Luận văn: TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM doc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  Nguyễn Ngọc Sơn TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  NGUYỄN NGỌC SƠN TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học (IBT) Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố. Tác giả Nguyễn Ngọc Sơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Trung Nam (Viện Công nghệ Sinh học) đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, KS. Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm đồng thời hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Nguyễn Như Cường (Viện Bảo vệ Thực vật) chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu đặc tính sinh học của virut gây bệnh và môi giới truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, các biện pháp quản lý tổng hợp cây trồng (ICM) trong sản xuất lúa” đã cung cấp mẫu bệnh và cộng tác trong quá trình tôi thực hiện công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, các thày cô giáo, và cán bộ trong Khoa đã truyền đạt kiến thức cũng như tạo điều kiện cho tôi được thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tác giả luận văn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN 2 MỤC LỤC 3 DANH MỤC T Ừ VIẾ T T Ắ T 5 DANH MỤC CÁC BẢNG 7 MỞ ĐẦU 9 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 11 1.1.1. Thế giới 11 1.1.2. Việt Nam 12 1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL 13 1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA 14 1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) 14 1.3.2. Các loại virut khác 16 1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV) 16 1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) 17 1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV) 18 1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU TRUYỀN BỆNH VL&LXL 19 1.4.1. Đặc điểm hình thái 19 1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại 19 1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL 20 1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT 21 1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử 21 1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR 22 1.6.3. Kỹ thuật PCR 23 1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli 24 1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen 24 1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) 25 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. VẬT LIỆU 26 2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM 27 2.2.1. Hóa chất 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 2.2.2. Thiết bị 27 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu 27 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm 27 2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu 28 2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa 28 2.3.4. Phản ứng RT-PCR 29 2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) 29 2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt 30 2.3.7. Colony-PCR 31 2.3.8. Tách chiết plasmit 32 2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn 32 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. THIẾT KẾ MỒI 34 3.2. TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV 34 3.2.1. RT-PCR 34 3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 37 3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR 37 3.2.4. Tách plasmit và cắt kiểm tra sự có mặt của gen 39 3.3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV 40 3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK. 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 DANH MỤC T Ừ VIẾ T T Ắ T µg microgram µl microlitre µm micrometer bp base pair cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên mã ngƣợc từ RNA thông tin) CS Cộng sự CLRRI Cuulong Delta Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long), http://www.clrri.org CP/ NCP Coat protein/ Nucleocapsid Protein (Protein vỏ) Đ/c Đối chứng ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long DEPC Diethyl pyroCarbonate DNA Deoxyribonucleic acid DPV Description of Plant Viruses (Miêu tả các virus thực vật), http://www.dpvweb.net EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễm dịch liên kết với enzym) g gram ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban quốc tế về phân loại virus). ICTVdB The Universal Virus Database of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Ngân hàng dữ liệu về virus của ICTV), http://www.ictvdb.rothamsted.ac.uk IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu Lúa quốc tế), http://www.irri.org Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 Kb Kilobase LB Luria và Bertani M Nồng độ mol/lit ml mililitre mm milimeter NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia về thông tin Công nghệ Sinh học), http://www.ncbi.nlm.nih.gov ng Nanogram nm Nanometer PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PEG Polyethylene glycon RdRp RNA dependent RNA polymerase (Enzym nhân bản RNA và tạo ra phân tử RNA) RGSV Rice grassy stunt virus (Virut vàng lùn lúa) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RRSV Rice ragged stunt virus (Virut lùn xoắn lá lúa) RSV Rice stripe virus RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên mã ngƣợc) RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virut tungro hình nhộng) RTSV Rice tungro spherical virus (Virut tungro hình cầu) RWSV Rice wilted stunt virus (Virut héo lùn lúa) TAE Tris - Acetate – EDTA Taq Thermus aquaticus v/p vòng/phút vcRNA viral complementary RNA (đoạn RNA bổ sung của virus) VL&LXL Vàng lùn, lùn xoắn lá vRNA viral RNA (đoạn RNA của virus) X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi 13 Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 15 Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV 16 Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 17 Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 18 Hình 1.6. Các giai đoạn phát triển của rầy nâu 19 Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ 26 Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT 30 Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn 1 và 4 của RGSV từ mẫu của tỉnh Bình Thuận bằng 2 cặp mồi RNA1-RGSV và RNA4-RGSV 35 Hình 3.2. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36 Hình 3.3. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36 Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân một số đoạn trong genome RGSV… 34 Bảng 3.2. Mã số đăng ký trên GenBank của các trình tự đã thu đƣợc 41 Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP- RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tƣơng ứng của các tỉnh ĐBSCL và thế giới (GenBank) 42 [...]... truyền của các chủng virut gây bệnh, góp phần vào việc đề ra những biện pháp đối phó kịp thời với dịch bệnh tại khu vực miền Trung Với những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài : Tách dòng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam 2 Mục tiêu Phân lập và so sánh trình tự nucleotit của một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV). .. đó khoảng 1000 – 5000 nucleotit và giải phóng độ vài chục nucleotit; (2) Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó; (3) Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotit Trình tự nhận biết của RE loại 2: Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotit đặc trƣng Các trình tự này thƣờng bao gồm 4-8 nucleotit (thƣờng là 4 hoặc 6) Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có... 1> Tách dòng, xác định trình tự một số đoạn trong genome của chủng RGSV 2> So sánh các trình tự nucleotit của gen CP- RGSV thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank để đánh giá độ tƣơng đồng về mặt di truyền giữa các chủng virut Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM. .. đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm i) Thu thập các trình tự gen quan tâm từ GenBank: Trƣớc khi thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho gen và các trình tự cần phân lập của các chủng virut nghiên cứu (Ví dụ: trình tự gen CP của RGSV), trình tự đoạn gen này đƣợc thu thập từ GenBank tại địa chỉ www.ncbi.nlm.nih.gov [63] Trình tự của các đoạn gen quan tâm có thể tìm kiếm thông qua tên của gen hoặc số. .. hạt bị đen và lép Triệu chứng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 14 tồn tại rất lâu sau khi phát bệnh [26] Lúa trƣởng thành khi bị nhiễm bệnh có lá bị vàng, bông bị nâu và hạt lép [43] 1.3 ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA 1.3.1 Virut vàng lùn lúa (RGSV) Virut vàng lùn lúa đƣợc phát hiện chủ yếu trên lúa Oryza sativa [25], [43] và có tên khoa... oC trong 02 tiếng, bất hoạt enzym ở 65oC trong 20 phút Thành phần phản ứng cắt băng enzym giơi han : DNA plasmit 2,5- 3 µg/µl ̀ ́ ̣ (5µl); Enzym 10u/µl (1µl); Dung dịch đệm 10X (1µl); H2O khử ion (3,5µl ) Tổng thể tích là 10µl 2.3.10 Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank Tách dòng và xác định trình tự gen: Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào trong vector tách. .. môi giới truyền bệnh virut nguy hiểm cho cây lúa nhƣ bệnh VL&LXL, bệnh héo lùn cây lúa ở Trung Quốc và bệnh vàng lá lúa ở vùng núi phía Bắc Việt Nam Theo thống kê của Dyck và Thomas (1979) thiệt hại do rầy nâu và bệnh vàng lụi ở Châu Á trong năm 1966 – 1975 lên tới hơn 300 triệu USD [22] Năm 1966, RGSV lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Nam và Đông Nam châu Á [43] Năm 1977, dạng héo lùn do RWSV xuất hiện... nhận định: Thành công lớn nhất là nông nghiệp và cây lúa vẫn luôn là cây lƣơng thực quan trọng bậc nhất của Việt Nam Tuy nhiên, sản lƣợng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bởi các bệnh virut do rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt là bệnh VL&LXL xảy ra trong thời gian gần đây Bệnh này do sự tổ hợp từ một đến bốn loại virut gây ra, gồm virut vàng lùn lúa (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV), virut. .. truyền bệnh của quần thể rầy nâu Tại Philippin, tỉ lệ rầy nâu có thể lấy và truyền RGSV thay đổi từ 3- 5% trƣớc năm 1977 [32] sang 0- 15% trong năm 1984 [26] Từ đây ta có thể giả thiết là một trong những khả năng của sự bùng phát của dịch RGSV tại miền Nam Việt Nam hiện nay là do sự thay đổi về khả năng truyền bệnh của rầy nâu: tỉ lệ rầy có khả năng lấy và truyền virut có thể đã tăng lên đáng kể trong quần... virut [43] RGSV có 6 đoạn RNA khác nhau, với tổng chiều dài bộ gen của RGSV là khoảng 25 kb (Hình 1.3) [21], [32] Cả 6 đoạn RNA đều lƣỡng tính (ambisense, mã hoá protein theo cả 2 chiều dƣơng và chiều bổ sung của phân tử RNA) và đều mang đoạn mã kết thúc dài 17 nucleotit tƣơng tự nhau Các đoạn mã kết thúc này có khả năng tự cuốn lại và tạo nên cấu trúc hình cán chảo Đoạn mã theo chiều bổ sung của đoạn . nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam . 2. Mục tiêu Phân lập và so sánh trình tự nucleotit của một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV). 3. Nội. SƠN TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi