trình tự trình tự phân đoạn RGSV Các trình tự thu đƣợc đƣợc đăng ký vào GenBank với mã số nhƣ bảng 3.2 Hai trình tự thu đƣợc có kích thƣớc tƣơng đối ngắn có độ bảo thủ cao nên thực phản ứng PCR nhiệt độ thích hợp có độ nhạy cao Do sử dụng cặp mồi để kiểm tra có mặt RGSV mẫu lúa với hiệu cao ~3,7 Kb ~2,7 Kb Bảng 3.2 Mã số đăng ký GenBank trình tự thu đƣợc ~1 Kb Tỉnh phân lập Mã số GenBank RNA1-RGSV Bình Thuận FM995215 RNA4-RGSV Bình Thuận FN179368 CP-RGSV Bình Thuận FM882251 CP-RGSV Ninh Thuận FM882252 STT Hình 3.8 Điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP RGSV BamHI Tên gen (phân đoạn) M: Thang chuẩn 1Kb; (-): Plasmit không cắt (1): BT; (2): NT; Kết điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP RGSV BamHI (Hình 3.8) cho thấy, giếng plasmit không cắt xuất băng có kích thƣớc khoảng 3,7Kb chứng tỏ plasmit tinh có chất lƣợng tốt Các giếng số 1, xuất băng: băng có kích thƣớc khoảng 2,7Kb phù hợp với kích thƣớc vectơ pBT băng có kích thƣớc khoảng 1Kb phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA mong muốn Kết điện di sản phẩm cắt plasmit hình 3.7 hình 3.8 khẳng định plasmit tinh sạch, có mang đoạn DNA phù hợp với kích thƣớc mong muốn Sau đó, mẫu plasmit đƣợc sử dụng để giải trình tự máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer 3.3 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV Các trình tự RGSV thu đƣợc máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer đƣợc phân tích, xử lý chƣơng trình DNAstar, BioEdit MEGA Căn vào kích thƣớc thấy gen CP-RGSV từ mẫu NT BT thu đƣợc sau xác định trình tự phù hợp với kích thƣớc lý thuyết thiết kế mồi So sánh trình tự cách so sánh chƣơng trình Blast (NCBI), hệ số tƣơng đồng trình tự đem so sánh với trình tự gen CP RGSV GenBank cao (96,5- 99%) Kết chứng tỏ trình tự gen CP-RGSV Các trình tự thu đƣợc đƣợc đăng ký vào GenBank với mã số nhƣ bảng 3.2 3.4 SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK Kết bảng 3.3, hệ số tƣơng đồng trình tự gen CP- RGSV cao (96,5%- 99,9%) cho thấy gen CP- RGSV có mức độ bảo thủ cao Đặc biệt, hệ số tƣơng đồng hai trình tự Ninh Thuận Bình Thuận với trình tự tƣơng ứng đem so sánh đạt từ 98,0- 99,9% Trong đó, hai trình tự giống với trình tự VL2 (EU076544) tỉnh Vĩnh Long (99,9%) khác với trình tự CN(AF290947) Trung Quốc (98,0%) Căn vào kích thƣớc thấy phân đoạn 1, RGSV từ mẫu BT thu đƣợc sau xác định trình tự phù hợp với kích thƣớc lý thuyết thiết kế mồi Khi so sánh trình tự cách Blast NCBI thấy rằng, hệ số tƣơng đồng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 43 Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Bootstrap phần mềm MEGA4 sử dụng kết so sánh ClustalW trình tự gen CP-RGSV hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận với trình tự số trình tự tƣơng ứng đại diện cho dòng RGSV khác Việt Nam giới (Hình 3.9) 42 Bảng 3.3 Hệ số tƣơng đồng sai khác trình tự nucleotit gen CP- RGSV Bình Thuận, Ninh Thuận với trình tự tƣơng ứng tỉnh ĐBSCL giới (GenBank) Hệ số sai khác Hệ số tƣơng đồng AG(GQ306203): An Giang, BL1(EU076531): Bạc Liêu1, BL2(EU976532): Bạc Liêu2, BT(FM882251): Bình Thuận, CT1(EU076533): Cần Thơ1, CT2(EU076534): Cần Thơ2, CN(AF290947): Trung Quốc, DT1(EU076535): Đồng Tháp1, DT2(EU076536): Đồng Tháp2, HG(GQ329709): Hậu Giang; JP(AB000403): Nhật Bản, JP(AB023779): Nhật Bản, LA(FN433644): Long An; LA(GQ329710): Long An; NT(FM882252): Ninh Thuận, ST1(EU076537): Sóc Trăng1, ST2(EU076538): Sóc Trăng2, TG1(EU076539): Tiền Giang1, TG2(EU076540): Tiền Giang2, TV1(EO076541): Trà Vinh1, TV2(EU076542): Trà Vinh2, VL1(EU076543): Vĩnh Long1, VL2(EU076544): Vĩnh Long2 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại xây dựng sở so sánh 02 trình tự nucleotit gen CP- RGSV Nam Trung Bộ (Ninh Thuận, Bình Thuận) với trình tự tƣơng ứng ĐBSCL giới công bố GenBank Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng sở so sánh 23 trình tự (Nam Trung Bộ (2), ĐBSCL(18) giới (3)) gen CP-RGSV lấy từ GenBank Thanh bar trình bày số thay nucleotide Các số đốt phát sinh chủng loại giá trị bootstrap tính theo phần trăm (1000 lần lặp lại) Chỉ giá trị bootstrap > 50% đƣợc hình AG(GQ306203): An Giang, BL1(EU076531): Bạc Liêu1, BL2(EU976532): Bạc Liêu2, BT(FM882251): Bình Thuận, CT1(EU076533): Cần Thơ1, CT2(EU076534): Cần Thơ2, CN(AF290947): Trung Quốc, DT1(EU076535): Đồng Tháp1, DT2(EU076536): Đồng Tháp2, HG(GQ329709): Hậu Giang; JP(AB000403): Nhật Bản, JP(AB023779): Nhật Bản, LA(FN433644): Long An; LA(GQ329710): Long An; NT(FM882252): Ninh Thuận, ST1(EU076537): Sóc Trăng1, ST2(EU076538): Sóc Trăng2, TG1(EU076539): Tiền Giang1, TG2(EU076540): Tiền Giang2, TV1(EO076541): Trà Vinh1, TV2(EU076542): Trà Vinh2, VL1(EU076543): Vĩnh Long1, VL2(EU076544): Vĩnh Long2 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 45 Qua hình 3.9 thấy phát sinh chủng loại đƣợc chia thành hai nhánh là: nhánh gồm trình tự gen CP-RGSV giới nhánh gồm trình tự gen CP-RGSV Việt Nam Nhánh gồm trình tự Việt Nam lại đƣợc chia thành hai nhánh nhỏ, hai trình tự gen phân lập hai tỉnh Nam Trung Bộ thuộc nhánh nhỏ thứ hai gồm trình tự: VL1, VL2, BL2, TG2, DT1, TV2 (ĐBSCL) NT, BT (Nam Trung Bộ) Nhƣ vậy, hai dòng RGSV phân lập từ tỉnh Nam Trung Bộ có quan hệ gần gũi với dòng RGSV phân lập từ ĐBSCL, đặc biệt với tỉnh Vĩnh Long có khác biệt nhỏ với nhóm giới Vì vậy, giả thiết chủng virut RGSV phân lập đƣợc từ Ninh thuận Bình Thuận có quan hệ nguồn gốc với trình tự gen CP- RGSV phân lập từ ĐBSCL Đồng thời, thấy dòng virut phân lập Việt Nam (ĐBSCL Nam Trung Bộ) có nguồn gốc nội địa, nhƣ dịch bệnh VL&LXL khu vực nghiên cứu Việt Nam virut nội địa gây virut ngoại lai xâm nhập vào Mặc dù số vị trí sai khác lớn (20/978 = 2,05%), nhƣng trình tự Bình Thuận Ninh Thuận so sánh với trình tự Trung Quốc 20 vị trí bị biến đổi vị trí làm thay đổi axit amin chuỗi polypeptit gen CP gồm axit amin số 19 221 Nhƣ vậy, mức độ ảnh hƣởng từ sai khác gen đến sản phẩm protein không nhiều Tuy nhiên, cho sai khác trình tự gen CP- RGSV có ý nghĩa Điều khẳng định gen CP- RGSV có độ bảo thủ cao Căn vào hệ số tƣơng đồng mối quan hệ trình tự gen CPRGSV (bảng 3.3 hình 3.9) thấy hai trình tự Ninh Thuận Bình Thuận giống với trình tự VL2 tỉnh Vĩnh Long (99,9%) khác với trình tự Trung Quốc (CN- AF290947) Vì lần lƣợt so sánh trình tự với trình tự VL2 trình tự Trung Quốc nhằm phân tích mức độ đa dạng cấp độ nucleotit để đánh giá mức ý nghĩa sai khác Từ kết phân tích phần mềm DNAsp thấy hai trình tự gen CP- RGSV Bình Thuận Vĩnh Long2 khác 01 vị trí, cặp nucleotit thứ 93 Đồng thời, hai trình tự Ninh Thuận Vĩnh Long2 khác vị trí cặp nucleotit thứ 585 Sự sai khác 01 vị trí trình tự Bình Thuận Long An2 không ảnh hƣởng tới thành phần số lƣợng axit amin chuỗi polypeptit trình tự mã hóa Kết tƣơng tự với trình tự Ninh Thuận Vĩnh Long2 Nhƣ vậy, lần khẳng định mối quan hệ nguồn gốc dòng RGSV Bình Thuận Ninh Thuận với dòng thuộc khu vực ĐBSCL, đặc biệt với dòng tỉnh Vĩnh Long Mặt khác, so sánh trình tự gen CP- RGSV Bình Thuận Trung Quốc khác 20 vị trí Các vị trí khác biệt không tập trung vùng gen mà nhiều vị trí khác đoạn gen Khi so sánh trình tự gen CP- RGSV Ninh Thuận Trung Quốc khác 20 vị trí Đồng thời vị trí khác biệt không tập trung khu vực mà trải gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ Kết luận 1> Đã hoàn thiện tối ƣu phản ứng RT-PCR với cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu để phát virut RGSV với độ đặc hiệu cao 2> Đã tách dòng, xác định trình tự phân đoạn 1, RGSV mẫu lúa Bình Thuận gen CP- RGSV từ mẫu lúa hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận Kích thƣớc gen CP đƣợc xác định trình tự đầy đủ 978 nucleotit, phân đoạn lần lƣợt 423 441 nucleotit Mã số đăng ký GenBank trình tự thu đƣợc là: FM995215, FN179368, FM882251, FM882252 3> Hệ số tƣơng đồng trình tự gen CP- RGSV cao (96,5%99,9%) cho thấy gen CP- RGSV có mức độ bảo thủ cao Đặc biệt, hệ số tƣơng đồng hai trình tự Ninh Thuận Bình Thuận với trình tự tƣơng ứng đem so sánh đạt từ 98,0- 99,9% Trong đó, hai trình tự giống với trình tự VL2 (EU076544) tỉnh Vĩnh Long (99,9%) khác với trình tự CN(AF290947) Trung Quốc (98,0%) 4> So sánh trình tự gen CP- RGSV Bình Thuận Ninh Thuận với trình tự tƣơng ứng Trung Quốc thấy 20 điểm sai khác phân bố gen dẫn đến sai khác có ý nghĩa hai chuỗi polypeptit gen mã hóa Đề nghị Nguyễn Ngọc Sơn, Hoàng Thị Thu Hằng, Đặng Thị Lan Anh, Nguyễn Nhƣ Cƣờng, Nguyễn Hữu Cƣờng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Nguyễn Trung Nam (2008), Quan hệ di truyền chủng virut gây bệnh vàng lùn lúa tỉnh Nam Trung bộ, Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(3): 301-309 Nguyễn Ngọc Sơn, Hoàng Thị Thu Hằng, Nguyễn Hữu Cƣờng, Hoàng Thị Nga, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Đặng Thị Lan Anh, Nguyễn Trung Nam, Nguyễn Nhƣ Cƣờng (2009), Kiểm tra có mặt virut gây bệnh vàng lùn lúa (RGSV) rầy nâu tỉnh Nam Trung Bộ RT-PCR Tạp chí Bảo vệ thực vật, 1: 23- 27 Nguyen Trung Nam, Hoang Thi Thu Hang, Chu Hoang Ha, Nguyen Huu Cuong, Dang Thi Lan Anh, Nguyen Nhu Cuong, Nguyen Ngoc Son, Hoang Thi Nga, Hoang The Hung, Le Tran Binh (2009), Detection of rice ragged stunt virus (RRSV) in Vietnamese rice using RT-PCR and DNA sequencing Proceeding of the Analytical Vietnam Conference 2009: 233- 240 Nguyen, S.N et al (2008, 2009), Các trình tự DNA virus RGSV đăng ký GenBank với mã số FM882251, FM882252, FM956076, FM958187, FM995215, FM994933, FM995502, FM995503, FM995504, FM995505, FN179368 1> Tiếp tục phân lập phân đoạn khác genome RGSV chủng virut khác gây bệnh VL&LXL (RRSV, RTSV, RTBV) 2> Nghiên cứu có mặt chủng virut rầy nâu nhằm tăng khả cảnh báo xuất bệnh tỉnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 11 Ban đạo phòng chống rầy nâu, bệnh VL&LXL tỉnh phía Nam (2008), Báo cáo tình hình dịch rầy nâu, bệnh VL&LXL tỉnh phía Nam 12 Ban đạo phòng chống rầy nâu, bệnh VL&LXL tỉnh phía Nam (2009), Báo cáo tình hình dịch rầy nâu, bệnh VL&LXL tỉnh phía Nam Tài liệu tiếng Việt Tài liệu tiếng nƣớc Bùi Bá Bổng (2006), Tổng kết hội nghị phòng chống rầy nâu, bệnh vàng lùn lùn xoắn năm 2006 Phạm Văn Dƣ (2007), Các giải pháp quản lý bệnh vàng lùn, lùn xoắn Đồng Sông Cửu Long Các giải pháp kỹ thuật thích hợp cho vụ lúa Hè thu năm 2007 Nam Diễn đàn khuyến nông @ Công nghệ Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2002), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục Phan Trọng Hoàng, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2005), “Sử dụng enzym XcmI để thiết kế vector pBT phục vụ tách dòng đọc trình tự gen”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 3: 459-463 Vũ Triệu Mân (2007), Một số ý kiến việc phòng chống bệnh lùn cỏ, vàng lùn lùn xoắn miền Nam Việt Nam Các giải pháp kỹ thuật thích hợp cho vụ Hè Thu năm 2007 Nam Bộ Diễn đàn khuyến nông @ Công nghệ Nguyễn Thơ (2007), Một số suy nghĩ phòng trừ bệnh vàng lùn, lùn xoắn lúa Các giải pháp kỹ thuật thích hợp cho vụ Hè Thu năm 2007 Nam Bộ Diễn đàn khuyến nông @ Công nghệ Nguyễn Trung Nam, Nguyễn Minh Hùng, Chu Hoàng Hà, Hoàng Thị Thu Hằng, Lê Trần Bình (2007), “Đánh giá đa dạng di truyền dòng virus gây bệnh lùn lúa cỏ tỉnh Đồng sông Cửu Long”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5: 479-484 Hà Minh Trung, Phạm Văn Doãn, Đặng Vũ Thị Thanh, Trần Thị Thuần, Ngô Vĩnh Viễn (1980), Kết nghiên cứu bệnh lúa lùn xoắn tỉnh phía Nam 1978 – 1979/ Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật (1969 - 1979), Nhà xuất Nông nghiệp Ngô Vĩnh Viễn (1994), Bệnh vàng lúa virut Mycoplasma gây biện pháp phòng trừ Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội 10 Ngô Vĩnh Viễn (2007), Kết nghiên cứu xây dựng mô hình phòng chống rầy nâu, bệnh vàng lùn, lùn xoắn Long An Bến Tre, vụ Đông Xuân 20062007 Hội nghị toàn quốc tổng kết công tác Bảo vệ thực vật năm 2006, kế hoạch công tác năm 2007 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 13 Azzam O., Arboleda M., Umadhay K.M.L., Cruz F.S., Mackenzie A., McNally K.L (2000), “Genetic composition and complexity of virus populations at tungro-endemic and outbreak rice sites”, Arch Virol, 145: 2643-2657 14 Azzam O., Imbe T., Ikeda R., Nath P.D., Coloquio E (2001), “Inheritance of resistance to rice tungro spherical virus in a near-isogenic line derived from Utri Merah and in rice cultivar TKM6”, Euphytica, 122: 91-97 (RTSV) 15 Bao Y., and Hull R (1992), “Characterization of the discontinuities in rice tungro bacilliform virus DNA” J Gen Virol, 73:1297-1301 16 Cabauatan P.Q, Hibino H., Lapis D.B , Omura T., and Tsuchizaki T (1985), “Transmission of rice tungro bacilliform and spherical viruses by Nephotettix virescens Distant Philippine”, Phytopathology, 21:103-109 17 Cabauatan P.Q., Cabunagan R.C., and Koganezawa H (1995), “Biological variants of rice tungro viruses in the Philippines”, Phytopathology, 85:77-81 18 Chaogang S., Jianhua W., Guoying Z., Gang S., Baozhen P., Juanli L., Dendi J., Shenxiang C., Upadhyaya N.M., Waterhouse P., and Zuxun G (2003), “Ectopic expression of the spike protein of Rice Ragged Stunt Oryzavirus in transgenic rice plants inhibits transmission of the virus to insects”, Mol Breeding, 7:295301 19 Chen C., and Chiu R (1982), “Three symptomatological types of rice virus diseases related to grassy stunt in Taiwan”, Plant Dis, 66 : 5-18 20 Chen C., Chiu R., Wang E (1979) “Rice ragged stunt: a virus disease new to Taiwan”, Plant Prot Bull, (Taiwan) 21:447 (Abstr.) 21 Chomchan P., Li S.F., Shirako Y (2003), “Rice Grassy Stunt Tenuivirus Nonstructural Protein p5 Interacts with Itself To Form Oligomeric Complexes In Vitro and In Vivo”, J Virol, 77: 769–775 22 Dyck V.A., Thomas B (1979), The brown planthopper problem In: Brown Planthopper: Threat to Rice Production in Asia IRRI, Philippines pp 3-17 23 Druka A., Burns T., Zhang S., Hull R (1996), “Immunological characterization of rice tungro spherical virus coat proteins and differentiation of isolates from the Philippines and India”, J Gen Virol, 77:1975-1983 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 51 24 Herdt R.W (1991), Rice Biotechnology, Eds Khush & Toenniessen, pp 19-54, CABI, Wallingford, UK 25 Hibino H., Cabauatan P., Omura T., and Tsuchizaki T (1985b), “Rice grassy stunt virus strain causing tungro like symptoms in the Philippines”, Plant Dis, 69:538-541 26 Hibino H (1996), “Biology and epidemiology of rice viruses”, Ann Rev Phytopathol, 34:249-274 27 Hull R (1996), “Molecular biology of rice tungro viruses”, Ann Rev Phytopathol, 34:275-297 28 Iwasaki M., Nakano M., and Shinkai A (1982), “Variation in the transmission rates of rice grassy stunt virus in various colonies of brown planthopper”, Proc Assoc Plant Prot Kyushu, 28:1-3 29 Iwasaki M., Nakano M., and Shinkai A (1985b), “Detection of rice grassy stunt virus in planthopper vectors and rice plants by ELISA”, Ann Phytopathol Soc Jpn 51:450-458 30 Lin P.K.T., Brown D.M (1992), “Synthesis of oligodeoxyribonucleotides containing degenerate bases and their use as primers in the polymerase chain reaction”, Nucleic Acids Res, 19:5149-5152 31 Ling K.C., Aguiero V.M., and Lee S.H (1970), “A mass screening method for testing resistance to grassy stunt disease of rice” Plant Dis Rep, 56:565–569 32 Ling K.C (1972), Rice Virus Diseases International Rice Research Institute, Los Baños Philippines 33 Mariappan V., Hibino H., and Shanmugam N (1984), “A new rice virus disease in India” Int Rice Res Newsl, 9:9-10 34 Marmey P., Bothner B., Jacquot E., Kochko A.d., Ong C.A., Yot P., Siuzdak G., Beachy R.N., and Fauquet C.M (1999), “Rice Tungro Bacilliform Virus Open Reading Frame Encodes a Single 37-kDa Coat Protein”, Virolog, 253:319-326 35 Mayo M.A., Miranda J.R.D., Falk B.W., Goldbach R., Haenni A.L., Toriyama S (2000), Genus Tenuivirus In: van Regenmortel M.H.V., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Carstens E.B., Estes M.K., Lemon S.M., Maniloff J., Mayo M.A., McGeoch D.J., Pringle C.R., Wickner R.B (eds) Virus Taxonomy Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Academic Press, San Diego, pp 622–627 36 Milne R., Ling K (1982), “Rice ragged stunt virus” CMI/AAB Desc Pl Viruses, 248:5p 37 Miranda J.G., Aliyari R., Shirako Y (2001), “Nucleotide sequence of a Dianthovirus RNA1-like RNA found in grassy stunt- diseased rice plants”, Arch Virol, 146: 225–238 38 Miranda J.R.D., Wu R., Espinoza A.M (2001), “Phylogenetic Placement of a Novel Tenuivirus from the Grass Urochloa plantaginea”, Virus Genes, 22: 329– 333 39 Montpetit M.L., Cassol S., Salas T., and O'Shaughnessy M.V (1992), “OLIGOSCAN: A computer program to assist in the design of PCR primers homologous to multiple DNA sequences”, J Virol Methods, 36: 119-128 40 Palmer L.T., Soepriaman Y., Sunendar K., Kartaatmadja S (1978), “Rice yield losses due to brown planthopper and rice grassy stunt disease in Java and Bali”, Plant Dis Rep, 62: 962-965 41 Pham V.D., Cabunagan R.C., Choi I.R (2005), “Rice Yellowing Syndrone in Mekong River Delta”, Omonrice, 13: 135-138 42 Rivera C.T., Ou S.H.(1965), “Leafhopper transmission of tungro disease of rice” Plant Dis Rep, 49:127- 131 43 Rivera C.T., Ou S.H., and Ida T (1966), “Grassy stunt disease of rice and its transmission by the planthopper Nilaparvata lugens Stal”, Plant Dis Rep, 50:453456 44 Saha P., Dasgupta I., Das S (2006), “A novel approach for developing resistance in rice against phloem limited viruses by antagonizing the phloem feeding hemipteran vectors”, Plant Mol Biol, 62:735–752 45 Sambrook J., Russell D (2001), Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edn Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 46 Shen P., Kaniewska M., Smith C., Beachy R.N (1993) “Nucleotide sequence and genomic organization of rice tungro spherical virus”, Virology, 193: 621630 47 Shikata E., Senboku T., and Ishimizu T (1980), “The Causal Agent of Rice Grassy Stunt Disease”, Proc Japan Acad, Ser B 56 48 Shikata E., Senboku T., Tiongco E.R., and Ling K.C (1979), ”Rice ragged stunt virus, a new member plant reovirus group”, Ann Phytopath soc Jpn, 45: 436-443 49 Thole V., Hull R (1996), “Rice tungro spherical virus: nucleotide sequence of the 3' genomic half and studies on the two small 3' open reading frames”, Virus Genes, 13:239-246 50 Tinjuangjun P., Loc N.T., Gatehouse A.M.R., Gatehous J.A., Christou P (2000), “Enhanced insect resistance in Thai rice varieties generated by particlebombardment”, Mol Breeding, 6: 391-399 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 53 51 Toriyama S., Kimishima T., Takahashi M., Shimizu T., Minaka N., Akutsu K (1998), “The complete nucleotide sequence of the rice grassy stunt virus genome and genomic comparisons with viruses of the genus Tenuivirus”, J Gen Virol, 79: 2051–2058 52 Zhang S., Davies J.W., Hull R (1997), “Sequences of the Three Coat Protein Genes of a Malaysian Isolate of Rice Tungro Spherical Virus Reveal a Close Relationship to the Philippine Isolate”, Virus Genes, 15, 61-64 53 Zhang S., Jones M.C., Barker P., Davies J.W., Hull R (1993), “Molecular cloning and sequencing of coat protein encoding cDNA of rice tungro spherical virus - a plant picornavirus”, Virus Genes, 7: 121-132 Các trang web: 54 Nguyễn Văn Đức Tiến (2007), Chi cục bảo bệ thực vật thành phố Hồ Chí Minh Những bệnh nguy hiểm có liên quan đến rầy gây hại lúa http://www.bvtvhcm.gov.vn/technology.php?id=40 55 Trung tâm khuyến nông quốc gia (2006) Sổ tay hướng dẫn phòng trừ rầy nâu truyền bệnh VL&LXL hại lúa http://www.iasvn.org/content/detail.php?contentid=1080&subcatid=229&catid=1 08&id=1080&langid=0 56 Cabunagan R.C (2006), “Yellowing Syndrome” in Mekong Delta, Vietnam: A trip report by Rogelio Cabunagan, PBGB, IRRI August 27- September 2, 2006, Omon, Cantho, www.clrri.org/benhvanglun/tech/benhvanglun.pdf 57 RGSV description: http://image.fs.uidaho.edu/vide/descr688.htm 58 RRSV description: http://image.fs.uidaho.edu/vide/descr691.htm 59 http://www.dpvweb.net 60 http://www.ictvdb.rothamsted.ac.uk 61 http://www.irri.org 62 http://www.fao.org 63 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 64 http://www.clrri.org 65 http://www.vaas.org.vn/ 66 http://www.iah.bbsrc.ac.uk 67 http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết so sánh chƣơng trình Blast (NCBI) phân đoạn RGSV Phân đoạn (RG1) > emb|FM995215.1| Rice grassy stunt virus partial RNA polymerase, segment RNA1, isolate Binhthuan1 from brown planthopper, genomic RNA Length=423 Score = 760 bits (411), Expect = 0.0 Identities = 419/423 (99%), Gaps = 0/423 (0%) Strand=Plus/Plus RG1 GB RG1 61 GB 61 CAAACATCCTCCCAAGCATTTCACAGTCTCTGTTACCATATGCCATAGTGTAGTGAGAAT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAAACATCCTCCCAAGCATTTCACAGTCTCTGTTACCATATGCCATAGTGTAGTGAGAAT 60 TTCCCACTCGGTGTTCTCTTGACCATTCCTTCAATGATTGTATAGTATCTGATAGGTGCA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTCCCACTCGGTGTTCTCTTGACCATTCCTTCAATGATTGTATAGTATCTGATAGGTGCA 120 RG1 121 TTGCACTAGATAGACTAACACTTTTGATGTAAGACTCCATATTTTGATCAGAGTTTACTT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 121 TTGCACTAGATAGACTAACACTTTTGATGTAAGACTCCATATTTTGATCAGAGTTTACTT 180 RG1 181 CAATCTGAACTGCTACATCATGTAGATAACCTCTCCATACACCTGGTCCGAAGTACTTCT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 181 CAATCTGAACTGCTACATCATGTAGATAACCTCTCCATACACCTGGTCCGAAGTACTTCT 240 RG1 241 TTTCCTCCCTGTTATATGATTGCTTTTGGACGTAGCCACCCAGTAGACCTAGATTACCAA 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 241 TTTCCTCCCTGTTATATGATTGCTTTTGGACGTAGCCACCCAGTAGACCTAGATTACCAA 300 RG1 301 TTCTTATCTTCTCCATAATGTCTCTCCTACAGTATTTAGCTTCATCCCTCAGTTTCATTA 360 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || GB 301 TTCTTATCTTCTCCATAATGTCTCTCCTACAGTATTTAGCTTCATCCCTCAGTTTCAATA 360 RG1 361 GGTCATAACTACTCTTAACAATCCTGTGACCAATCATTGTTAACCAGTTCCTCGTTGGAT 420 ||||||||||||||||||||||| | |||||||||||||| ||||||||||||||||||| GB 361 GGTCATAACTACTCTTAACAATCTTATGACCAATCATTGTCAACCAGTTCCTCGTTGGAT 420 RG1 421 GB 421 CAT 423 ||| CAT 423 Hình 1: Kết so sánh trình tự nucleotit trình tự RG1- Bình Thuận với trình tự tƣơng ứng GenBank Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 55 Phân đoạn (RG4) Phân đoạn – RGSV Bình Thuận (FN179368) > emb|FM995504.1| Rice grassy stunt virus segment S4, partial putative p4V protein, isolate Khanhhoa from brown planthopper, genomic RNA Length=441 Score = 804 bits (435), Expect = 0.0 Identities = 439/441 (99%), Gaps = 0/441 (0%) Strand=Plus/Plus RG4 GB RG4 61 GB 61 AGCTGCCACTCAAGGTGTTTGCCAGTATGGCAAACTTATTCTTCAGTACTCCACAGGAGC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCTGCCACTCAAGGTGTTTGCCAGTATGGCAAACTTATTCTTCAGTACTCCACAGGAGC 60 TGAGGATTTTAAATTATATAATAACTAGGAATACTGTACAATTTCACTGGACGATTCCTA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAGGATTTTAAATTATATAATAACTAGGAATACTGTACAATTTCACTGGACGATTCCTA 120 RG4 121 AAAATTCTGATAACCCTATTATTTACACAACACTCTTGCAGAACACTAAAGATTTCTACT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | GB 121 AAAATTCTGATAACCCTATTATTTACACAACACTCTTGCAGAACACTAAAGATTTCTATT 180 RG4 181 TCACAGAGTTGAGAAGTAAAGATTTAAACACTGAAATGCTGGGCTTATGCATCAAGTTAA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 181 TCACAGAGTTGAGAAGTAAAGATTTAAACACTGAAATGCTGGGCTTATGCATCAAGTTAA 240 RG4 241 TAATTAAAGTAGTGATCAAAATAAACCAAGGAATCAATATACCATTAGAAGATGTGTTCA 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 241 TAATTAAAGTAGTGATCAAAATAAACCAAGGAATCAATATACCATTAGAAGATGTGTTCA 300 RG4 301 AGAAAATTTATGATGATAGAGGTAGAAACATTTATTTATATACAAATTTTAGTGATAAAG 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GB 301 AGAAAATTTATGATGATAGAGGTAGAAACATTTATTTATATACAAATTTTAGTGATAAAG 360 RG4 361 ACTTAGAAAGAAAGGTTAACCAATATGTACATTGCGCATCTCTTAAATTACCTATCGATT 420 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| GB 361 ACTTAGAAAGAAAGGTTAACCAATATGTACATTGCGCATCTCTTAAACTACCTATCGATT 420 RG4 421 TCGAGAACCACCCACTAGCTC 441 ||||||||||||||||||||| GB 421 TCGAGAACCACCCACTAGCTC 441 Hình 2: Kết so sánh trình tự nucleotit trình tự RG4- Bình Thuận với trình tự tƣơng ứng GenBank Phụ Lục : Trình tự nucleotide gen CP phân đoạn 1, chủng RGSV phân lập từ lúa tỉnh Nam Trung Bộ Phân đoạn – RGSV Bình Thuận (FM994933) AGCTGCCACTCAAGGTGTTTGCCAGTATGGCAAACTTATTCTTCAGTACTCCACAGGAGCTGAGGATTTTAAA TTATATAATAACTAGGAATACTGTACAATTTCACTGGACGATTCCTAAAAATTCTGATAACCCTATTATTTAC ACAACACTCTTGCAGAACACTAAAGATTTCTACTTCACAGAGTTGAGAAGTAAAGATTTAAACACTGAAATGC TGGGCTTATGCATCAAGTTAATAATTAAAGTAGTGATCAAAATAAACCAAGGAATCAATATACCATTAGAAGA TGTGTTCAAGAAAATTTATGATGATAGAGGTAGAAACATTTATTTATATACAAATTTTAGTGATAAAGACTTA GAAAGAAAGGTTAACCAATATGTACATTGCGCATCTCTTAAATTACCTATCGATTTCGAGAACCACCCACTAG CTC Gen CP – RGSV Bình Thuận (FM882251) ATGGGTAAAGTGCAGTTTGGAGATGGTCACTGGGCAAATAACAAGGAATGGTCTGAGTTGTTATCAGAAATAT TTTCAAAAATCAGAGCATCCATAGATGGATTTGCCAATGCTACAGCTGATTTGGCTGCAGGATTGGAGTATCA GGCTTTCAATCCTGAAAAGATTTTGAGGAAGTTGATTGCATCCTCAACTTCATTGGATGACTTTGTTAAGGAT ATGCGTGACCTCTTGGTGGCCAGGTACACCAGAGGAACTAGCTTCTTGTTCAATGCTAAAAACTCAATTGAGA AAGCAAAGGATAAGAAGAAGGCTGAAGCTATTCAGGTACTGATAAATAGGTACGGAGTAAAAAAGAATGCTGG TGACAATGCTGTTGATCAAGCCACTTTGGGAAGGATAAGTCAAGTGTTGGCATATATGGCCTTGAGAGTTGCT TTACAAATCACAGACTATCATAAGCCAATCATACCATTGAGACCCATTAGTACCGTTGATATAAAGAATGCTA TCATTGATGTTGTTCCACAATTCTTATATCTTAAAGCAGATCAACTTGATTCAAAGACCAACTCAGAGGCAGC TCTGTATGTAATCCATTTGTGTTACCAAGTCTGTGTGTCTGAAAGAATCATGACTAAAGCTCAGAAAGATAAG CACGGTGTTCACACTAAGTCAGCAATGATAACACACTGCATGGGTTTTGTCAATCTGGCTATGGATAATTCTT CAGTAGTGTCTGATGATAAGATAGCTGGTAGAAGGATGATCTCAGGTCCATGGGGACTACAGGAAACTGCTCT AGATGCCACAGGCTGCGCATGTATCATTGATGTTGTTGATTTCTGCTGCAGGGGACACAAAGTAACAGATGCT GTGGCGCCAGTTCGGCTGTTCAGATTAGCTATTGAGTGCATAAAAGACACAGCTGATCTGAAGGATGCTGGAG TCAAATTGAAGACTCTGGTTGATAAGTGA Gen CP – RGSV Ninh Thuận (FM882252) ATGGGTAAAGTGCAGTTTGGAGATGGTCACTGGGCAAATAACAAGGAATGGTCTGAGTTGTTATCAGAAATAT TTTCAAAAATCAGAGCATCTATAGATGGATTTGCCAATGCTACAGCTGATTTGGCTGCAGGATTGGAGTATCA GGCTTTCAATCCTGAAAAGATTTTGAGGAAGTTGATTGCATCCTCAACTTCATTGGATGACTTTGTTAAGGAT ATGCGTGACCTCTTGGTGGCCAGGTACACCAGAGGAACTAGCTTCTTGTTCAATGCTAAAAACTCAATTGAGA AAGCAAAGGATAAGAAGAAGGCTGAAGCTATTCAGGTACTGATAAATAGGTACGGAGTAAAAAAGAATGCTGG TGACAATGCTGTTGATCAAGCCACTTTGGGAAGGATAAGTCAAGTGTTGGCATATATGGCCTTGAGAGTTGCT TTACAAATCACAGACTATCATAAGCCAATCATACCATTGAGACCCATTAGTACCGTTGATATAAAGAATGCTA TCATTGATGTTGTTCCACAATTCTTATATCTTAAAGCAGATCAACTTGATTCAAAGACCAACTCAGAGGCAGC CCTGTATGTAATCCATTTGTGTTACCAAGTCTGTGTGTCTGAAAGAATCATGACTAAAGCTCAGAAAGATAAG CACGGTGTTCACACTAAGTCAGCAATGATAACACACTGCATGGGTTTTGTCAATCTGGCTATGGATAATTCTT CAGTAGTGTCTGATGATAAGATAGCTGGTAGAAGGATGATCTCAGGTCCATGGGGACTACAGGAAACTGCTCT AGATGCCACAGGCTGCGCATGTATCATTGATGTTGTTGATTTCTGCTGCAGGGGACACAAAGTAACAGATGCT GTGGCGCCAGTTCGGCTGTTCAGATTAGCTATTGAGTGCATAAAAGACACAGCTGATCTGAAGGATGCTGGAG TCAAATTGAAGACTCTGGTTGATAAGTGA CAAACATCCTCCCAAGCATTTCACAGTCTCTGTTACCATATGCCATAGTGTAGTGAGAATTTCCCACTCGGTG TTCTCTTGACCATTCCTTCAATGATTGTATAGTATCTGATAGGTGCATTGCACTAGATAGACTAACACTTTTG ATGTAAGACTCCATATTTTGATCAGAGTTTACTTCAATCTGAACTGCTACATCATGTAGATAACCTCTCCATA CACCTGGTCCGAAGTACTTCTTTTCCTCCCTGTTATATGATTGCTTTTGGACGTAGCCACCCAGTAGACCTAG ATTACCAATTCTTATCTTCTCCATAATGTCTCTCCTACAGTATTTAGCTTCATCCCTCAGTTTCATTAGGTCA TAACTACTCTTAACAATCCTGTGACCAATCATTGTTAACCAGTTCCTCGTTGGATCAT Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... plasmit trong hình 3.7 và hình 3.8 khẳng định plasmit đã tinh sạch, có mang những đoạn DNA phù hợp với kích thƣớc mong muốn Sau đó, các mẫu plasmit này đƣợc sử dụng để giải trình tự bằng máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer 3.3 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV Các trình tự của RGSV thu đƣợc trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100... đó khoảng 1000 – 5000 nucleotit và giải phóng độ vài chục nucleotit; (2) Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó; (3) Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotit Trình tự nhận biết của RE loại 2: Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotit đặc trƣng Các trình tự này thƣờng bao gồm 4-8 nucleotit (thƣờng là 4 hoặc 6) Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có... thiện và tối ƣu phản ứng RT-PCR với các cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu để phát hiện virut RGSV với độ đặc hiệu cao 2> Đã tách dòng, xác định trình tự các phân đoạn 1, 4 RGSV của mẫu lúa Bình Thuận và gen CP- RGSV từ mẫu lúa của hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận Kích thƣớc của gen CP đã đƣợc xác định trình tự đầy đủ là 978 nucleotit, của các phân đoạn 1 và 4 lần lƣợt là 423 và 441 nucleotit Mã số đăng... CP-RGSV của hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận với trình tự của một số trình tự tƣơng ứng đại diện cho các dòng RGSV khác nhau tại Việt Nam và trên thế giới (Hình 3.9) 42 Bảng 3.3 Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP- RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tƣơng ứng của các tỉnh ĐBSCL và thế giới (GenBank) Hệ số sai khác Hệ số tƣơng đồng AG(GQ306203): An Giang, BL1(EU076531):... vector pBT phục vụ tách dòng và đọc trình tự gen”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 3: 459-463 5 Vũ Triệu Mân (2007), Một số ý kiến về việc phòng chống bệnh lùn cỏ, vàng lùn và lùn xoắn lá ở miền Nam Việt Nam Các giải pháp kỹ thuật thích hợp cho vụ Hè Thu năm 2007 ở Nam Bộ Diễn đàn khuyến nông @ Công nghệ 6 Nguyễn Thơ (2007), Một số suy nghĩ về phòng trừ bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá trên lúa Các giải pháp... đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm i) Thu thập các trình tự gen quan tâm từ GenBank: Trƣớc khi thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho gen và các trình tự cần phân lập của các chủng virut nghiên cứu (Ví dụ: trình tự gen CP của RGSV), trình tự đoạn gen này đƣợc thu thập từ GenBank tại địa chỉ www.ncbi.nlm.nih.gov [63] Trình tự của các đoạn gen quan tâm có thể tìm kiếm thông qua tên của gen hoặc số. .. có thể thấy rằng các dòng virut phân lập tại Việt Nam (ĐBSCL và Nam Trung Bộ) đều có nguồn gốc nội địa, nhƣ vậy dịch bệnh VL&LXL tại các khu vực nghiên cứu của Việt Nam do virut nội địa gây ra chứ không phải do virut ngoại lai xâm nhập vào Mặc dù số vị trí sai khác là rất lớn (20/978 = 2,05%), nhƣng cả trình tự của Bình Thuận và Ninh Thuận khi so sánh với trình tự của Trung Quốc trong 20 vị trí bị biến... trình tự của gen CP- RGSV là Bình Thuận và Vĩnh Long2 khác nhau 01 vị trí, tại cặp nucleotit thứ 93 Đồng thời, hai trình tự Ninh Thuận và Vĩnh Long2 cũng chỉ khác nhau tại vị trí cặp nucleotit thứ 585 Sự sai khác tại 01 vị trí giữa trình tự Bình Thuận và Long An2 không ảnh hƣởng tới thành phần và số lƣợng axit amin trong chuỗi polypeptit do 2 trình tự trên mã hóa Kết quả này cũng tƣơng tự với 2 trình tự. .. đích đánh giá đa dạng di truyền vừa để xác định sự có mặt của các chủng virut gây bệnh VL&LXL trong lúa tại các tỉnh Nam Trung Bộ, chúng tôi đã lựa chọn gen CP và các đoạn có trình tự bảo thủ cao khác Các cặp mồi đƣợc thiết kế thể hiện trong bảng 3.1 Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng để nhân một số đoạn trong genome RGSV STT 1 2 3 Tên mồi Chiều dài gen (bp) Trình tự mồi RNA1-RGSV- xuôi 5’-CAAACATCCTCCCAAGCATTI-3’... hai trình tự của Ninh Thuận và Bình Thuận giống nhất với trình tự VL2 của tỉnh Vĩnh Long (99,9%) và khác nhất với trình tự của Trung Quốc (CN- AF290947) Vì vậy chúng tôi lần lƣợt so sánh 2 trình tự trên với trình tự VL2 và trình tự của Trung Quốc nhằm phân tích mức độ đa dạng ở cấp độ nucleotit để đánh giá mức ý nghĩa của những sai khác ở trên Từ quả kết quả phân tích bằng phần mềm DNAsp thấy hai trình