Tách dòng và xác định trình tự gene glta mã hóa cho enzyme citrate synthase từ vi khuẩn e coli

Do đó mà vanillin không thể được cung cấp bằng cách chiết xuất từ quả vanilla tự nhiên hay tổng hợp hóa học, sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ sinh học đã được nghiên cứu như là một q

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG

Tên đề tài:

TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GENE gltA MÃ HOÁ CHO ENZYME CITRATE SYNTHASE TỪ VI KHUẨN Escherichia coli

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 - 2014

Thái Nguyên, năm 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG

Tên đề tài:

TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GENE gltA MÃ HOÁ CHO ENZYME CITRATE SYNTHASE TỪ VI KHUẨN Escherichia coli

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn: TS Dương Văn Cường

Thái Nguyên, năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ rất tận tình của thầy

cô và bạn bè và gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn:

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Cường giảng viên

Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm

Thái Nguyên, kĩ sư Ma Thị Trang cán bộ tại Bộ môn Sinh học Phân tử và Công

nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên người đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện để tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên, ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các cán bộ, anh chị làm việc tại Bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn

động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập,

nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên,ngày 02 tháng 6 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Hường

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Danh sách vùng trồng và diện tích vanillin chủ yếu trên thế giới 6

Bảng 2: Thành phần và tính chất dược liệu của vanillin 12

Bảng 3: Danh sách quốc gia sản xuất và sản lượng vanillin 14

Bảng 4: Tiền chất và vi sinh vật chủ yếu để tổng hợp vanillin vanillin từ axit ferulic trong chu trình TCA và con đường Glyoxylate 25

Bảng 5: Cặp mồi sử dụng nhân gene gltA 31

Bảng 6: Các thành phần của vector pTZ57R/T 34

Bảng 7: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 35

Bảng 8: Thành phần phản ứng PCR 40

Bảng 9: Thành phần phản ứng gắn nối 43

Bảng 10: Thành phần phản ứng cắt với NcoI 45

Bảng 11: Thành phần phản ứng cắt với SacI và HindIII 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Hình dạng và đặc điểm ba loài hoa Vanilla 4

Hình 2: Loài ong địa phương Melapona và loài chim giúp thụ phấn hoa 7

Hình 3 : Qúa trình thụ phấn nhân tạo cho hoa Vanilla planifolia 7

Hình 4: Các con đường trao đổi chất sinh tổng hợp vanillin 21

Hình 5: Con đường sản xuất vanillin từ axit ferulic nhờ gene fcs và ech 24

Hình 6: Sơ đồ biểu diễn tái chế của coenzym A (CoA) từ acetyl-CoA trong sản xuất Hình 7: Cấu trúc vector tách dòng 33

Hình 8: Quy trình tách dòng và xác định trình tự gene gltA từ vi khuẩn E coli 37

Hình 9: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 40

Hình 10: Hình ảnh tách chiết DNA tổng số của E coli 47

Hình 11: Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR 48

Hình 12: Sản phẩm PCR trước và sau khi tinh sạch 49

Hình 13: Kết quả biến nạp vi khuẩn đối chứng 49

Hình 14: Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào E coli DH5α khả biến 50

Hình 15: Kết quả điện di plasmid của các dòng khuẩn lạc đã chọn 50

Hình 16: Sản phẩm PCR plasmid của các dòng khuẩn lạc 51

Hình 17: Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme NcoI 52

Hình 18: Kết quả cắt kiểm tra đồng thời bằng hai enzyme SacI và HindIII 53

Hình 19: Kết quả so sánh trình tự gene của 3 dòng 55

Hình 20: Kết quả giải trình tự gene hiển thị trên máy tính của dòng 1 56

Hình 21: Trình tự nucleotide của gene gltA đã tách dòng 57

Hình 22: Kết quả dịch mã của gene gltA 58

Hình 23: Kết quả so sánh trình tự gene gltA đã tách dòng với trình tự gene đã được công bố trên ngân hàng gene 60

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Bp Base pair – cặp base nitơ

BLAST Basic Local Aligenment Search Tool cDNA Complementary DNA - DNA bổ sung

DNA Deoxyribonucleic axit

dNTP Deoxynucleotide Triphotphate

IPTG Isopropyl Thiogalactoside

Kb Kilo base –kilo base nitơ

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng

chuỗi trùng hợp

X -gal 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside

MỤC LỤC

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Nguồn gốc thực vật của vanilla 4

2.2 Đặc điểm thực vật loài Vanilla planifolia 6

2.3 Đặc điểm cấu trúc, thành phần của vanillin 8

2.4 Hoạt tính sinh học và tác dụng của vanillin 8

2.4.1 Hoạt tính sinh học của vanillin 8

2.4.2 Tác dụng của vanillin 11

2.5 Các phương pháp sản xuất vanillin 13

2.5.1 Vanillin chiết suất từ tự nhiên 13

2.5.2 Vanillin tổng hợp hóa học 14

2.5.3 Vanillin tổng hợp sinh học 16

2.5.3.1 Phương pháp sử dụng enzyme 16

2.5.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào 17

2.5.3.3 Ứng dụng công nghệ sinh học tổng hợp vanillin 18

2.6 Vi khuẩn E coli và gene gltA trong sinh tổng hợp vanillin 23

2.6.1 Vi khuẩn E coli 23

2.6.2 Vai trò của gene gltA trong sinh tổng hợp vanillin 24

2.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 26

2.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 26

2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 28

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

3.1 Vật liệu nghiên cứu 30

3.1.1 Vi khuẩn 30

3.1.2 Hóa chất 30

3.1.3 Vật liệu 31

3.1.3.1 Mồi phản ứng PCR 31

3.1.3.2 Vector tách dòng 32

3.1.4 Thiết bị 35

3.2 Địa điểm và thời gian thực tập 35

3.3 Nội dung nghiên cứu 36

3.4 Phương pháp nghiên cứu 37

3.4.1 Quy trình tách dòng và xác định trình tự gene gltA từ vi khuẩn E.coli 37

3.4.2 Phương pháp nuôi phục hồi vi khuẩn từ chủng gốc và phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến 38

3.4.3 Phương pháp thu cặn tế bào vi khuẩn 38

3.4.4 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 38

3.4.5 Phương pháp PCR 39

3.4.6 Điện di 40

3.4.7 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng thu nhận lại DNA từ gel 41

3.4.8 Phản ứng gắn nối trình tự gene đã khuếch đại vào vetor tách dòng pTZ57R/T 42

3.4.9 Phương pháp biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α khả biến bằng sốc nhiệt 43

3.4.10 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 44

3.4.11 Phương pháp cắt kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp với enzyme cắt giới hạn 45

3.4.12 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 46

3.4.13 Phương pháp so sánh trình tự gene gltA đã tách dòng với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gene thế giới 46

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn E coli 47

4.2 Kết quả nhân gene gltA từ vi khuẩn E coli DH5α bằng phương pháp PCR 47

4.3 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR từ gel điện di 48

4.4 Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối 49

4.5 Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn 50

4.5.1 Kết quả sàng lọc dòng bằng điện di so sánh kích thước plasmid 50

4.5.2 Kết quả chọn lọc dòng bằng PCR 51

4.5.3 Kết quả chọn lọc dòng plasmid bằng lập bản đồ giới hạn 52

4.5.3.1 Kết quả cắt kiểm tra độc lập bằng enzyme NcoI 52

4.5.3.2 Kết quả cắt kiểm tra đồng thời bằng hai enzyme SacI và HindIII 53

4.6 Kết quả giải trình tự gene 54

4.6.1 Kết quả so sánh trình tự gene giữa các dòng giải trình tự 54

4.6.2 Kết quả phân tích các thành phần thiết yếu của gene theo thiết kế insilico 56

4.6.3 Kết quả dịch mã của gene gltA 58

58

4.6.4 Kết quả so sánh trình tự gene đã xác định với trình tự gene đã công bố trên ngân hàng gene 58

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

5.1 Kết luận 61

5.2 Kiến nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

tên khoa học Vanilla planifolia chỉ đáp ứng được khoảng 1% nhu cầu thương mại, còn

lại chủ yếu là vanillin tổng hợp hóa học nhân tạo (Li and Rosazza 2000) Trên thực tế, giá thành của 1 kg vanillin tự nhiên dao động trong khoảng 1200 – 4000 USD, trong khi đó giá của 1 kg vanillin nhân tạo chỉ khoảng 15 USD (Lomascolo, Stentelaire et al 1999) Tuy nhiên, theo quy định của Mỹ và châu Âu thì vanillin tổng hợp hóa học không được coi như tương đương với vanillin tự nhiên (Muheim and Lerch 1999) Do

đó mà vanillin không thể được cung cấp bằng cách chiết xuất từ quả vanilla tự nhiên

hay tổng hợp hóa học, sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ sinh học đã được nghiên cứu như là một quá trình thay thế (Krings and Berger 1998)

Ứng dụng công nghệ sinh học để tổng hợp sản phẩm vanillin tự nhiên thay

thế đang được sự quan tâm ngày càng tăng trong những năm gần đây Meessen, Stentelaire et al 1999) Hơn nữa, quá trình sản xuất vanillin sinh học cho chi phí rẻ hơn do tận dụng được các phế phụ phẩm sẵn có rẻ tiền, tạo ra các sản phẩm phụ không mong muốn ít hơn và chủ yếu là được thực hiện điều kiện phản

(Lesage-ứng nhẹ nhàng, ít nguy hiểm, sử dụng ít năng lượng hơn và ít gây ô nhiễm môi

trường (Dal Bello 2013) Nghiên cứu sinh tổng hợp vanillin sử dụng các vi sinh vật

và enzyme chuyển hóa tiền chất như glucose, ligin, isoeugenol, eugenol, axit ferulic… được thực hiện và công bố (Lomascolo, Stentelaire et al 1999) Trong đó biến đổi sinh học để tạo vanillin từ axit ferulic được chú ý quan tâm và nghiên cứu

Một số vi sinh vật, chẳng hạn như chủng Amycolatopsis sp HR167 (Achterholt, Priefert et al 2000), Bacillus subtilis (Peng, Misawa et al 2003), Pseudomonas putida (Plaggenborg, Overhage et al 2003), Delftia acidovorans (Plaggenborg, Steinbuchel et al 2001), Sphingomonas (Masai, Harada et al 2002), Streptomyces setonii (Muheim and Lerch 1999)… đã được dùng để sản xuất vanillin từ axit

ferulic Tuy nhiên, vanillin được sản xuất từ các sinh vật trên cho năng suất thấp

hoặc sản phẩm tạo thành nhanh chóng bị chuyển đổi sang các sản phẩm khác hoặc

bị vi sinh vật sử dụng như một nguồn carbon cung cấp năng lượng cho các vi sinh

vật phát triển Các nghiên cứu gần đây cho thấy E coli là một hứa hẹn tiềm năng sản

xuất vanillin bởi vì nó có một quá trình lên men phát triển tốt và không có con đường suy

thoái vanillin (Priefert, Rabenhorst et al 2001) E coli là một loài vi khuẩn lành tính,

đặc điểm di truyền cũng như quy trình lên men đã được nghiên cứu kĩ

Quá trình tổng hợp vanillin từ axit ferulic ở trong vi khuẩn E coli nhờ enzyme feruloyl –CoA synthetase (mã hóa bởi gene fcs) và enoyl –CoA hydratase/ aldolase (mã hóa bởi gene ech) Đồng thời, các acetyl –CoA được tạo ra trong quá trình sản xuất vanillin từ axit ferulic có thể được chuyển đổi thành CoA bởi gene gltA mã hóa enzyme citrate synthase Như vậy sự khuếch đại của gltA trong E coli sẽ làm tăng chuyển đổi của

acetyl –CoA , mà có thể mang lại sự tăng cường sản xuất vanillin qua feruloyl –CoA

Ở Việt Nam, việc trồng trọt, tách chiết và sản xuất vanillin còn là một thách

thức lớn, để đáp ứng nhu cầu sử dụng chủ yếu phải nhập khẩu vanillin từ nước ngoài với số lượng lớn và giá thành cao đã gây khó khăn cho sản xuất và phát triển kinh tế Tuy nhiên với sự phát triển của công nghệ sinh học và khoa học kĩ thuật hiện nay hoàn toàn có thể chủ động nghiên cứu và sản xuất vanillin thay thế từ con

đường sinh tổng hợp mới Việc phân lập và tách dòng các gene mã hóa cho các

enzyme trong con đường sinh tổng hợp vanillin là cơ sở cho các nghiên cứu về các hợp chất thơm nói chung và cung cấp vật liệu nhằm tạo ra chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất vanillin có năng suất cao nói riêng Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn

trên, tôi thực hiện đề tài: “Tách dòng và xác định trình tự gene gltA mã hóa cho enzyme citrate synthase từ vi khuẩn E coli” nhằm mục đích cung cấp vật liệu

cho các nghiên cứu tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất vanillin, trước

mắt là tạo chủng E coli tái tổ hợp có khả năng sản xuất vanillin

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Tách dòng gene gltA của vi khuẩn E coli DH5α

- Xác định trình tự gene gltA đã tách dòng và so sánh với trình tự trên ngân

hàng gene (Gene bank)

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Nắm được các nguyên lí, kĩ thuật và các phương pháp thực hiện trong quá trình tách dòng gene

- Giải được trình tự gene đã tách dòng, phân tích và so sánh được với trình tự trên ngân hàng gene đã công bố

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã được học và tham gia nghiên cứu khoa học, cách xử lí và phân tích số liệu, cách trình bày một báo cáo

khoa học Quan trọng hơn là việc phân lập và tách dòng thành công gene gltA là cơ

sở cho các nghiên cứu tổng quát có liên quan về sản xuất vanillin sau này

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sản phẩm của quá trình tách dòng gene gltA sẽ cung cấp vật liệu và là cơ sở

cho các nghiên cứu nhằm đưa các gene mã hóa cho các enzyme tổng hợp vanillin vào vi sinh vật, tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sản xuất vanillin cao đáp ứng nhu cầu thị trường và hạ mức giá thành của sản phẩm

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc thực vật của vanilla

Vanilla là một loài phong lan leo nhiêt đới thuộc họ Orchidaceae Họ này bao

gồm 788 chi và 18500 loài, là một trong những họ lớn nhất của thực vật có hoa trên thế giới, chi chính của nó chứa hơn 110 loài (Mabberley, 1997) Trong tổng số 110 loài,

chỉ có 3 loài có giá trị kinh tế đó là Vanilla planifolia, Vanilla pompona và Vanilla tahitensis Tuy nhiên, Vanilla planifolia là loài có tiềm năng kinh tế lớn nhất bởi nó là

nguồn gốc chính của mùi hương vanillin - hương vị chủ yếu được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp, thực phẩm, mĩ phẩm và nước hoa

Hình 1: Hình dạng và đặc điểm ba loài hoa Vanilla

Lịch sử phát hiện của vanillin bắt đầu ở Trung Mỹ trong năm 1300 Ở Mexico người Aztec đã sử dụng chúng trong các đồ uống của họ được gọi là

“Tlixochitl” – được coi như là tổ tiên của chocolate Năm 1520, người Tây Ban Nha

đã mang nó đến châu Âu và từ đó nó trở nên phổ biến và được yêu thích hơn Loài

cây này đã được giới thiệu đến Blandford và trồng thành công bởi Charles Greville tại Paddington ở Anh vào năm 1807 Sau đó, Greville cung cấp cành hom đến Paris Antwerp, Bogor, Java để trồng Cây vanilla đã được đưa tới Reunion và từ Reunion

đến Mauritius năm 1827 Vanilla được phát hiện ở Cộng hòa Malagasy vào năm

1840 Mặc dù cây ra hoa, nhưng không đậu quả nếu không được côn trùng thụ phấn

tự nhiên Ngoài ra, hoa của lan vanilla rất chóng tàn, hoa nở chỉ kéo dài trong vòng

24 giờ, nên việc thụ phấn gặp rất nhiều khó khăn

Đến năm 1841, Edmond Albius một cựu nô lệ tại Reunion đã tìm ra một

phương pháp thụ phấn nhân tạo bằng cách sử dụng gậy tre vót nhọn để lấy phấn hoa, tách môi hoa đưa phấn vào tiếp xúc với bầu noãn Phương pháp thủ công này hiện vẫn được áp dụng tại những đồn điền trồng vanilla ở nhiều nơi trên thế giới Vào năm 1890, vanilla đã được trồng phổ biến ở Mauritius, Reunion, Seychelles, Madagascar, Tahiti, Jamaica và một số nước nhiệt đới khác (Cunningham,1920); (Ranadive 1994); (Reineccius,1994)

Kĩ thuật trồng vanilla đã được giới thiệu năm 1846 ở Java bởi Teysmann, tại Seychelles năm 1866, ở Tahiti vào năm 1848 bởi Hamelin, ở quần đảo Comoro vào năm 1893, ở Tây Ấn và Guadelope vào năm 1938 Hiện nay, vanilla được trồng nhiều tại những đồn điền ở Châu Phi như Reunion, Mauritius, Madagascar, Seychelles, Tanzania; ở Châu Á như Java, Indonesia; ở Nam Mỹ như Brazil; ở các đảo trong khu vực Caribbea như Jamaica

Bảng 1: Danh sách vùng trồng và diện tích vanillin chủ yếu trên thế giới

(Nguồn FAO năm 2009)

2.2 Đặc điểm thực vật loài Vanilla planifolia

Vanilla planifolia loài cây thuộc loại dây leo, thân mọng, mọc bám nhờ rễ

cuốn vào cây chống, đường kính thân 1 - 2 cm, có thể mọc dài đến 10 - 15 m, màu

lục xậm, chia thành những đốt, khoảng cách giữa 2 đốt từ 5 - 15 cm Rễ dài, màu

trắng nhạt, khí sinh, đường kính chừng 2 mm, mọc đối diện với lá Lá phẳng, mọng,

mọc cách, hình thuôn - mũi giáo, dài 8 - 25 cm x 2-8 cm, mũi lá tuy nhọn nhưng

cùn, phiến có nhiều gân song song nổi rõ, cuống ngắn Hoa lớn có mùi thơm, màu

xanh hoặc vàng nhạt, đường kính khoảng 10 cm, rất chóng tàn Cuống hoa rất ngắn

Bầu noãn hình trụ cong, dài khoảng 4 - 7 cm, rộng 1 - 1,5 cm Hai cánh hoa phía

trên dạng tương tự như cánh đài, cánh hoa phía dưới biến dạng thành cánh môi hình

loa kèn Quả dạng nang, hình trụ dài 10 - 25 cm, đường kính 5 - 15 mm, khi khô có

mùi thơm, chứa nhiều hạt li ti nhỏ cỡ 0.3 mm, hạt được phóng thích khi quả nứt làm

đôi Hoa thường chỉ trổ hoa mỗi năm một đợt, tại Mexico trong các tháng 4 - 5 và

các đảo Châu Phi như Madagascar, Reunion vào các tháng 11 đến tháng giêng năm

sau Tại Mexico và Trung Mỹ, Vanilla planifolia được thụ phấn tự nhiên do loài ong

điạ phương Melapona và cũng có thể do loài chim hút mật hummingbird đặc biệt trong

vùng Tỷ lệ thụ phấn tự nhiên chỉ khoảng 1 % (Ranadive et al 1994)

Hình 2: Loài ong địa phương Melapona và loài chim giúp thụ phấn hoa

Hình 3 : Qúa trình thụ phấn nhân tạo cho hoa Vanilla planifolia

2.3 Đặc điểm cấu trúc, thành phần của vanillin

4-hydroxy-m-anisaldehyde methylprotocatechuic aldehyde 3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde hydroxy-4-methoxy-3-benzaldehyde

Tính chất vật lí

- Tinh thể màu trắng hoặc hơi vàng, có hương thơm

- Nóng chảy ở 81oC

- Áp suất hơi nước là 0,33Pa

- Nồng độ bão hòa không khí 0,00029 %

- Độ hòa tan trong nước ở 25oC là 18 mg/m3

2.4 Hoạt tính sinh học và tác dụng của vanillin

2.4.1 Hoạt tính sinh học của vanillin

- Hoạt tính chống ung thư và đột biến gene

Bức xạ tia cực tím có tác động mạnh tới sinh vật trên trái đất từ vi khuẩn đến con người, có khả năng gây đột biến DNA, lão hóa tế bào Có 3 loại thành phần bước sóng tia cực tím khác nhau: UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) và UVC (200–280 nm) Trong đó, bức xạ UVB gây tổn thương lớn nhất tới DNA là tác nhân gây đột biến, gây ung thư các tế bào biểu bì nghiêm trọng khi tế bào tiếp xúc trực tiếp (Lee, Yoon et al 2009)

Nghiên cứu ban đầu chỉ ra vanillin có hoạt tính chống đột biến trong tế bào V79 và chống ung thư trong tế bào của chuột (Imanishi, Sasaki et al 1990) Nghiên

cứu trong ống nghiệm (in vitro) ghi nhận khi có vanillin ở nồng độ không gây độc

hại cho tế bào, có khả năng ngăn chặn sự xâm nhập và di chuyển của tế bào ung thư, đồng thời ức chế hoạt tính của men MMP-9 do tế bào ung thư bài tiết ra Vanillin đã được chứng minh làm giảm số lượng các khối u đại tràng trong mô chuột thử nghiệm (Akagi, Hirose et al 1995), tăng cường sửa chữa đột biến và có chức năng như một chất chống tế bào HT -29 gây ung thư đại tràng ở người (Ho, Yazan et al 2009)

Theo báo cáo nghiên cứu của (Sasaki, Ohta et al 1990); (Keshava, Keshava

et al 1998) đã chỉ ra rằng việc bổ sung vanillin ở các hàm lượng nhất định có khả năng ngăn chặn những sai lệch nhiễm sắc thể do tia cực tím và tia X gây ra (van den Heuvel, Fraaije et al.) Vanillin ức chế đột biến ở locus CD59 trên nhiễm sắc thể 11 của người (Gustafson, Franz et al 2000) và hoạt động như một chất ức chế protein kinase (DNA-PK), đóng vai trò sửa chữa sai hỏng DNA (Durant and Karran 2003) Bromovanin, một dẫn xuất của vanillin có thể được sử dụng trong việc phát triển các phương pháp điều trị ung thư mới

- Hoạt tính chống oxy hóa

(Kumar, Priyadarsini et al 2003) vanilin có hoạt chất chống oxy hóa và hoạt tính loại bỏ các gốc tự do gây hại cho tế bào thần kinh, khả năng giảm một số thiệt hại của quá trình oxy hóa xảy ra trong não của bệnh nhân bị bệnh Alzheimer's và

đặc biệt là ngăn chặn sự hình thành của một hợp chất gọi là peroxynitrite (PON)

Peroxynitrite đóng một vai trò trong các bệnh thoái hóa khác của não như bệnh Parkinson, vanillin cũng ngăn chặn phản ứng oxy hóa dihydrorho damine 123 Mặc

dù nghiên cứu trong lĩnh vực này vẫn còn trong giai đoạn thực nghiệm, nhưng nó có thể hứa hẹn trong tương lai cho con người đối phó với các bệnh suy nhược thần kinh Năm 2004, Fladby và Fizgerald ghi nhận vanilla có thể giúp chẩn đoán bệnh Alzheimer's do người bệnh thường không ngửi được mùi

- Hoạt tính chống bệnh thiếu máu hồng cầu hình lưỡi liềm

Thiếu máu hồng cầu hình liềm là một căn bệnh di truyền nghiêm trọng liên quan đến máu Bình thường các hồng cầu có dạng hình đĩa, tròn di chuyển một cách

dễ dàng qua các mạch máu Ở người bị bệnh thiếu máu hồng cầu liềm thì các tế bào hồng cầu chứa hemoglobin hình dạng bất thường (dạng S) làm các tế bào có hình dạng lưỡi liềm Các tế bào hình liềm di chuyển qua các mạch máu khó khăn và có khuynh hướng đóng cục lại gây tắc nghẽn mạch máu Nguyên nhân là do sự thay

thế A thành T ở giữa bộ ba mã hóa thứ 6 trên ADN quy định tổng hợp protein

β-hemoglobin dẫn đến bộ ba mã hóa axit amin glutamic thành axit amin valin làm biến đổi HbA thành HbS

Vanillin được chứng minh có hiệu quả chống thiếu máu hồng cầu hình lưỡi liềm thông qua liên kết cộng hóa trị của nhóm aldehyde với hemoglobin trong các tế bào máu, làm thay đổi các thuộc tính của HbS (Abraham, Mehanna et al 1991) Tuy nhiên, vanillin được cung cấp qua đường miệng không có tác dụng điều trị vì

nó nhanh chóng bị phân hủy trong đường tiêu hóa Để khắc phục vấn đề này, một vanillin dược phẩm MX-1520 đã được tổng hợp, tác dụng sinh học của loại thuốc này qua nghiên cứu cho thấy cao hơn 30 lần so với vanillin tự nhiên, hiệu quả giảm thiếu máu hồng cầu hình liềm gấp 5 lần so với vanillin tự nhiên (Zhang, Li et al 2004)

- Vanillin giúp cải thiện tình trạng hô hấp của trẻ sinh non

Trung tâm nghiên cứu y học quốc gia của trường đại học ở Strasbourg (Pháp) qua các nghiên cứu đã nêu nhận xét: hương vani có thể giúp cải thiện đáng kể khả năng hô hấp của các trẻ sinh non Chứng ngừng thở nhất thời là một trong những rối loạn đáng ngại nhất của trẻ sinh thiếu tháng Thử nghiệm trên 14 trẻ sinh non mắc chứng ngừng thở nhất thời bằng cách đặt trong lồng kính được xông hương vani nhiều giờ, kết quả làm giảm đến 45% ở những trường hợp nặng nhất

- Hoạt tính quan trọng khác

Nghiên cứu khoa học của (Sun, Sacalis et al 2001) đã tìm thấy các chiết xuất

alcoholic từ lá và cành của Vanilli fragrans được tách phân đoạn với ethyl acetate,

butanol và nước cho thấy có hoạt tính sinh học là khả năng gây độc hại với ấu trùng muỗi Các loại dầu dễ bay hơi chiết xuất bằng cách chưng cất hơi nước từ bốn loài

thực vật là củ nghệ (Curcuma longa), chanh (Citrus hystrix), sả (Cymbopogon winterianus) và húng quế lông (Ocimum americanum) với việc bổ sung 5% vanillin

được đánh giá có hiệu quả tốt chống lại các loài muỗi Aedes aegypti, Anopheles dirus và Culex quinquefasciatus trong điều kiện phòng kéo dài trong 8 giờ Dầu

chiết xuất từ chanh và 5% vanillin cho hiệu quả đến 3 giờ Nghiên cứu cũng chỉ

ra hiệu quả của thuốc chống muỗi phổ biến bằng hóa chất DEET (N,

N-diethyl-3-methylbenzamide) hiện nay cũng chỉ chống muỗi trong 8 giờ với Aedes aegypti và Culex quinquefasciatus, trong 6 giờ chống lại Anopheles dirusb (Tawatsin, Wratten et al 2001)

Hoạt tính quan trọng khác của vanillin là chống đau răng, chống độc cho gan, chống viêm, kháng virus, giảm đau, thuốc gây mê, thuốc sát trùng, giảm căng thẳng, thuốc lợi tiểu, nhuận tràng (Sinha, Verma et al 2007)

2.4.2 Tác dụng của vanillin

- Vanillin trong công nghệ thực phẩm và mĩ phẩm

Vanillin là hương vị được dùng khá phổ biến trong công nghiệp thực phẩm (như đồ uống nước giải khát, bánh kẹo, kem, bánh ngọt ) trong mĩ phẩm (như xà phòng, nước hoa, sữa tắm, phấn thơm…) Trong thực phẩm vanillin đã được công nhận có khả năng kháng khuẩn và chống quá trình oxy hóa (Burri, Graf et al 1989) Vanillin và đồng phân của nó điều khiển trực tiếp hoạt động chống lại các vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm (Fitzgerald, Stratford et al 2005) Vanillin được dùng

để ức chế sự phát triển của các loại nấm mốc, nấm men khác nhau trong hệ thống

nước ép hoa quả, thạch trái cây (López-Malo, Alzamora et al 1995);(Cerrutti, ALZAMORA et al 1997); (LÓPez-Malo, Alzamora et al 1998) và nước giải khát (Fitzgerald, Stratford et al 2004) Hoạt tính kháng nấm của vanillin chống lại nấm

men Candida albicans và Cryptococcus neoformans đã được Boonchird and Flegel

nghiên cứu Trong đó vị trí trên vòng benzene được xem là cấu trúc quan trọng nhất

có hoạt tính kháng nấm (Fitzgerald, Stratford et al 2005) Vai trò của vanillin như

một tác nhân kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Escherichia coli, Lactobacillus plantarum và Listeria innocua (Fitzgerald et al 2004) Dẫn xuất của vanillin đã

được đánh giá khả năng là tác nhân chống lại một số chủng vi khuẩn gram dương và

gram âm như Pseudoalcaligenes Pseudomona, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Staphylococcus subfava và Bacillus megaterium (Vaghasiya, Nair et al 2004)

- Vanillin trong công nghệ dược phẩm

Vanillin là một nguyên liệu quan trọng trong ngành công nghiệp dược phẩm

để sản xuất thuốc như aldomet, dopamine, papaverine, L- DOPA và chất chống tạo

bọt Vanillin tổng hợp được sử dụng để sản xuất một số sản phẩm gia dụng, chất khử mùi, nước hoa xịt phòng, chất đánh bóng sàn nhà và thuốc diệt cỏ (Converti, Aliakbarian et al 2010)

Các thành phần có trong vanillin có trách nhiệm về tính chất dược liệu trên

được hiển thị theo bảng sau:

Bảng 2: Thành phần và tính chất dược liệu của vanillin (Anuradha, Shyamala

et al 2013)

Hoạt tính sinh học của vanillin Thành phần chịu trách nhiệm

Chống đau răng Annisyl alcohol, catechin, axit ferulic

Chống ung thư (Antitumour)

Benzyldehyde, catechol, axit salicylic, syringaldehyde, axit vanillic, catechin, axit ferulic, cinnamic, ethyl ester, p-cresol Chống bệnh thiếu máu (Antiedemic) Catechin, coumarin, syringaldehyde

Chống bướu cổ (Antiestrogenic) Axit ferulic

Kháng nội độc tố (Antihaepatotoxic) Catechin, axit ferulic, axit protoatechic

Chống viêm (Anti- inflammatory) Catechin, axit ferulic, n-hentriacontane,

syringaldehyde, umbelliferone, axit vanillic Chống cảm cúm (Antilipoperoxidant) Catechin

Chống đột biến (Antimutagenic) Anisaldehyde, axit ferulic, vanillin

Chống ung thư (Antineoplastic) Axit ferulic

Chống oxy hóa (Antioxidant )

Catechin, catechol, axit ferulic, axit protocatechuic, axit salicylic, syringaldehyde, axit vanillic, vanillin Antiperoxidant axit protocatechuic

Chất gây mê (Anesthetic ) Benzaldehyde, benzyl-alcohol

Kích thích hệ thống miễn dịch

(Immunostimulant) Belzaldehyde, catechin, axit ferulic

Ngăn chặn độc hại cho gan

(Hepatoprotective ) Catechin, axit ferulic

2.5 Các phương pháp sản xuất vanillin

2.5.1 Vanillin chiết suất từ tự nhiên

Vanillin là một trong những hương liệu được ưa chuộng, sử dụng rộng rãi

nhất trên thế giới được chiết xuất chủ yếu từ 3 loài hoa phong lan Vanilla Planifolia, Vanilla tahitiensis và Vanilla pompon

Sau 2 - 3 năm trồng vanilla bắt đầu ra hoa, việc thu hái, chế biến vanilla bắt

đầu từ 6 - 9 tháng sau khi hoa thụ phấn cho quả xanh và bắt đầu chín Ở giai đoạn

quả xanh vanillin không có mùi vị đặc trưng (Walton, Mayer et al 2003) Do đó vanillin phải trải qua quá trình xử lí và chế biến để thay đổi tính chất vật lí và hoạt tính sinh hóa tạo thuộc tính mong muốn (Ranadive 1994) Bên trong quả, hàng ngàn hạt nhỏ li ti nằm ủ trong vách pha trộn với hỗn hợp đường, chất béo, acid amin và hỗn hợp phenolic Lúc này các enzyme bắt đầu hoạt động, phóng thích các hợp chất phenolic và các hợp chất này di chuyển ra gần lớp vỏ bên ngoài

Giai đoạn đầu của quy trình chế biến là “làm chết quả (killing)” để quả ngưng sử dụng đường và acid amin, đồng thời “gây thương tổn” cho tế bào quả để phóng thích các hợp chất phenolic Hai mục đích này được thực hiện bằng cách phơi quả dưới nắng gắt hay nhúng quả nhanh vào nước nóng hoặc hấp quả bằng hơi nước Tế bào vỏ quả bị hư hại tạo sự hoạt động cho các enzyme polyphenoloxidase, làm vỏ chuyển từ màu xanh sang nâu Sau đó là giai đoạn quả được phơi nắng vào ban ngày đến thật nóng rồi bọc vải hoặc chăn vào ban đêm để toát mồ hôi (sweating) Giai đoạn này kéo dài nhiều ngày (có nơi như Madagascar từ 7-10 ngày)

để tạo sự phóng thích vanillin và các hợp chất phenolic khỏi sự kết nối với các phân

tử đường Sức nóng và tia nắng làm giảm độ ẩm của quả, ngăn chặn sự hoạt động của vi khuẩn bên ngoài vỏ, đồng thời tạo sắc tố và mùi thơm do phản ứng giữa

đường và acid amin bên trong quả Từ 3 - 5 kg quả tươi, sẽ thu được 1 kg quả chế

biến Trong giai đoạn sau cùng của việc chế biến, quả được phân loại, làm khô trong vài tuần, lưu trữ và ủ để hương vị gia tăng Toàn bộ thời gian chế biến có thể

kéo dài khoảng 4 - 5 tháng với vanilla Bourbon và 6 - 7 tháng với vanilla Mexico (Anuradha, Shyamala et al 2013) Điều này lí giải tại sao sản xuất vanillin tự nhiên

là rất tốn kém Các quả khô thu được sau đó có thể được sử dụng trực tiếp hoặc tiếp tục chiết tách vanillin ở dạng khác nhau Việc chiết tách vanillin tự nhiên này phải tuân thủ các điều kiện kĩ thuật nghiêm ngặt đòi hỏi yêu cầu cao

Bảng 3: Danh sách quốc gia sản xuất và sản lượng vanillin

Vanillin chiết xuất từ tự nhiên chỉ đáp ứng được 1 % nhu cầu thị trường do

đó các nhà hóa học đã tìm cách tổng hợp vanillin từ những nguồn nguyên liệu khác

để thay thế Vanillin tổng hợp hóa học với mục đích tạo được hợp chất mong muốn,

chi phí thấp và có thể điều khiển quá trình tổng hợp theo yêu cầu của con người, sản phẩm của quá trình này chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp nước hoa, mĩ phẩm và dược phẩm

Theo (Taber, Patel et al 2007) có thể tổng hợp vanillin với lượng nhỏ từ hydroxybenzaldehyde theo sơ đồ chuyển hóa sau:

4-Vanillin đầu tiên được phân lập như một chất tinh khiết vào năm 1858 bởi nhà khoa học người Anh Theodore Gobley

Năm 1874, hai nhà hóa học Đức Ferdinand Tiemann và Wilheim Haarmann

đã tìm ra cấu trúc hóa học của vanillin và tổng hợp được vanillin từ coniferin, một

glucoside của isoeugenol lấy từ vỏ thông (Li and Frost 1998) Sản lượng vanillin thu được khoảng 350g/kg nhựa thông, quá trình này rất tốn kém, sản phẩm vanillin thu được bị lẫn tạp nhiều Do đó, ngày nay phương pháp này không được áp dụng

để sản xuất vanillin thương mại

Năm 1878, Karl Reimer nghiên cứu tổng hợp vanillin từ guaiacol Trong đó guaiacol phản ứng với axit glyoxylic bằng cách thay thế ái lực điện tử của vòng thơm tạo acid vanillyl sau đó được chuyển đổi 4-hydroxy-3-methoxyphenylglyoxylic axit

để tạo vanillin bởi phản ứng oxy hóa khử carboxyl

Từ cuối thế kỷ 19, vanillin bán tổng hợp từ eugenol đã được bán trên thị trường Phương pháp này sử dụng thành phần chính là eugenol được tinh chết từ dầu đinh hương (Hocking 1997)

Vanillin tổng hợp hóa học có nhiều công dụng trong công nghiệp thực phẩm để tạo thêm hương vị, công nghiệp mỹ phẩm (nước hoa, kem dưỡng da, che mùi vị khó chịu trong dược phẩm, đồng thời làm chất trung gian trong việc tổng hợp nhiều hóa chất khác (khoảng 13 % tổng sản lượng vanillin được sử dụng làm nguyên liệu để tạo những hóa chất khác) Ngoài ra vanillin còn dùng làm “phẩm màu” trên các tấm mỏng dùng trong phương pháp sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography= TLC)

2.5.3 Vanillin tổng hợp sinh học

2.5.3.1 Phương pháp sử dụng enzyme

Phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học sử dụng các enzyme có chứa β-

glucosidase xúc tác quá trình thủy phân của vanillin từ glucovanillin và axit glucovanillic được xem như một quá trình thay thế cho quá trình tách chiết thông thường (Dignum, Kerler et al 2002); (Ruiz-Teran, Perez-Amador et al 2001) Enzyme cũng có thể được sử dụng để tạo vanillin từ các nguyên liệu thực vật có nguồn gốc khác thông qua biến đổi sinh học Ví dụ, (KAMODA, HABU et al 1989) đã nghiên cứu việc sử dụng các lignostilbene –α, β –dioxygenase phân lập từ

Pseudomonas sp TMY1009 xúc tác giải phóng oxy hóa của vanillin từ stilbenes,

chất thường thấy trong vỏ cây gỗ Enzyme lipoxygenase của đậu tương cũng được

sử dụng để sản xuất vanillin từ các este của rượu conifer Nghiên cứu của (van den Heuvel, Fraaije et al 2001) đã sử dụng penicillium flavoenzyme, vanillyl alcohol oxidase để chuyển đổi sinh học vanillylaminen (có thể đạt được bởi quá trình thủy phân của capsaicin) và creosol (một thành phần lớn của creosote thu được từ gỗ hoặc sưởi ấm nhựa than đá) để hình thành vanilin Như vậy, mặc dù vanillin tạo ra

có số lượng thấp nhưng cách tiếp cận sản xuất vanillin sử dụng enzyme có thể chấp nhận được (Walton, Mayer et al 2003)

2.5.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Việc nuôi cấy mô tế bào trong sản xuất hương liệu có ưu điểm không bị giới hạn bởi vị trí địa lí hay thời tiết, khối lượng tế bào có thể được tăng nhanh dẫn đến tổng hợp các chất mong muốn có thể được phân lập từ tế bào dễ dàng Một số nghiên cứu khám phá khả năng trao đổi của thực vật để tổng hợp vanillin trong nuôi

cấy tế bào và các cơ quan, chẳng hạn như lá và thân của Vanilla planifolia và gần

đây hơn trong các tế bào của Capsicum frutescens (Rao and Ravishankar 2000);

(Dignum, Kerler et al 2001) Tuy nhiên, cũng có một số vấn đề khi sản xuất các hợp chất thơm là sản lượng thu được thấp, phương pháp sản xuất này tốn kém bởi chi phí cho các phương tiện sản xuất và quá trình xử lí tinh chế các hợp chất dùng cho thực phẩm cao (Hrazdina 2006) Chiến lược áp dụng cho việc nuôi cấy tế bào thực vật như sử dụng các chất kích thích sinh trưởng hoặc hoocmone ức chế con

đường cạnh tranh, điều chỉnh điều kiện môi trường nuôi cấy, sử dụng nhựa hấp phụ

hoặc than hoạt tính để tăng mức độ tổng hợp vanillin (Walton, Mayer et al 2003)

Những nghiên cứu của (Knuth and Sahai 1991) tìm ra bản chất và nồng độ của tiền chất thêm vào môi trường ảnh hưởng đến sản xuất hương vị vanillin trong

quá trình nuôi cấy V fragrans Trong đó, phenylalanine và axit ferulic ít tăng cường

sản xuất vanillin, trong khi rượu vanillyl dẫn đến một sự gia tăng đáng kể trong sự tích lũy vanillin (Havkin-Frenkel and Belanger 2007) báo cáo vanilla nuôi cấy mô thực vật với tiền thân như 3,4- dihydroxybenzaldehyde dẫn đến sự hấp thu hoàn toàn các hợp chất và chuyển đổi sang rượu vanillyl

Nhà khoa học (Westcott, Cheetham et al 1993) đã đưa ra một quy trình để sản xuất hương vị vanillin từ axit ferulic sử dụng rễ khí sinh của cây vanilla, than hoạt tính được sử dụng trong quá trình hoạt động như một sản phẩm hấp phụ vanillin sản xuất được, do đó làm giảm sự ức chế sản phẩm phụ Các mô rễ có thể

được tái sử dụng nhiều lần, nhưng hoạt động của nó giảm dần khi tái sử dụng Sử

dụng rễ khí cung cấp với axit ferulic, vanillin được sản xuất 5-10 lần nhanh hơn tổng hợp bình thường Mặc dù các nghiên cứu đã chứng minh khả năng để tích lũy vanillin trong nuôi cấy tế bào hoặc mô cơ quan thành công nhưng sản lượng vanillin thấp, sự mất ổn định tế bào, tốc độ tăng trưởng chậm và quy mô nuôi cấy phức tạp

Do đó cho đến nay, không có hệ thống nuôi cấy tế bào hoặc mô cơ quan để sản xuất vanillin thương mại

2.5.3.3 Ứng dụng công nghệ sinh học để tổng hợp vanillin

Vi sinh vật với tốc độ tăng trưởng nhanh chóng và dễ chịu tác động di truyền phân tử là mục tiêu lý tưởng hơn cho công nghệ sinh học và có thể được lựa chọn cho khả năng phát triển trên một tiền chất giả định của vanillin như một nguồn carbon duy nhất Một số lượng các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm và nấm men đã

được sử dụng để sản xuất vanillin từ chất nền khác nhau chẳng hạn như lignin,

eugenol, isoeugenol và axit ferulic, axit vanillic, phenol stilbenes, axit amin thơm và glucose đã được nghiên cứu và công bố Sản phẩm thu được thông qua tổng hợp sinh học từ chất nền tự nhiên được coi là an toàn và được coi là tự nhiên (Serra, Fuganti et al.) Tuy nhiên, một vấn đề lớn của vi sinh vật sản xuất vanillin là quá trình oxy hóa và chuyến hóa sản phẩm cuối cùng để tạo axit vanillic, vanillyl rượu

Cả hai phản ứng dẫn đến giảm nồng độ vanillin Để ngăn chặn các phản ứng phụ và

từ đó nâng cao năng suất vanillin, tối ưu hóa quá trình (bổ sung các nhựa hấp phụ hoặc chất chống oxy hóa) hoặc ứng dụng kỹ thuật di truyền (làm bất hoạt các enzyme có liên quan chẳng hạn như vanillin dehydrogenase) đã được áp dụng Danh sách một số vi sinh vật được sử dụng để sản xuất vanillin từ chất nền khác nhau được nghiên cứuvà thể hiện ở bảng sau:

Bảng 4: Tiền chất và vi sinh vật chủ yếu để tổng hợp vanillin (Kaur and

Chakraborty 2013)

Hợp chất Vi sinh vật sử dụng

Năng suất (g/l)

0,3

(Overhage, Steinbuchel et al 2003)

Amycolatopsis sp

(Overhage, Steinbuchel et al 2006)

Amycolatopsis sp HR167;

(Plaggenborg, Overhage et al 2006)

et al 2010)

(Torre, De Faveri et

al 2004)

CGMCC1115

5 (Zhang, Xu et al 2006)

Lactic acid bacteria - (Bloem, Bertrand et

al 2007)

(Overhage, Steinbuchel et al 2006)

2010)

Glucose

E.coli KL7/ pKL5.97A (ATCC98859) and Neurospora crassa

Các con đường trao đổi để sinh tổng hợp vanillin từ các nguồn cơ chất như lignin, eugenol, isoeugenol và axit ferulic, axit vanillic, phenol stilbenes, axit amin thơm và glucose…đã đạt được kết quả ban đầu, đưa đến tiềm năng sử dụng phế phụ phẩm để tổng hợp chất thơm mong muốn đáp ứng nhu cầu của con người

Hình 4: Các con đường trao đổi sinh tổng hợp vanillin

- Biến đổi sinh học của acid ferulic (4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid) để tạo vanillin

Biến đổi axit ferulic để tổng hợp vanillin thông qua các tuyến đường của vi khuẩn là một trong những chuyển dạng sinh học được nghiên cứu mạnh mẽ nhất và cũng là quá trình hứa hẹn có tiềm năng nhất cho sản xuất thương mại vanillin Axit phenolic này được coi là tiền chất hấp dẫn đối với vi sinh vật tổng hợp vanillin Axit ferulic là một trong những axit hydroxycinnamates thơm, thành phần thực vật được

tạo ra từ quá trình chuyển hóa phenylpropanoid cùng với axit dihydroferulic, là một thành phần của lignocelluloses có khả năng tạo độ cứng cho vách tế bào thông qua liên kết chéo giữa lignin và polysaccharides (Ou and Kwok 2004) Thành phần của axit phenolic này chủ yếu được tìm thấy trong thành tế bào của cây một lá mầm (monocotyledons) (Mathew and Abraham 2004) Axit ferulic được tìm thấy nhiều trong vỏ ngô (31 g/kg), cám ngô (30 g/kg), củ cải đường (5-10 g/kg), lúa mì (6,6 g/kg), hạt lúa mạch và ngũ cốc (1,4 g/kg) Axit ferulic có thể được tách bằng cách

xử lý với kiềm mạnh hoặc thủy phân enzyme cinnamoyl esterases hoặc axit ferulic esterases cùng với glycosyl hydrolases trong thành tế bào thực vật (Priefert, Rabenhorst et al 2001) Axit ferulic được đánh giá là sự lựa chọn tốt nhất cho việc sản xuất vanillin với nhãn "tự nhiên" (Noor Hasyierah, Mohamed Zulkali et al 2008)

Tài liệu trình bày ở trang 5, các biến đổi sinh học của axit ferulic để tạo

vanillin được nghiên cứu rộng rãi ở một số vi sinh vật, bao gồm cả vi khuẩn gram âm

thuộc chi Pseudomonas, xạ khuẩn của các chi Amycolatopsis và Streptomyces, vi khuẩn gram dương như Bacillus subtilis và Rhodococcus sp, các loại nấm như

Pycnoporus cinnabarinu, Polyporous versicolor và Fomes fomentarius, trong tảo Spirulina platensis, Haematococcus pluvialis Trong hầu hết các vi sinh vật nghiên

cứu cho đến nay, vanillin được sản xuất như chất chuyển hóa thoáng qua với một hàm lượng nhỏ và nhanh chóng bị chuyển đổi sang sản phẩm khác hoặc bị các vi sinh vật sử dụng như là nguồn carbon Để khắc phục nhược điểm này bằng cách tối ưu hóa các quy trình, bổ sung nhựa hấp phụ đã được nghiên cứu và cho kết quả tốt Vi khuẩn

thuộc chi Pseudomonas sp được phát hiện là ứng cử viên sáng cho khả năng chuyển

đổi axit ferulic như nguồn carbon duy nhất để tạo thành vanillin Tuy nhiên, axit

ferulic đã nhanh chóng bị oxy hóa hoặc chuyển hóa thành axit vanillic hay rượu

vanillyl (Kaur and Chakraborty 2013)

Nghiên cứu để nâng cao năng suất vanillin trong P fluorescens AN103 được dựa trên sự rối loạn trong gen vdh (Martínez-Cuesta, Payne et al 2005) Bắt nguồn

cùng nguyên liệu đầu vào là axit ferulic, nhưng nghiên cứu sự chuyển đổi thành

vanillin sử dụng trên hai chủng Streptomyces và Amycolatopsis đã được báo cáo là cao nhất Năm 1997, Rabenhorst và Hopp mô tả sự cô lập của một Amycolatopsis

sp HR167 (DSM9991 hoặc DSM9992 ) có khả năng chuyển đổi 19,92 g/l axit ferulic tạo 11,5 g/l vanillin trong 32 giờ Một năm sau, Müller và cộng sự (1998)

công bố một quá trình chuyển đổi sinh học của axit ferulic để tích lũy vanillin từ

chủng S setonii ATCC39116 là 13,9 g/l vanillin (sản lượng phân tử đạt 75% ) từ

22,5 g/l axit ferulic sau 17 giờ (Muheim and Lerch 1999) đã cho thấy năng suất cao hợp lý của vanillin (nồng độ lên đến 6,4 g/l với sản lượng phân tử 68%) từ chuyển

đổi axit ferulic bởi Streptomyces setonii Gần đây, nghiên cứu của (Hua, Ma et al

2007) sản xuất vanillin hàm lượng cao đã đạt được trong hàng loạt biến đổi sinh học

của axit ferulic bởi Streptomyces sp V-1 Khi bổ sung 8 % nhựa DM11 vào hệ

thống chuyển dạng sinh học, 45 g/l axit ferulic có thể được thêm vào để tổng hợp 19,2 g/l vanillin với sản lượng phân tử của 55% thu được trong vòng 55 giờ nuôi cấy Lesage - Meessen và cộng sự (1996) mô tả một quá trình gồm hai bước để sản xuất vanillin từ bột củ cải đường có nguồn gốc từ axit ferulic, bằng cách sử dụng hai

loại nấm sợi Trong chuyển dạng đầu tiên, Aspergilllus niger chuyển hóa axit

ferulic để tạo axit vanillic Trong bước thứ hai, axit vanillic sản xuất đã giảm xuống

chuyển dạng thành vanillin bởi Pycnoporus cinnabarinus…Mặc dù, sản lượng

vanillin thu được từ các loại nấm sợi cao, nhưng sự phát triển của hệ sợi cũng như bào tử của nó làm cho môi trường có độ nhớt cao, gây khó khăn cho việc xử lí và chế biến của quá trình sản xuất , làm giảm năng suất cuối cùng và làm gia tăng chi phí chế biến (Barghini, Di Gioia et al 2007)

2.6 Vi khuẩn E coli và gene gltA trong sinh tổng hợp vanillin

2.6.1 Vi khuẩn E coli

E coli là một vi khuẩn Gram âm, hình que dài khoảng 2,5µm, có roi

(flagella) và bộ gene gồm 4639221 cặp base mã hóa ít nhất cho 4406 gene Giống

như tất cả các vi khuẩn Gram âm khác, E coli không có màng nhân và nhiễm sắc

thể là một phân tử sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí

khởi đầu sao chép (origin of replication) E coli là loài được chọn trong các phòng

thí nghiệm về sinh học phân tử bởi vì dễ nuôi cấy, bộ gene đơn giản và đã được giải trình tự khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8 giờ nuôi cấy ở điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp, khả năng tạo sản phẩm gene cao

từ 50 mg/l đến 500 mg/l Các tế bào E coli có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid

DNA và chọn lọc các DNA plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay

các phức hợp màu như Xgal –β –galactosidase

Trong số các con đường sinh tổng hợp khác nhau được thử nghiệm trên các

loại vi sinh vật khác nhau, con đường tổng hợp vanilin từ axit ferulic nhờ E coli

hiện đang được chú ý nhất bởi các lý do:

+ Do vanillin chiết xuất tự nhiên không đủ để cung cấp nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên, vanillin tổng hợp hóa học thì lại không được coi là tự nhiên, các sản phẩm tạo ra từ biến đổi sinh học được chấp nhận như sản phẩm tự nhiên thay thế

+ Axit ferulic chiếm tỉ lệ cao trong mô thực vật, do đó là nguồn cơ chất phổ biến, rẻ tiền tận dụng từ phụ phẩm nông nghiệp

+ Ở các loại vật chủ khác, vanillin sau khi tạo thành nhanh chóng bị thoái hóa thành các sản phẩm khác hoặc là bị chính vật chủ tái sử dụng như một nguồn

cacbon E coli là vật chủ không mang các con đường chuyển hóa này, do đó sản xuất vanillin nhờ E coli không bị yếu điểm này

+ E coli là loài vi khuẩn lành tính, đặc điểm di truyền cũng như quy trình lên

men đã được nghiên cứu kĩ, khả năng tổng hợp vanilin từ axit ferulic ngày càng

được nâng cao nhờ quá trình tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng

2.6.2 Vai trò của gene gltA trong sinh tổng hợp vanillin

Gene gltA mã hóa cho enzyme citrate synthase trong E coli đã được nghiên

cứu cấu trúc gene và giải trình tự gene bởi (Ner, Bhayana et al 1983) Trình tự gene

này chứa 3265 bp được giới hạn bởi hai enzyme cắt giới hạn HindIII và EcoRI, mã

hóa cho một chuỗi polypeptide chứa 427 axit amin

Khoa học kĩ thuật phát triển, những hiểu biết về con đường trao đổi chất cũng như việc xác định và mô tả đặc điểm của các gene tham gia vào sản xuất

vanillin ngày càng được nghiên cứu kĩ Sản xuất vanillin nhờ gene ech và fcs phân lập từ Pseudomonas flourescens, Amycolaptosis sp HR167 (Achterholt, Priefert et

al 2000), Delftia acidovorans (Yoon, Li et al 2005), Pseudomonas putida (Yamada, Okada et al 2008) được thiết kế trong vi khuẩn E coli tái tổ hợp đã được

nghiên cứu và đạt những thành công nhất định

Hình 5: Con đường sản xuất vanillin từ axit ferulic nhờ gene fcs và ech

Trong sơ đồ biểu diễn sự tái chế của coenzymeA (CoA) từ aceltyl –CoA

trong sản xuất vanillin từ axit ferulic liên quan đến chu trình TCA và glyoxylate ở E coli (Hình 6) các gene gltA mã hóa cho enzyme citrate synthase xúc tác phản ứng

đầu tiên của chu trình chuyển hóa acetyl- CoA để tạo thành CoA Axit ferulic

chuyển hóa để tổng hợp vanillin nhờ enzyme feruloyl –CoA synthetase (mã hóa bởi

gen fcs) và enoyl -CoA hydratase aldolase (mã hóa bởi gen ech) được thể hiện như hình dưới đây:

Hình 6: Sơ đồ biểu diễn tái chế của coenzym A (CoA) từ acetyl - CoA trong sản xuất vanillin từ axit ferulic trong chu trình TCA và con đường Glyoxylate

(Lee, Yoon et al 2009)

Các acetyl - CoA được tạo ra trong quá trình sản xuất vanillin từ axit ferulic

có thể được chuyển đổi thành CoA bởi enzyme citrate synthase do gene gltA mã hóa Nghiên cứu điều tra vai trò khuếch đại gene gltA trong plasmid tái tổ hợp pTAHEF có chứa gene ech và fcs trong E coli DH5α đã được chứng minh làm tăng

quá trình chuyển đổi axit ferulic thành vanilin Trong đó, nồng độ axit ferulic bổ

sung ban đầu là 3 g /l, sản lượng vanillin thu được chủng E coli chứa pTAHEF- gltA là 1,98 g/l trong 48 giờ, cao hơn đáng kể so với 0,91 g/l vanillin sản xuất bởi pTAHEF Năng suất chuyển đổi phân tử axit ferulic đạt được trong pTAHEF - gltA

là 89,4 %, cao hơn so với 54,4 % của pTAHEF (Lee, Yoon et al 2009)

Ngoài chu trình TCA trên thì còn có một con đường nữa để chuyển CoA thành CoA đó là con đường vòng glycoxylate nơi mà isocitrate chuyển thành glycoxylate và malate mà không thông qua α-ketoglutarate Con đường vòng glucoxylate ngắn hơn chu trình TCA vì thế có thể sẽ giảm bớt tiêu hao năng lượng, giúp chuyển hóa axit ferulic nhanh hơn Để thực hiện con đường này cần có sự

acetyl-tham gia của hai enzyme isocitrate lyase và malate synthase mã hóa bởi gene aceA, aceB Sự phiên mã của operon aceAB bị ức chế bởi gene điều hòa iclR Do vậy để

sử dụng tối đa acetyl - CoA theo con đường này cần giải ức chế hai gen aceA và aceB bằng cách xóa bỏ gene iclR, đồng thời xóa bỏ gene icdA bởi vì isocitrate có ái lực với enzyme isocitrate dehydrogenase (icdA) cao hơn enzyme isocitrate lyase (aceA) Nghiên cứu chủng E coli BW25113 kết hợp ảnh hưởng của khuếch đại gene gltA với việc xóa bỏ gene icdA làm tăng đáng kể sản xuất vanillin Năng suất chuyển đổi tạo vanillin của E coli BW25113 chứa pTAHEF đột biến gene icdA tăng từ 55,9 % đến 91,5 % của E coli BW25113 chứa pTAHEF đột biến gene icdA

và có sự khuếch đại gene gltA (Lee, Yoon et al 2009)

2.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Ứng dụng công nghệ sinh học đang được sự quan tâm ngày càng tăng trong

những năm gần đây Những nghiên cứu về quá trình chuyển hóa để tổng hợp vanillin từ glucose, axit ferulic, eugenol, isoeugenol, ligin…nhờ vi sinh vật ngày càng được nghiên cứu nhiều và sâu hơn Cách tiếp cận của kĩ thuật di truyền đưa các gene tham gia vào con đường ferulate dị hóa trong sinh vật chủ đã tạo ra những biến đổi lớn có thể cải thiện năng suất tổng hợp vanillin Các gene ferulic dị hóa phân

lập chủ yếu từ các chủng Pseudomonas fluorescens BF13 và Amycolatopsis sp HR104,

từ Penicillium simplicissimum và Delftia acidovorans đã được nhân bản trong các tế bào tái tổ hợp của vi khuẩn E coli (Dal Bello 2013)

Converti, Faveri và cộng sự (2003) qua nghiên cứu đã đề xuất chủng E coli

JM109 tái tổ hợp chứa plasmid pBB1 được chèn các gen ferulic dị hóa tách dòng từ

P fluorescens BF13 được xem như một ứng cử viên thích hợp cho việc chuyển đổi

axit ferulic để tạo vanillin Plasmid tái tổ hợp pBB1 được tạo ra bằng cách nhân một

đoạn gene fcs và ech mã hóa cho enzyme hydratase/ aldolase và feruloyl -CoA

synthetase từ một chủng đột biến gene vdh của P fluorescens BF13 dưới sự kiểm

soát của promoter Pfer, được chèn vào vector có số lượng bản sao thấp pJB3Tc19 Tuy vậy, việc sử dụng các plasmid có số bản sao thấp gây sụt giảm nhanh chóng

sản phẩm cuối cùng của chủng vi khuẩn E coli tái tổ hợp do sự bất ổn định của gen

đột biến sản xuất vanillin (Barghini, Di Gioia et al 2007) (Di Gioia, Luziatelli et al

2011) Để phát triển một dòng tái tổ hợp ổn định hơn, E coli JM109 được thiết kế bằng cách nhân bản gene ech và gene fcs của P fluorescens BF13 vào một vector

pFR12 với một replicon cảm nhiệt, được thiết kế để tích hợp nhiễm sắc thể vào gene

lacZ của E coli (Luziatelli and Di Matteo 2008);(Converti, Aliakbarian et al 2010)

Một chủng vi khuẩn E coli XL1 –Blue (pSKechE/Hfcs) tái tổ hợp chứa plasmid gắn gene fcs và ech của chủng Pseudomonas sp HR199 dưới sự kiểm soát

của promoter LacZ có thể chuyển đổi axit ferulic thành vanillin ở các cấp độ phân

tử nhỏ (Overhage, Steinbuchel et al 2003) Tương tự, các gene fcs và ech phân lập

từ Amycolatopsis sp HR167 được biểu hiện trong chủng E coli tái tổ hợp có khả

năng chuyển hóa tạo vanillin (Achterholt, Priefert et al 2000)

Hai plasmid tái tổ hợp pDAHEF và pDDAEF mang gene fcs và ech của chủng Amycolatopsis sp HR104 và Delftia acidovorans được đưa vào E coli để sử dụng axit

ferulic như một nguồn cacbon tổng hợp vanillin Sản lượng vanillin đạt được 160 mg/l với pDAHEF và 10 mg/l với pDDAEF (Yoon, Li et al 2005) Trong nghiên cứu tiếp

theo Yoon và cộng sự (2005) cho thấy sản lượng của vanillin cao hơn đạt được với E coli tái tổ hợp thiết kế bằng cách nhân bản gene fcs và ech từ Amycolatopsis sp với sự

cảm ứng của isopropylthiogalactoside (IPTG) và promoter trc

Sản xuất vanillin từ axit ferulic trong tế bào E coli DH5α chứa plasmid pTAHEF chèn gene fcs và ech tách từ Amycolatopsis sp HR104 đã được thử

nghiệm (Yoon, Lee et al 2007)

Nghiên cứu E coli DH5α có chứa plasmid tái tổ hợp pTAHEF - gltA cho thấy

sự khuếch đại của gene gltA (mã hóa enzyme citrat synthase) cần thiết cho việc chuyển

đổi của acetyl –CoA thành CoA giúp chuyển đổi 3 g/l axit ferulic để tích lũy 1,98 g/l

vanillin trong 48 giờ nuôi Trong nghiên cứu này, tác giả đã chỉ ra rằng việc loại bỏ

gene icdA mã hóa cho enzyme isocitrate dehydrogenase của chu kỳ TCA tăng cường

việc chuyển đổi của acetyl –CoA để tạo CoA so với chu kỳ TCA thông thường Sản

xuất vanillin bởi các đột biến mới của E coli BW25113 mang plasmid pTAHEF cùng với việc loại bỏ gene icdA cho hiệu suất cao hơn 2,6 lần Nghiên cứu tác dụng đồng

thời của việc khuếch đại gene gltA và cắt bỏ gene icdA được quan sát thêm với bổ sung

nhựa XAD - 2 làm giảm độc tính của vanillin Kết quả vanillin thu được ở nồng độ 5,14 g/l và sản lượng phân tử 86,6 % thu hồi trong 24 giờ của dịch nuôi cấy Cho đến

nay, đây là quá trình sản xuất vanillin từ axit ferulic sử dụng E coli tái tổ hợp có hiệu

suất cao nhất (Lee, Yoon et al 2009)

Trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn E coli để sản xuất vanillin, gene chịu

trách nhiệm làm giảm eugenol hoặc isoeugenol cũng được phân lập và nhân dòng trong các chủng tái tổ hợp Năm 2003, Overhage và cộng sự đã đề xuất đề xuất một quá trình

biến đổi sinh học của eugenol để tổng hợp vanillin bằng chủng E coli tái tổ hợp gồm

hai bước: bước đầu tiên, eugenol được chuyển đổi thành 8,6 g/l axit ferulic bởi quá

trình trao đổi chất của E coli XL1- Blue (pSKvaomPcalAmcalB) mang một plasmid lai (pSKvaomPcalAmcalB), được tạo ra bằng cách nhân dòng gene vaoA từ Penicillium simplicissimum CBS 17090 dưới sự kiểm soát của promoter lac, cùng với các gene calA và calB từ chủng Pseudomonas sp HR199 Trong bước thứ hai, sản phẩm axit ferulic đã được chuyển đổi để tổng hợp vanillin do E coli XL1 -Blue

(pSKechE/ HFCs)

Chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) tái tổ hợp không có hoạt động xuống cấp

vanillin được giới thiệu bởi một plasmid được thiết kế chứa gene isoeugenol

monooxygenase của chủng Pseudomonas putida IE27 dưới sự kiểm soát của T7 promoter Các tế bào E coli BL21(DE3) này có thể chuyển đổi 230 mM isoeugenol để

tổng hợp 28,3 g /l vanillin với sản lượng phân tử 81% sau 6 giờ nuôi ở 20°C (Yamada

et al 2008) Như vậy, từ những nghiên cứu ban đầu tạo cơ sở để hoàn thiện và nâng cao năng xuất trong điều hướng tác động thông qua quá trình trao đổi và chuyển hóa

của vi khuẩn E coli sẽ tiếp tục đạt được nhiều thành tựu hơn nữa góp phần vào sản

xuất hợp chất thơm trong tương lai

2.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu ban đầu tại Việt Nam, cho thấy không có tài liệu của tác giả Việt

Nam nào ghi về chi vanilla, tuy nhiên, tính đến thời điểm hiện tại Vanilla shenzhenica

là loài lan vanilla thứ năm được ghi nhận ở Việt Nam sau 4 loài vanilla không lá

(Vanilla aphylla), vanilla trắng (Vanilla albida), Vanilla trung bộ (Vanilla annamica)

và Vanilla pierre (Vanilla pierrei) được GS Phạm Hoàng Hộ ghi nhận (1999) Loài

vanilla được mô tả về phương diện thực vật nhưng không ghi những giá trị cũng như

ứng dụng kinh tế của nó

Trong những năm gần đây, loài cây vanillia đã được trồng thử nghiệm một số tỉnh ở Việt Nam đã cho những kết quả bước đầu khả quan Nghiên cứu nhân giống vô tính cây vanilla bằng phương pháp nuôi cấy mô của Vũ Ngọc Phượng, Lê Hoàn Hảo, Thái Du Xuân trong phòng CNTBTV, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cung cấp nguyên liệu ban đầu cho quá trình trồng trọt loài cây này ở nước ta, mặc dù điều kiện khí hậu chưa thích hợp nhưng cũng mở ra hướng mới mang lại hiệu quả kinh tế trong tương lai

Ở Việt Nam nhu cầu về vanillin sử dụng chủ yếu là nhập khẩu vanillin từ các

nước trên thế giới, do đó giá thành nhập khẩu cao khiến cho quá trình sản xuất có chi phí cao Hiện nay chưa có nghiên cứu tổng hợp vanillin nhân tạo đặc biệt là quá trình tổng hợp vanillin từ các nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp như trên thế giới Các nghiên cứu về phân lập chủng, tách dòng và xác định trình tự các gene liên quan đến con đường trao đổi chuyển hóa vanillin vẫn còn là hướng đi mới hứa hẹn nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trong tương lai Trong đề tài này, việc nghiên cứu tách dòng

thành công gene gltA cùng với công nghệ DNA tái tổ hợp sẽ là cơ sở ban đầu để tìm ra

phương pháp nhằm sản xuất vanillin nhân tạo tại Việt Nam

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Vi khuẩn

Chủng vi khuẩn E coli DH5α sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi

phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam